WO1995005457A1 - Adn codant pour la fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase dependante de l'atp et derivee de vegetaux, vecteur de recombinaison la contenant, et procede pour modifier la teneur en sucre d'une cellule vegetale a l'aide de ce vecteur a basse temperature - Google Patents

Description

明細書

植物由来の A TP依存フルク トース 6リン酸 1ホスホトランスフヱラーゼをコ一 ドする DNA、 それを含む組換えベクター及びそれを用いる低温下で植物細胞中 の糖含量を変化させる方法

技術分野

本発明は、 植物由来の AT P依存フルク トース 6リン酸 1ホスホトランスフヱ ラーゼ （EC 2.7· 1.11) (以下、 「P FKJ という） をコードする DNA、 それを 含む組換えべクタ—及び該組換えベクターを用いて低温下で植物細胞中の糖含量 を変ィ匕させる方法に関する。

背景技術

PFKは、 解糖系の律速反応を触媒し、 フルク トース 6リン酸 （以下 F 6 P 称する） をフルク ト一ス 1， 6二リン酸にリン酸化する酵素である。

植物組織を低温下に晒すと一般にス—クロース、 グルコース、 フルク ト―ス等 の糖含量が増加することが知られている。 例えば、 バレイショ塊茎もその例外で はないが、 塊茎低温貯蔵中に生じるダルコ—ス、 フルク トースといった還元糖の の蓄積はポテトチップ加工時の過度の褐変の原因になり産業上好ましくない。 こ の還元糖蓄積が生じる原因については様々な仮説があるが、 低温下では解糖系活 性が著しく低下し、 その結果、 デンプン分解物のスクロース合成系側への流入が 促進され、 それが原因で還元糖が蓄積すると考えられている。 解糖系は PFKに よって律速され、 且つ PFKは低温に弱い酵素であることが広く知られているこ とから、 低温下における解糖系活性の著しい低下の原因は、 PFKの著しい活性 低下に起因すると考えられている。

PFK遺伝子単離に関しては、 大腸菌、 好熱菌、 枯草菌及びマイコプラズマ等 の原核生物由来のもの並びにヒ ト筋肉、 ヒト肝臓、 ゥサギ筋肉及びマウス肝臓等 の真核生物組織由来のものが論文で報告されている。 しかしながら植物 P F K遺 伝子の単離報告はない。 また低温耐性 PFKをコードしている遺伝子を単離した という報告もない。 それ故、 従来技術では、 低温耐性 PFK遺伝子導入による低 温低糖性バレイショの作出、 あるいは PFKアンチセンス RNAを発現させ植物 組織内の解糖系活性を抑制することによって、 糖含量の高い新し 、味覚を有する 作物を作出することができない。

植物に P F K遺伝子を導入した例として欧州特許公開第 0 438 904号 （特開平 4 - 3 4 1 1 2 6号公報） がある。 この公開公報に記載された発明では、 大腸菌 P F K遣伝子をバレイショ、 イネで発現させ、 糖代謝系の中間代謝物量に変化が 生じることを示した。 特に、 バレイショでは収穫直後の塊茎中のスクロース含量 が減少することを示した。 しかし、 この公報記載の発明では、 加工用バレイショ で産業上問題となる低温貯蔵下の塊茎中のグルコース、 フルク ト―ス量の減少に ついては述べられていない。 大腸菌 P F Kが低温下で不安定な酵素であること

(Kruger, N. J. (1989)Biochemical Society Transaction 629th Meeting, London Vol. 17 760-761) を考慮すれば、 大腸菌 P F K遺伝子をバレイショに導入し、 塊 ' 茎で発現させる方法では低温低糖性ノ レイショ品種を作出できないことは容易に 想像が付く。 本目的を達成するには低温耐性 P F Κをコ-ドする遺伝子が必要で ある。 しかし、 低温耐性 P F K遺伝子を単離したという従来技術はない。

収穫後のバレイショ塊茎を低温貯蔵することは、 病気、 発芽、 老化を抑制し長 期保存するうえで非常に重要である。 し力、し、 低温貯蔵した塊茎をポテトチップ やフレンチフライの原料として直接使用する場合、 加工中に過度の褐変を生じ製 品 （特にポテトチップ） の商品価値が著しく低下する。 この褐変は、 塊茎中に含 まれるアミノ酸と還元糖が高温の油で加工する際に生じるメイラ—ド反応によつ て起こることが知られている （Schallenberger, R. S. et al. , (1959) J. Agric.

