DE69933186T2 - Methode zur Reinigung und Manipulation von Nukleinsäure mittels paramagnetischen Partikeln - Google Patents

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Zugang zu Zellkomponenten wie Nucleinsäuren ist für verschiedenste molekularbiologische Methodiken unumgänglich. Solche Methodiken umfassen Nucleinsäuresequenzierung, den direkten Nachweis bestimmter Nucleinsäuresequenzen durch Nucleinsäurehybridisierung und Nucleinsäuresequenz-Amplifikationstechniken.
  • Die Präparation und Aufreinigung hochreiner doppelsträngiger (ds) Plasmid-DNA, einzelsträngiger (ss) Phagen-DNA, chromosomaler DNA, agarosegelgereinigter DNA-Fragmente und RNA ist von wesentlicher Bedeutung in der Molekularbiologie. Idealerweise sollte ein Verfahren zur Aufreinigung von Nucleinsäuren einfach, schnell sein und – wenn überhaupt – wenig zusätzliche Probenmanipulation erfordern. Nucleinsäuren, die durch solch ein Verfahren geliefert werden, sollten sofort für eine Transformation, Restriktionsanalyse, Ligation oder Sequenzierung verfügbar sein. Ein Verfahren mit all diesen Merkmalen wäre äußerst attraktiv bei der Automatisierung der Nucleinsäure-Probenpräparation, ein Ziel von Forschungs- und Diagnoselaboren.
  • Typischerweise ist die Präparation von Plasmid-DNA aus rohen Alkoholpräzipitaten langwierig, häufig unter Anwendung von CsCl-Gradienten, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie oder RNAse, Proteinase K und wiederholten Alkoholpräzipitationsschritten. Diese Verfahren erfordern außerdem eine umfangreiche nachgeschaltete Probenaufbereitung, um CsCl und andere Salze, Ethidiumbromid und Alkohol zu entfernen. Ähnliche Argumente gelten bei Verwendung eines dieser Verfahren zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten: Ein weiteres Problem bei diesen Verfahren ist, dass kleine, negativ geladene Zellkomponenten zusammen mit der DNA aufgereinigt werden können. Folglich kann die DNA einen unerwünschten Kontaminationsgrad aufweisen.
  • Nucleinsäuren lassen sich auch mittels Festphasen auf reinigen. Herkömmliche Festphasen-Extraktionstechniken haben Oberflächen verwendet, die entweder (1) wegen einer Oberflächengestaltung zum Zwecke einer leichten Wiedergewinnung der Nucleinsäuremoleküle bei Elution nicht in der Lage sind, ausreichende Mengen an Nucleinsäuremolekülen anzuziehen und festzuhalten, oder (2) Nucleinsäuren übermäßig an die Oberfläche binden und dadurch eine Wiedergewinnung der Nucleinsäuremoleküle bei Elution behindern. Herkömmliche Metalloberflächen, die diese Probleme verursachen, wenn sie bei der Festphasenextraktion eingesetzt werden, umfassen bestimmte Siliciumdioxid-Oberflächen wie Glas und Celite. Eine ausreichende Bindung von Nucleinsäuren an diese Arten von Oberflächen kann nur durch Verwendung hoher Konzentrationen an Chaotropen oder Alkoholen erreicht werden, die gewöhnlich toxisch, ätzend und/oder teuer sind. Zum Beispiel ist bekannt, dass DNA in Gegenwart von Chaotropen an zerstoßenes Glaspulver und an Glasfaserfilter bindet. Die chaotropen Ionen werden typischerweise mit Alkohol weggewaschen, und die DNAs werden mit salzarmen Lösungen oder Wasser eluiert. Wesentlich: RNA und Proteine binden nicht. Jedoch ist ein erheblicher Nachteil bei der Verwendung von zerstoßenem Glaspulver, dass seine Bindungskapazität gering ist. Zudem leiden Glasspulver oft an inkonsistenter Ausbeute, Inkompatibilität mit Boratpuffern und einer Neigung, lange DNAs zu nicken. Ebenso bieten Glasfaserfilter eine porenfreie Oberfläche mit geringer DNA-Bindungskapazität. Andere Siliciumdioxide wie Kieselgel und Glasperlen sind nicht für DNA-Bindung und Wiedergewinnung geeignet. Zur Zeit ist die Festphase der Wahl für die Festphasenextraktion von DNA Celite, wie man es z.B. in Prep-A-GeneTM von Bio-Rad Laboratories findet. Wie bei den zerstoßenen Glaspulvern sind für eine ausreichende Bindung der DNA an das Celite hohe Konzentrationen an Chaotropen erforderlich.
  • Jedoch hat in einigen Fällen die Hydratation von Siliciumdioxid-Substanzen zu einem Wegfall der Notwendigkeit solch hoher Chaotropenkonzentrationen für die Elution gebundener DNA von den Siliciumdioxid-Substanzen geführt, wie in Quellen wie der EP 0 512 767 , EP 0 585 660 , US 5,674,997 und EP 0 832 897 gelehrt wird.