Fd Chem. , 7, 274 ) 。 塊茎を低温貯蔵すると塊茎中の還元糖 （グルコース · フ ルク トース） 量が増加し、 塊茎中のグルコース · フルク トース量と製品の褐変度 の間に高い相関が見られることが知られており、 低温貯蔵中のグルコース . フル ク トース量の増加が、 加工中に過度の褐変を生じる主要因と考えられている

(Gray, D and Hughes, J. C. (1978) The Potato Crop (ed. P. M. Harris), Chapmann

& Hall, London, pp. 504-544) 。

現在、 ポテトチップ加工業者は発芽抑制剤を併用し 8 °C前後 （品種により異な る） の低温で貯蔵した塊茎を原料として用いている。 し力、し、 許容範囲を越える 還元糖の蓄積があり、 加工前にブランチングあるいはリコンディショニングと呼 ばれる処理をし、 塊茎組織の還元糖量を減らしてから使用している。 これらの処 理は費用や手間が掛かり、 現在使用されて t、る貯蔵温度で還元糖を蓄積しな 、バ レイショ新品種が作出されれば、 それは加工業者にとってコス卜低減につながる という利点がある。 さらに、 2〜4 °Cという低温貯蔵下で還元糖を蓄積しにくい ノくレイショ品種を作出できれば、 ブランチングゃリコンディショニングといった 加工前処理に費やす手間や費用を節減できるだけではなく、 老化あるいは乾物重 ロスの原因となる発芽を抑制でき、 安全性に問題のある発芽抑制剤を使用せずに 塊茎の長期保存が可能になる。 そうした意味で低温低糖性のバレイショ品種の作 出に対する加工業者の要求は強い。

この問題となる低温貯蔵中のグルコース · フルク ト―ス量の増加は、 低温下で の塊茎中の様々な生理的変ィ匕により生じるが、 そのなかでも、 解糖系の律速酵素 と言われる P F Kの低温下での著しい活性低下が主要な原因であると考えられて いる （Dixson, W. L. and ap Rees, T. (1980) Phytochem. , 19, 1653； Dixson,

W. L. et al. , (1981) Phytochem. , 20, 969 ; Pollock, C. J. and ap Rees, T. (1975) Phytochem. , 14, 613) 。 低温貯蔵中の塊茎では、 還元糖はデンプンの分 解により供給されると考えられ、 その代謝過程で F 6 Pを経由する。 F 6 Pを基 質とする生体反応には大きく分けて 2つある。 1つは F 6 Pを解糖系へ流す P F Kに触媒される反応、 もう 1つは F 6 Pをスクロース合成系へ流すスクロー ス 6リン酸合成酵素 （以下 S P Sと称する） （E 2. 4. 1. 14) に触媒される反応 である。 つまりこの 2酵素は基質の F 6 Pを巡って競合関係にある。 収穫後常温 で貯蔵したバレイショ塊茎では、 発芽や老化を起こさない限り通常グルコースと フルク トースの蓄積量は非常に少ない。 これは P F Kが S P Sとの競合で勝り、 F 6 Pの大部分が解糖系側に流れ込むためと考えられる。 しかし、 低温下では P F Kの酵素活性が著しく低下し、 S P Sが P F Kとの競合に勝り、 F 6 Pは解 糖系よりもスクロース合成系に優先的に流れ込むようになる。 そしてスクロース は最終的にインベルターゼ （EC. 3. 2, 1. 26) の働きによってダルコ—スとフルク ト一スになり蓄積すると考えられている。 このように P F Kの活性低下に起因す る解糖系活性の減少が、 低温貯蔵中にバレイショ塊茎中のグルコースとフルク ト 一ス量を増加させる原因と考えられている。 この仮説を裏付けるように、 Hammond 等 （Planta 180, 613-616. 1990 ) は、 スコッ トランド作物研究所で作出された低 温低糖性品種の塊茎には低温貯蔵中に還元糖含量が増加する通常品種にはな 、低 温耐性 P F Kが存在することを報告しており、 塊茎中の P F Kの低温耐性の強弱 が低温貯蔵中のグルコース、 フルク ト—ス量を決定する主要因である可能性が示 されている。

もし、 低温耐性 P F Kをコードする D N Aが得られれば、 それをバレイショに 導入し低温貯蔵中の塊茎で発現させることにより解糖系活性を高めることがで き、 その結果、 還元糖量の少ない低温低糖性バレイショを作出できる。 これによ り、加工業者は糖含量を低下させるために現在行つているブランチングゃリコン ディショニング処理に費やしているコストを節約できる。

発明の開示

従って、 本発明の目的は、 低温耐性 P F Kをコードする D N Aを提供すること である。 さらにまた、 本発明の目的は、 低温耐性 P F Kを宿主細胞内で発現する ことができる組換えベクターを提供することである。 さらに、 本発明の目的は、 該組換えベクターを用いて植物を形質転換することにより低温下で植物細胞中の 糖含量を変化させる方法を提供することである。

本願発明者らは、 上記目的を達成するために、 低温耐性 P F Kを有する植物組 織、 具体的にはバレイショ品種 Brodick の塊茎に由来する P F Kのァイソザィム の 1つをコードする相補的遺伝子 （c D N A、 翻訳領域及び非翻訳領域を含む） の単 βびに構造解明を試みた結果、 これに成功し、 且つ本遺伝子が大腸菌およ びバレイショ塊茎中で低温耐性 P F Κを発現させることを確認し、 且つ本遺伝子 を発現させたバレイショの低温貯蔵塊茎中のグルコース含量の減少およびそれを 材料として調製したポテトチップの色の改善を確認し、 且つ本遺伝子をプローブ として種々植物 P F Κ遣伝子の単離に成功し、 且つ種々植物 P F Κに特異的で且 つ共通に存在するアミノ酸配列を同定し本発明を完成した。

すなわち、 本発明は、 植物由来の P F Kをコードする D N Αを提供する。 ま た、 本発明は、 上記本発明の D N Aを含み、 宿主細胞内で配列表の配列番号 2で 示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現することができる組換えべク ターを提供する。 さらに、 本発明は、 上記本発明の組換えベクターで植物を形質 転換することから成る、 低温下で植物細胞中の糖含量を変化させる方法を提供す る。 さらに、 本発明は、 配列表の配列番号 1 1、 14、 21又は 22で示される アミノ酸配列をコードする DNAを提供する。 さらにまた、 本発明は、 配列表の 配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸又はその部分をコードする DNA及 び配列表の配列番号 1 1ないし 22で示されるァミノ酸配列をコードする D N A を含む D N Aのいずれかと試料 D N Aとをハイブリダィズさせることから成る、 植物由来の PFK遺伝子の検出方法を提供する。 さらにまた、 本発明は、 配列表 の配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸又はその部分をコードする DNA 及び配列表の配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸配列をコードする DN Aを含む DN Aのいずれかを P C Rのためのプライマーとして用いて植物由 来の A TP依存フルク トース 6リン酸 1ホスホトランスフヱラーゼ遺伝子を増幅 する方法を提供する。

本発明により、 低温耐性 PFKをコードする DN Aおよびそれを含むベクタ— が初めて提供された。 本発明の組換えベクターを植物に遺伝子工学的に導入し発 現させることにより、 低温下に置かれた塊茎組織でダルコ一ス含量を非形質転換 体に比べ減少させることが可能であり、 特に植物、 その中でもバレイショで低温 低糖性品種の開発に利用できる。 また、 本発明により初めて提供された種々植物 PFK遺伝子のDNA塩基配列は、 植物 P FK遺伝子の単離にプローブとして利 用するのが非常に難しい他生物由来の PFK遺伝子と異なり、 植物 PFK遺伝子 単離に広く利用できる。 さらに、 単離された種々植物 PFK遺伝子の塩基配列を 利用して、 アンチセンス RNAを発現させる方法等により、 植物細胞中の PFK 活性を抑制することが可能になる。 例えば糖代謝を改変したり、 呼吸を減少させ ることが可能で、 より多く糖を蓄積する甘い果物や野菜を作出できる。

図面の簡単な説明

図 1は、 本発明の組換えベクターで形質転換された大腸菌 No. 58株と、 対照の 大腸菌 No. 1株の I PTG添加後における PFK活性の誘導の時間変化を示す図 である。