  • Es gibt zahlreiche Protokolle für die Aufreinigung von DNA. Zum Beispiel offenbart US-Patent 4,923,978 ein Verfahren zur Aufreinigung von DNA, bei dem eine Lösung von Protein und DNA über ein hydroxyliertes Trägermaterial geleitet wird und das Protein gebunden und die DNA eluiert wird. US-Patent 4,935,342 offenbart Aufreinigung von DNA durch selektive Bindung von DNA an Anionenaustauscher und anschließende Elution. US-Patent 4,946,952 offenbart DNA-Isolation durch Präzipitation mit wasserlöslichen Ketonen. Ein DNA-Aufreinigungsverfahren unter Verwendung von Chaotropen und dialysierter DNA ist in US-Patent 4,900,677 offenbart.
  • Diatomeen sind ebenfalls zur Aufreinigung von Nucleinsäuren eingesetzt worden, wie durch US-Patent Nr. 5,234,809 von Boom et al. und US-Patent Nr. 5,075,430 von Little et al. dokumentiert ist.
  • Noch eine weitere Technik, die zur Aufreinigung von Nucleinsäuren Verwendung findet, ist die Bindung an speziell angepasste paramagnetische Partikel. Beispiele für solche Techniken sind in Quellen wie der europäischen Patentschrift EP 0 446 260 B1 und US-Patent 5,512,439 (Hornes et al.) zu finden, die monodisperse, superparamagnetische Partikel mit einer Standardabweichung des Durchmessers von weniger als 5% beschreiben. Jedes Partikel trägt mehrere Moleküle eines Oligonucleotids, wobei jedes Oligonucleotid einen Abschnitt aufweist, der als Sonde für ein Ziel-Nucleinsäuremolekül von Interesse dient.
  • US-Patent Nr. 4,672,040 (Josephson) und US-Patent Nr. 4,695,393 (Whitehead et al.) beschreiben magnetisch reagierende Partikel für die Verwendung in Systemen zur Trennung bestimmter Moleküle. Die Partikel besitzen einen Metalloxidkern, der von einem stabilen Silikonüberzug umgeben ist, an den organische und/oder biologische Moleküle gekoppelt werden können.
  • EP 0 818 461 beschreibt ein Verfahren zur Isolation von Ribonucleinsäure, das das Lösen einer biologischen Probe in einer sauren Lösung, die ein Lithiumsalz und ein chaotropes Mittel enthält, und das Inkontaktbringen der gelösten biologischen Probe mit komplexen Partikeln, die aus einem nucleinsäurebindenden Träger wie Siliciumdioxid und einem paramagnetischen Material bestehen, beinhaltet.
  • US-Patent Nr. 3,970,518 (Giaever) beschreibt ein Verfahren zur Absonderung und Abtrennung einer ausgewählten Zellpopulation aus einer gemischten Zellpopulation. Das Verfahren verwendet kleine magnetische Partikel, die mit einem Antikörper beschichtet sind, um Zellpopulationen zu selektieren.
  • US-Patent Nr. 4,141,687 (Forrest et al.) beschreibt ein automatisches Gerät und ein Verfahren zum Testen flüssiger Proben. Das Gerät verwendet ein partikuläres Material mit einem daran gebundenen Reagenz. Das partikuläre Material ist magnetisch, und das Reagenz ist eine Substanz, die an einer Reaktion in dem Reaktionsgemisch teilnimmt.
  • US-Patent Nr. 4,230,685 (Senyei et al.) beschreibt ein Verfahren zur magnetischen Trennung von Zellen. Das Verfahren verwendet magnetisch reagierende Mikrokugeln, die mit Staphylokokken-Protein A beschichtet sind, an die ein Antikörper gebunden ist.
  • US-Patent Nr. 4,774,265 (Ugelstad et al.) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerpartikel. Die Partikel sind kompakte oder poröse Polymerpartikel, die mit einer Eisensalzlösung behandelt wurden.
  • US-Patent Nr. 5,232,782 (Charmot) beschreibt magnetisierbare "Kern-Hülle"-Mikrokugeln, die einen Kern aus einem magnetisierbaren Füllstoff und eine Hülle aus quervernetztem Organopolysiloxan aufweisen.
  • US-Patent Nr. 5,395,688 (Wang et al.) beschreibt magnetisch reagierende fluoreszierende Polymerpartikel, die einen Polymerkern aufweisen, der gleichmäßig mit einer Polymerschicht überzogen ist, welche magnetisch reagierendes Metalloxid enthält.
  • US-Patent Nr. 5,491,068 und US-Patent Nr. 5,695,946 (Benjamin et al.) beschreiben ein Testverfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Bakterien mittels magnetischer Perlen mit darauf immobilisierten spezifischen Antikörpern.
  • US-Patent Nr. 5,536,644 (Ullman et al.) beschreibt ein Partikeltrennverfahren. Das Verfahren verwendet magnetische Partikel mit funktionellen Oberflächengruppen und wahlweise einer zusätzlichen Oberflächenbeschichtung.
  • Die europäische Patentschrift EP 0 444 120 B1 (Hornes et al.) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Ziel-RNA oder -DNA. Das Verfahren verwendet magnetische Partikel, die eine einzelsträngige 5'-gebundene DNA-Sonde tragen, welche die Ziel-RNA oder -DNA binden kann.
  • Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/18731 (Deggerdal et al.) beschreibt ein Verfahren zur Isolation von Nucleinsäure aus einer Probe mittels eines partikulären festen Trägermaterials und eines anionischen Detergens.
  • US-Patent Nr. 5,705,628 (Hawkins) beschreibt ein Verfahren zur DNA-Aufreinigung und -Isolation mittels magnetischer Partikel, die mit funktionellen Gruppen beschichtete Oberflächen besitzen.
  • EP 0 818 461 offenbart die Verwendung von paramagnetischem Material, das in ein Kieselgelpartikel eingekapselt ist, zur reversiblen Bindung eines Nucleinsäuremoleküls in einer sauren Lösung.
  • US 5,523,231 offenbart die Ausfällung von Nucleinsäuremolekülen aus einer Lösung durch Aggregation um paramagnetische Perlen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Um eine effektivere und effizientere Technik zur Aufreinigung und Manipulation von Nucleinsäuren bereitzustellen, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur reversiblen elektrostatischen Bindung eines Nucleinsäuremoleküls mittels einer Zusammensetzung, die ein paramagnetisches Partikel in einer sauren Umgebung umfasst. Das paramagnetische Partikel besteht ausschließlich aus paramagnetischem Material.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die beim Verfahren der Erfindung verwendete Stoffzusammensetzung ist ein paramagnetisches Partikel in einer sauren Lösung, das heißt einer Lösung, die einen pH von weniger als etwa 7,0 aufweist. Das paramagnetische Partikel besteht ausschließlich aus paramagnetischem Material.
  • Die Anmelder stellten fest, dass paramagnetische Partikel, wenn sie sich in einer sauren Umgebung befinden, Nucleinsäuremoleküle reversibel binden, ohne dass ein anionisches Detergens erforderlich ist, wie dies in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/18731 gelehrt wird. Ohne sich an eine bestimmte Theorie binden zu wollen, glauben die Anmelder, dass eine saure Umgebung die elektropositive Natur des Eisenanteils der Moleküle erhöht und somit die Bindung der Moleküle an den elektronegativen Phosphatanteil des Nucleinsäuremoleküls verstärkt.
  • Wie hier verwendet, meint der Ausdruck "paramagnetische Partikel" Partikel, denen ein magnetisches Moment verliehen werden kann, wenn sie in einem magnetischen Feld angeordnet werden. Daher sind solche paramagnetischen Partikel, wenn sie sich in einem solchen magnetischen Feld befinden, unter der Wirkung eines solchen Feldes beweglich. Eine solche Bewegung lässt sich zur Bewegung gebundener Nucleinsäuremoleküle für verschiedene Aspekte eines Probenaufarbeitungsprotokolls oder andere Manipulationen nutzen. Folglich können die an die paramagnetischen Partikel gebundenen Nucleinsäuremoleküle durch Anwendung magnetischer Kraft mit minimalem direkten Kontakt in verschiedene Bereiche bewegt werden, um verschiedenen Reagenzien und/oder Bedingungen ausgesetzt zu werden.
  • Die Anmelder haben festgestellt, dass paramagnetische Partikel, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, keine komplizierten Strukturen sein müssen. So sind in der vorliegenden Erfindung Eisenpartikel brauchbar, und das Eisen kann ein Eisenoxid von einer Form wie Eisenhydroxid und Eisen(II,III)-oxid sein, das in einer wässerigen Umgebung geringe Löslichkeit besitzt. Andere Eisenpartikel wie Eisensulfid und Eisenchlorid können ebenfalls für die Bindung und Extraktion von Nucleinsäuren unter Anwendung der hier beschriebenen Bedingungen geeignet sein.
  • Ebenso ist die Gestalt der paramagnetischen Partikel für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Somit können die paramagnetischen Partikel von unterschiedlicher Gestalt sein, einschließlich zum Beispiel Kugeln, Würfeln, ovaler, kapselförmiger, tablettenförmiger Formen, unbestimmter Zufallsformen etc., und können von gleichförmiger oder ungleichförmiger Gestalt sein. Unabhängig von der Gestalt eines paramagnetischen Partikels liegt sein Durchmesser an seiner breitesten Stelle gewöhnlich im Bereich von etwa 0,5 μm bis etwa 20 μm.
  • Die saure Umgebung, in der das paramagnetische Partikel wirksam reversibel Nucleinsäuremoleküle bindet, kann durch eine Vielzahl verschiedener Mittel bereitgestellt werden. Zum Beispiel können die paramagnetischen Partikel einer sauren Lösung zugesetzt werden, oder es kann eine saure Lösung den Partikeln zugesetzt werden. Alternativ kann eine Lösung oder Umgebung, in der sich die paramagnetischen Partikel befinden, durch Zugabe eines Säuerungsmittels wie Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure und Zitronensäure angesäuert werden.