図 2は、 本発明の組換えベクターで形質転換された大腸菌 No. 58株の PFK活 性の免疫滴定実験の結果を示す図である。

図 3は、 本発明の組換えベクターで形質転換された大腸菌 No. 58株から精製し た P FKの SD S— PAGEによる解析とゥヱスタンプ口ッ ト解析の結果を示す 図である。

図 4は、 低温耐性 P F K— d遺伝子を含む発現べクタ一を示す図である。

図 5は、 系統 B 75及び系統 B 40の貯蔵塊茎からの RN Aのノーザンプロッ ト分析の結果を示す図である。

図 6は、 系統 B 75及び系統 B 40の貯蔵塊茎からの粗抽出液のゥヱスタンプ ロッ ト分析の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

上述のように、 DNAは植物 PFKをコ―ドするものであり、 その具体例であ るノくレイショ （Solanum tuberosum L. ) 、 フラへリア (Flaberia brownii) 、 ィ ネ (Oryza sativa) 、 卜ゥモロコシ (Zea mays) 、 ラアイ ツシュ (Raphanus sativus) P FKコ―ド DNAは、 各々下記配列表の配列番号 2、 4、 6、 8、 10で示されるァミノ酸配列をコードする。 このような DN Aの具体例として、 下記実施例において実際にクローニングされ、 塩基配列が決定された、 配列表の 配列番号 1、 3、 5、 7、 9で示される DNAを挙げることができるがこれに限 定されるものではない （なお、 配列番号 2、 4、 6、 8、 10のアミノ酸配列は 各々配列番号 1、 3、 5、 7、 9に示されているアミノ酸配列と同じである） 。 特に、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9で示されるものは c DNAである力 本発明 により、 植物 PFKのァミノ酸配列及びこれをコードする DNAの塩基配列が明 らかにされたので、 これらの塩基配列の両端部分をプライマーとして用い、 ゲノ ミ ック DN Aを铸型として用いた PC R法により、 配列番号 2、 4、 6、 8、 10で示されるアミノ酸配列をコードするゲノ ミ ック DN Aを容易に調製するこ とができる。 従って、 このようなゲノ ミ ック DNA (イン トロン部分を含み得 る） も本発明の範囲に入るものと解釈する。

上記した、 配列番号 2で示されるァミノ酸配列をコードする DNAや、 配列番 号 1で示される塩基配列を有する DNAがコードする植物 PFKは、 後述の実施 例で具体的に示されるように、 5°Cにおける Q 1 0値 （後述） が 2. 4以下であ る。 5°Cにおいて Q 1 0値が 2. 4以下である P FKは低温耐性を有すると言え る。 本発明の DN Aは、 例えば次のような方法により得ることができる。

まず、 植物組織より PFKに対応するポリ （A) + RN Aを分離する際には、 まず分解を受けていない全 RN Aを単離することが望ましい。 また、 低温耐性 PFKを有することが知られている植物組織、 具体的にはバレイショ低温低糖性 品種 Brodick の低温貯蔵塊茎を材料に用いるのが望ましい。

ノ<レイショ塊茎より全 RN Aを単離する方法としては、 例えばドデシル硫酸ナ トリウム （SDS) フヱノ—ル法などがある。 調製した全 RNAから PFKポ リ （A) + RN Aを得るには、 ダイナビーズ mRN A精製キッ ト （DYNAL) などを用い ことができる。 この処理によって直接 PFKポリ （A) + RNAを 単離することは容易でないので、 得られたポリ （A) + RNA集団を铸型として cDNAを作成し、 これらを有する微生物集団 （cDNAライブラリー） を作成 することが望ましい。 具体的には、 Gublerと Hoffman の方法 （Gene, 25:263， 1983) 等により 2本鎖 c DNAを合成し、 アダプタ— D N Aを介して D N Aリガ —ゼにより適当なベクタ—に結合させ、 宿主となる微生物を形質転換させ、 c DNAライブラリ—を作成する。 ここで用いるベクタ—としては、 大腸菌を宿 主とする場合、 pUC系あるいは； Iファージ系のものが利用しやすい。 し力、し、 最も効率的に当該遺伝子をスクリ—ニングするには、 バレイショ品種 Brodick塊 茎ポリ （A) + RNAより合成された 2本鎖 c DNAを制限酵素 Eco RIと Notlの 認識部位を有するアダプタ— DNAを介してス gtlOファージベクタ—の Eco RI部 位に DNAリガーゼにより結合させた後、 ファージ粒子を形成させ、 cDNAラ イブラリーを作成すれば良い。 次いで、 この c DNAライブラリ—から PFKポ リ （A) + RN Aに対応する c DN Aクローンを同定する。