  • Sofern die Umgebung, in der sich die paramagnetischen Partikel befinden, einen pH von weniger als etwa 7,0 aufweist, werden die Partikel Nucleinsäuremoleküle reversibel binden: Überdies haben die Anmelder festgestellt, dass die Bindungskapazität der paramagnetischen Partikel für Nucleinsäure mit sinkendem pH steigt.
  • Es wird angenommen, dass die saure Umgebung für die in der vorliegenden Erfindung brauchbaren paramagnetischen Partikel die Notwendigkeit von Detergenzien, wie sie in einigen Quellen wie der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/18731 gelehrt wird, beseitigt. Ohne sich an eine bestimmte Theorie binden zu wollen, glaubt der Anmelder, dass Detergenzien für die vorliegende Erfindung nicht erforderlich sind, da die saure Lösung der vorliegenden Erfindung die Bindung elektropositiver paramagnetischer Partikel an elektronegative Nucleinsäuremoleküle fördert, indem diese gegenüber anderen Substanzen in einer Probe wie etwa Inhibitoren der Nucleinsäurehybridisierung und -amplifikation bevorzugt werden. Dagegen dient die Verwendung von Detergenzien, wie sie in Quellen wie der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/18731 gelehrt wird, zur Solubilisierung von Nucleinsäurehybridisierungs- und -amplifikationsinhibitoren, damit solche Inhibitoren nicht die Bindung von Nucleinsäuremolekülen an paramagnetische Partikel stören.
  • Wie oben erwähnt, werden in einer sauren Umgebung elektropositive paramagnetische Partikel wie Eisenoxidpartikel elektronegative Nucleinsäuremoleküle binden. Folglich können andere Substanzen in der Umgebung wie Inhibitoren der Nucleinsäurehybridisierung und -amplifikation von den gebundenen Nucleinsäuremolekülen getrennt werden. Eine solche Trennung kann durch dem Fachmann bekannte Mittel wie etwa Zentrifugation, Filtration oder Anwendung einer magnetischen Kraft erfolgen.
  • Die gebundenen Nucleinsäuremoleküle können dann zur weiteren Verarbeitung, z.B. für Hybridisierungs- oder Amplifikationsreaktionen, in einen geeigneten Puffer eluiert werden. Eine solche Elution kann durch Erwärmen der Umgebung der Partikel mit gebundenen Nucleinsäuren und/oder durch Anheben des pH einer solchen Umgebung erfolgen. Mittel, die dazu verwendet werden können, die Elution von Nucleinsäuren von paramagnetischen Partikeln zu erleichtern, umfassen basische Lösungen wie Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid oder jede Verbindung, die den pH der Umgebung in einem genügenden Ausmaß anhebt, so dass elektronegative Nucleinsäure von den Partikeln verdrängt wird.
  • Die folgenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der in diesem Dokument beschriebenen Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • Nucleinsäurebindung mittels Eisenoxid
  • Dieses Beispiel wurde entworfen, um die Bindung von Nucleinsäure mittels Eisenoxid mit der Bindung von Nucleinsäure mittels Zirkonium bei drei Ziel-Einsatzmengen zu vergleichen.
  • In diesem Beispiel wurden die folgenden Materialien verwendet:
    • – eine Chlamydia-trachomatis-Präparation
    • – Phosphatpuffer
    • – Probenpuffer für das BDProbeTecTM ET-System
    • – Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid FeO(OH) (30 Mesh = 300-1200 Mikrometer)
    • – hydratisiertes Zirkoniumoxid
    • – Glycin-HCl
    • – Wells für das BDProbeTecTM ET-System zum Primen und Amplifizieren von Chlamydia trachomatis
    • – Ethylalkohol
  • Das bei dem Beispiel eingehaltene Verfahren war wie folgt.
  • In Phosphatpuffer wurden Chlamydia-trachomatis-Lösungen mit 5.000 Elementarkörperchen (EK)/ml, 1.000 EK/ml, 500 EK/ml und 0 EK/ml hergestellt, und jede Lösung wurde in zwölf 2,0-ml-Zentrifugenröhrchen/Spike-Konzentration überführt. Die Röhrchen wurden 30°C Minuten auf 105°C erhitzt. Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid, die mittels Schwerkraft mit DiH2O gewaschen worden waren, wurden mit 10 mg/Röhrchen in sechs Röhrchen jeder der Chlamydia-trachomatis-Spike-Konzentrationen gegeben. Partikel aus hydratisiertem Zirkonium wurden mit 10 mg/Röhrchen in drei Röhrchen jeder Chlamydia-trachomatis-Spike-Konzentration gegeben. Drei Röhrchen jeder Konzentration wurden keine Partikel zugesetzt. In jedes der oben beschriebenen Röhrchen wurden dreißig μl 3M Glycin-HCl gegeben, und die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfschüttler angeordnet. Drei Röhrchen/Spike-Konzentration der Eisenoxidröhrchen, der Röhrchen mit hydratisiertem Zirkonium und der Röhrchen, die keine Partikel enthielten, wurden zur Abtrennung zentrifugiert und wurden einmal mit einem ml 95% Ethanol/Röhrchen, einmal mit einem ml DiH2O/Röhrchen gewaschen und wurden mit einem ml Probenpuffer/Röhrchen resuspendiert. Die anderen drei Röhrchen/Spike-Konzentration, die Eisenoxid enthielten, wurden durch Anordnen eines Magneten neben dem Röhrchen magnetisch aufgetrennt, die Proben wurden extrahiert, und die Röhrchen wurden mit 1,0 ml EtOH/Röhrchen gewaschen. Die Lösung wurde 3,0 Minuten magnetisch aufgetrennt, und jedem Röhrchen wurde 1,0 ml DiH2O zugesetzt. Die Lösung wurde 3,0 Minuten magnetisch aufgetrennt, und jedem Röhrchen wurde 1,0 ml Probenpuffer zugesetzt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten auf 105°C erhitzt und wurden in dem Chlamydia-trachomatis-BDProbeTecTM ET-System amplifiziert. Das BDProbeTecTM ET-System ist ein öffentlich offenbartes halbautomatisches System für die homogene Amplifikation und Echtzeit-Detektion von Nucleinsäure-Zielmolekülen.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels waren wie folgt.
  • Figure 00100001
  • Figure 00110001
  • Die aus den Ergebnissen gezogenen Schlussfolgerungen waren wie folgt.
  • Die MOTA-Werte (Summe einzelner Messeinheiten über die Zeit) sind eine interne Becton-Dickinson-Fluoreszenzeinheit mit einem festgesetzten Cutoff-Punkt für Positivität bei 1.000 MOTA. Magnetisch abgetrenntes Eisenoxid erzeugte die gleiche Positivität wie die Partikel aus hydratisiertem Zirkonium. Die Röhrchen, die keine Partikel enthielten, erzeugten selbst bei einer Konzentration von 5.000 EK/ml keine Verschleppungs-Ergebnisse. Dieses Experiment zeigte, dass hydratisiertes Eisenoxid unter sauren Bedingungen DNA bindet.
  • BEISPIEL 2
  • Elution und Denaturierung doppelsträngiger DNA von Eisenoxidpartikeln mittels Kaliumhydroxid
  • Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob DNA nur durch Kaliumhydroxid (KOH) ohne Wärme eluiert und denaturiert werden könnte. Außerdem wurde das Beispiel durchgeführt, um festzustellen, welcher Neutralisierungs-/Probenpuffer die besten MOTA-Werte liefert.
  • Die in diesem Beispiel verwendeten Materialien waren wie folgt:
    • – eine 70 mM KOH-Lösung
    • – ein 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer (20% DMSO, 18% Glycerin, 0, 06 % Proclin, 0, 013 mM Tween 20 und 60 mM KPO4) mit 100 mM Bicin
    • – ein 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer mit 200 mM Bicin
    • – ein 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer mit 300 mM Bicin
    • – ein Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer (10% DMSO, 9% Glycerin, 0,03% Proclin, 0,0065 mM Tween 20 und 30 mM KPO4)
    • – Partikel aus hydratisiertem Zirkonium
    • – Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid
    • – eine Chlamydia-trachomatis-Präparation
    • – 95% Ethylalkohol (EtOH)
    • – Phosphatpuffer
  • Das bei diesem Beispiel eingehaltene Verfahren war wie folgt.
  • In Phosphatpuffer wurden Chlamydia-trachomatis-Lösungen mit 1.000 EK/ml und 5.000 EK/ml hergestellt und wurden mit 1,0 ml/Röhrchen in 32 Zwei-ml-Zentrifugenröhrchen/Spike-Konzentration gegeben. Hydratisiertes Eisenoxid wurde mit 10 mg/Röhrchen in 16 Röhrchen/Spike-Konzentration gegeben, und jedem Röhrchen wurden 60 μl 3M Glycin-HCl zugesetzt. Partikel aus hydratisiertem Zirkonium wurden mit 10 mg/Röhrchen in 16 Röhrchen/Spike-Konzentration gegeben, und jedem Röhrchen wurden 30 μl 3M Glycin-HCl zugesetzt. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfrotator gehalten. Die Eisenoxidröhrchen wurden magnetisch aufgetrennt und anschließend mit 1,0 ml EtOH und dann mit 1,0 ml DiH2O gewaschen. Die Zirkoniumpartikelröhrchen wurden mittels Zentrifuge einmal mit einem ml EtOH und dann mit einem ml DiH2O gewaschen. Zwölf Röhrchen jeder Partikelart und jeder Spike-Konzentration bekamen jeweils für 15 Minuten 500 μl 70 mM KOH zugesetzt. Von den zwölf Röhrchen bekamen vier Röhrchen beider Partikelarten und Spike-Konzentrationen jeweils 500 μl 100 mM 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer (w/Phosphat) zugesetzt. Von den zwölf Röhrchen bekamen vier Röhrchen beider Partikelarten und Spike-Konzentrationen jeweils 500 μl 200 mM 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer (w/Phosphat) zugesetzt. Von den zwölf Röhrchen bekamen vier Röhrchen beider Partikelarten und Spike-Konzentrationen jeweils 500 μl 300 mM 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer (w/Phosphat) zugesetzt. Den vier übrigen Röhrchen wurde 1,0 ml Probenpuffer zugesetzt. Zwei Röhrchen jeder Partikelart, Spike-Konzentration und Pufferart wurden fünf Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Die Probenflüssigkeit wurde dann sofort in dem Chlamydiatrachomatis-BDProbeTecTM ET-System amplifiziert.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels waren wie folgt.
  • Figure 00130001
  • Die aus den obigen Ergebnissen gezogenen Schlussfolgerungen waren wie folgt.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass DNA von Partikeln aus hydratisiertem Eisenoxid und hydratisiertem Zirkoniumoxid nur mit KOH (ohne Wärme) eluiert und denaturiert werden kann und dass die Neutralisierungspuffer, die optimale MOTA-Werte lieferten, die 2X Neutralisierungspuffer mit 200 und 300 mM Bicin waren.
  • BEISPIEL 3
  • Extraktion von Nucleinsäure aus Harnproben mittels hydratisiertem Eisenoxid
  • Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um festzustellen, ob hydratisiertes Eisenoxid bei einem niedrigen pH dazu verwendet werden kann, Chlamydia-trachomatis-DNA aus gespikten Harnproben zu extrahieren.
  • Die in diesem Beispiel verwendeten Materialien waren wie folgt:
    • – Harnproben
    • – Chlamydia-trachomatis-Präparationen
    • – Probenpuffer
    • – Partikel aus hydratisiertem Zirkonium
    • – Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid
    • – 95% Ethylalkohol (EtOH)
    • – Glycin-HCl
    • – Chlamydia-trachomatis-Primerwells und -Amplifikationswells für das BDProbeTecTM ET-System
  • Das bei diesem Beispiel eingehaltene Verfahren war wie folgt.
  • Zehn Harnproben wurden jeweils in drei Zwei-ml-Aliquots aufgeteilt, und die Harnproben wurden mit Chlamydia-trachomatis-Präparation mit 1.000 EK/ml, 2.500 EK/ml und 5.000 EK/ml gespikt. Die Harnproben wurden in 1,0-ml-Volumina in Zwei-ml-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. Dann wurden bei jeder Probe 10 mg Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid in ein Röhrchen jeder Spike-Konzentration gegeben. Jedem Eisenoxidröhrchen wurden 60 μl 3M Glycin-HCl zugesetzt. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfrotator gehalten. Außerdem wurden bei jeder Probe 10 mg Partikel aus hydratisiertem Zirkonium in ein Röhrchen jeder Spike-Konzentration gegeben. Jedem Röhrchen, das hydratisiertes Zirkonium enthielt, wurden 30 μl 3 M Glycin-HCl zugesetzt. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfrotator gehalten. Die Röhrchen, die Partikel aus hydratisiertem Zirkonium enthielten, wurden mittels Zentrifuge bei 10.000 g unter Verwendung von einem ml EtOH und dann einem ml DiH2O gewaschen. Die Röhrchen wurden mit 1,0 ml Probenpuffer resuspendiert. Die Röhrchen, die Eisenoxidpartikel enthielten, wurden magnetisch aufgetrennt und dann unter Verwendung von einem ml EtOH und dann 1,0 ml DiH2O gewaschen, und die Röhrchen wurden mit 1,0 ml Probenpuffer resuspendiert. Die Probenflüssigkeit von jedem Röhrchen wurde 5 Minuten gekocht und anschließend mittels des Chlamydia-trachomatis-BDProbeTecTM ET-Systems amplifiziert.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels waren wie folgt.
  • Figure 00150001
  • Die aus den obigen Ergebnissen gezogenen Schlussfolgerungen waren wie folgt.
  • Der nachweisbare Positivitätsgrad sinkt bei sowohl den Partikeln aus hydratisiertem Zirkonium als auch den Partikeln aus hydratisiertem Eisenoxid bei der gleichen Konzentration. Dies weist auf ein gleiches Leistungsverhalten beider Partikelarten hin. Bei niedrigem pH kann Eisenoxid DNA aus Harnproben extrahieren.
  • BEISPIEL 4
  • Extraktion von Nucleinsäure aus Plasmaproben mittels hydratisiertem Eisenoxid
  • Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um festzustellen, ob hydratisiertes Eisenoxid bei einem niedrigen pH dazu verwendet werden kann, Chlamydia-trachomatis-DNA aus gespikten Plasmaproben zu extrahieren. Außerdem wurde dieses Beispiel durchgeführt, um ein Plasma-DNA-Extraktionsverfahren, das Partikel aus hydratisiertem Zirkonium verwendet, mit einem Plasma-DNA-Extraktionsverfahren zu vergleichen, das Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid verwendet.
  • Die für dieses Beispiel verwendeten Materialien waren wie folgt:
    • – 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer mit 300 mM Bicin
    • – Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid
    • – Partikel aus hydratisiertem Zirkoniumoxid
    • – Guanidinisothiocyanat
    • – Chlamydia-trachomatis-Stammpräparation
    • – BDProbeTecTM ET-Primerwells und -Amplifikationswells für Chlamydia trachomatis
    • – BDProbeTecTM ET-Primerwells und -Amplifikationswells für die interne Amplifikationskontrolle (IAC)
    • – 150 mM KOH
    • – Plasmaproben
    • – 95% Ethylalkohol
  • Das bei diesem Beispiel eingehaltene Verfahren war wie folgt.
  • Eisenoxidverfahren
  • Ein ml DiH2O wurde acht Zwei-ml-Zentrifugenröhrchen zugesetzt, die 40 mg Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid enthielten. Zwei Plasmaproben wurden mit Chlamydia-trachomatis-Präparation gespikt, und zwar mit 9.000 EK/300μl, 6.000 EK/300μl, 3.000 EK/300μl und 1.500 EK/300μl. Dann wurden 300 μl jeder gespikten Plasmaprobe den Röhrchen zugesetzt, welche die Partikel aus hydratisiertem Eisenoxid enthielten. Die Röhrchen wurden 30°C Minuten auf 105°C erhitzt. Anschließend wurden jedem Röhrchen achtzig μg Eisessig zugesetzt, und die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfrotator angeordnet. Die Röhrchen wurden dann in einen magnetischen Röhrchenständer gestellt, und die behandelte Probenflüssigkeit wurde entfernt. Die Röhrchen wurden magnetisch aufgetrennt und dann zweimal mit 1,0 ml 25 mM Essigsäure gewaschen. Die DNA wurde 15 Minuten mit 500 μl 150 mM KOH von den Partikeln aus hydratisiertem Eisenoxid eluiert. Die Lösungen wurden mit 500 μl 300 mM 2X Probenpuffer neutralisiert. Die Proben wurden dann fünf Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Anschließend wurden die Proben mittels des Chlamydia-trachomatis-BDProbeTecTM ET-Systems amplifiziert.
  • Verfahren mit hydratisiertem Zirkonium
  • Dieselben zwei Plasmaproben aus dem obigen Eisenoxidverfahren wurden je Plasmaprobe mit 300 μl/Röhrchen in vier 2,0-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Jedem Röhrchen wurden 700 μl fünfmolares Guanidinisothiocyanat (GITC) zugesetzt. Die vier Röhrchen jeder Probe wurden mit Chlamydia-trachomatis-Präparation gespikt, jeweils mit 9.000 EK/300μl, 6.000 EK/300μl, 3.000 EK/300μl und 1.500 EK/300μl, und die Röhrchen wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Es wurde eine Aufschlämmung von Partikeln aus hydratisiertem Zirkoniumoxid hergestellt, indem 10 mg Zirkoniumoxidpartikel mit 30 μl 3M Glycin-HCl vereinigt wurden. Jedem Röhrchen wurden dreißig μl dieser Aufschlämmung zugesetzt, und die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfrotator angeordnet. Die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und jedem Röhrchen wurde 1,0 ml 2M GITC zugesetzt. Die Röhrchen wurden 3,0 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und jedem Röhrchen wurde 1,0 ml 80% Ethylalkohol/20% 50 mM Trispuffer zugesetzt. Die Röhrchen wurden zwei zusätzliche Male gewaschen, indem 3,0 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert, der Überstand entfernt und 1,0 ml DiH2O zugesetzt wurde. Die DNA wurde in 1,0 ml 150 mM KOH/2X Probenpuffer mit 300 mM Bicin eluiert. Die Proben wurden fünf Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Die Proben wurden kurz bei 3.200 g zentrifugiert und wurden mittels des Chlamydia-trachomatis-BDProbeTecTM ET-Systems amplifiziert.
  • Verfahren für die interne Amplifikationskontrolle Probenpuffer wurde mit Chlamydia-trachomatis-Präparation mit 9.000 EK/300μl, 6.000 EK/300μl, 3.000 EK/300μl und 1.000 EK/300μl gespikt. Die Proben wurden fünf Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt und wurden mittels des Chlamydiatrachomatis-BDProbeTecTM ET-Systems amplifiziert.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels waren wie folgt.
  • Figure 00180001
  • Die aus den obigen Ergebnissen gezogenen Schlussfolgerungen waren wie folgt.
  • Bei Anwendung einer MOTA-Positivitätsgrenze von 1.000 war hydratisiertes Eisenoxid bis zu 3.000 EK/300 μl in der Lage, DNA aus Plasmaproben zu extrahieren
  • BEISPIEL 5
  • Einfangen von Nucleinsäure mittels Eisen(II,III)-oxid (Fe3O4) Dieses Beispiel wurde entworfen, um zwei Nucleinsäure-Adsorptionspartikel unter neutralen und sauren Bindungsbedingungen zu vergleichen: Eisenhydroxid (hydratisiertes Eisen(III)-oxid) und Eisen(II,III)-oxid.
  • Die für dieses Beispiel verwendeten Materialien waren wie folgt:
    • – Phosphatpuffer
    • – Partikel aus Eisenhydroxid (FeO(OH))
    • – Partikel aus Eisen(II,III)-oxid (Fe3O4)
    • – Chlamydia-trachomatis-Präparation
    • – BDProbeTecTM ET-Primerwells und -Amplifikationswells für Chlamydia trachomatis
    • – BDProbeTecTM ET-Primerwells und -Amplifikationswells für die interne Amplifikationskontrolle (IAC)
    • – Essigsäure
    • – 150 mM KOH
    • – 2X Chlamydia-trachomatis-Probenpuffer mit 300 mM Bicin
  • Das bei diesem Beispiel eingehaltene Verfahren war wie folgt.
  • Eisenhydroxid(FeO(OH))-Pulver wurde hergestellt, indem ein 30-50-Mesh-Material mit Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben wurde. Man ließ das Pulver in einer wässerigen Lösung vier Minuten absitzen. Der Überstand wurde entfernt, und das Material wurde zusätzliche fünfzehn Minuten absitzen gelassen. Das pelletierte Material wurde dann magnetisch abgetrennt und wurde magnetisch mit DiH2O gewaschen. Das Material wurde dann über 20-μm-Filterpapier filtriert und über Nacht bei 37°C getrocknet. Anschließend wurden 60 μg des Materials in ein Röhrchen überführt, das 480 μl DiH2O enthielt. Diese Aufschlämmung wurde in sechs 2-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Außerdem wurden 240 μg getrocknetes FeO(OH)-Material in ein Röhrchen überführt, das 480 μl DiH2O enthielt. Die erzeugte Aufschlämmung wurde in sechs 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
  • Überdies wurden 60 μg Fe3O4 (bei Klassierung durch ein 325er Sieb 88-92% Passage) in ein Röhrchen überführt, das 480 μl DiH2O enthielt. Die erzeugte Aufschlämmung wurde in sechs 2-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Eine weitere Aufschlämmung wurde erzeugt, indem 240 mg getrocknetes Fe3O4-Material in ein Röhrchen überführt wurden, das 480 μl DiH2O enthielt. Diese Aufschlämmung wurde dann in sechs 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Chlamydia-trachomatis-Lösungen wurden mit 0 EK/ml, 1.000 EK/ml und 4.000 EK/ml in Phosphatpuffer hergestellt. Jede Konzentration von Chlamydia-trachomatis-Lösung wurde in zwei Röhrchen jeder Partikelart gegeben. Die Röhrchen wurden 30°C Minuten auf 105°C erhitzt. Einem Röhrchen jeder Partikelart wurde ein 80-μl-Aliquot Essigsäure zugesetzt, und die Röhrchen wurden für 30 Minuten auf einem Überkopfschüttler gehalten. Die Röhrchen wurden dann magnetisch aufgetrennt und zweimal mit 1,0 ml 25 mM Essigsäure/Waschgang gewaschen. Jedem Röhrchen wurde mit 500 μl/Röhrchen für 15 Minuten ein 150 mM KOH-Aliquot zugesetzt, und jedem Röhrchen wurden 500 μl 2X Probenpuffer mit 300 mM Bicin zugesetzt, und die Röhrchen wurden fünf Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Die Probenflüssigkeit wurde mittels des Chlamydia-trachomatis-BDProbeTecTM ET-Systems amplifiziert.
  • Die Ergebnisse dieses Beispiels waren wie folgt.
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Die aus den obigen Ergebnissen gezogenen Schlussfolgerungen waren wie folgt.
  • Bei Anwendung einer MOTA-Positivitätsgrenze von 1.000 kann Fe3O4 Nucleinsäure bis zu einer Konzentration von 1.000 EK/ml extrahieren, was mit dem Extraktionsvermögen von FeO(OH) bei beiden Mengen vergleichbar ist. Ein negatives Säurevolumen zeigte negative Auswirkungen sowohl auf die Anzahl positiver Werte bei der niedrigeren Konzentration von 1.000 EK/ml als auch auf die MOTA-Werte.

Claims (3)

  1. Verfahren zur reversiblen Bindung wenigstens eines Nucleinsäuremoleküls an wenigstens ein nucleinsäurebindendes Partikel, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Suspension wenigstens eines nucleinsäurebindenden Partikels in einer sauren Lösung, wobei dieses wenigstens eine nucleinsäurebindende Partikel ausschließlich aus paramagnetischem Material besteht; und (b) Vereinigen dieser Suspension mit wenigstens einem Nucleinsäuremolekül, so dass eine reversible elektrostatische Bindung zwischen dem wenigstens einen Nucleinsäuremolekül und dem wenigstens einen nucleinsäurebindenden Partikel erfolgt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das paramagnetische Material Eisen umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das paramagnetische Material aus der Gruppe bestehend aus einem Eisenoxid, Eisensulfid und Eisenchlorid ausgewählt wird.
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