P FK c DN Aクローンの同定は、 精製した植物 P FKの部分ァミノ酸配列の 決定に基づいて合成したォリゴヌクレオチド、 あるいはこれらォリゴヌクレオチ ドをプライマーとし植物ゲノム DN Aあるいは c DNAを铸型としてポリメラ一 ゼチヱイン反応 （PCR) によって増幅した PFK遺伝子の塩基配列の一部を有 する DNAをプロ—ブに用い、 ブラ—クハイプリダイゼーション法によって行う ことができる。

次に、 バレイショ塊茎 PFKコード DN Aを有する形質転換体をプレ—トライ セー ト法等により大量培養し、 常法、 例えば Sambrook等の方法 （Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition，し old Spring Harbor Laboratory

Press, 1989 ) によりファージ D N Aを精製し、 さらに、 制限酵素 Not 1 で消化 後、 ァガ口—ス電気泳動等を行うことにより、 PFKをコ―ドする cDNAを得 ることができる。 さらに、 バレイショ P FK遺伝子が一旦単離されたならば、 こ の単離された P F K遺伝子若しくはその一部をプローブとして用いることによ り、 又はその一部を P CR用のプライマーとして用いることにより種々の植物か ら P F K遺伝子を容易に単離することができる。

下記実施例に記載するように、 種々の植物の PFK遺伝子の c DNAがクロー ン化され、 その塩基配列及び推定アミノ酸配列が決定された。 種々の植物の

PFK遺伝子のアミノ酸配列を比較することにより、 植物 PFKに共通な、 5個 以上のアミノ酸残基を有する 13種のアミノ酸配列が同定された。 従って、 これ らの配列若しくはその一部をコードする核酸又はこれらの配列をコ一ドする領域 を含む核酸であって、 所望の P F K遺伝子とハイブリダィズするものをプロ—ブ 又は P CR用プライマ一として用いることにより種々の植物の P FK遺伝子を検 出又は増幅することができる。 表 7に示すァミノ酸配列をコードする DN Aは容 易に化学合成できる。 表 7に示す配列のうち、 配列（1) 、 （4) 、 （11)及び（12)

(すなわち、 配列表の配列番号 1 1、 14、 21及び 22) は植物の PFKに共 通するが植物以外の生物の P FKには見られないものである。 従って、 これらの 配列を用いることにより、 他の生物由来の PFKが混入する可能性を排除して植 物 PFKを検出又は増幅することができる。 プローブとしては、 ヌクレオチド数

15以上、 遺伝子の全長以下の長さのものが好ましい。 オリゴヌクレオチドを放 射マーカ一又は蛍光マーカ一等で標識する方法はこの分野において周知である。 また、 P CR用のプライマーとしては、 ヌクレオチド数 15ないし 30のものが 好ましい。

このようにして得られる PFKcDNAの利用方法としては、 まず第一に、 こ れを微生物、 植物および動物のベクター等に組み込んで微生物、 植物および動物 を形質転換し組織中の P F K活性を増大できることである。 さらに別の利用法と して、 P FK c DNAを逆向きにベクタ—に揷入し、 バレイショ等の植物組織中 で発現させ、 本来植物が有する P F K活性を抑制できることである。

ここで、 微生物としては大腸菌等のエスケリツチァ属等の細菌やパン酵母等の サッカロミセス属等の酵母がある。 また、 植物としては主としてァグロバクテリ ゥム属細菌— R i Z T i プラスミ ド系による形質転換が可能な双子葉植物、 例え ばバレイショ、 タバコ、 トマト等に代表されるナス科植物、 メロン、 キユウリ等 のゥリ科植物、 ダイコン、 ナタネ等のアブラナ科植物、 ブドウ、 柑橘類等の果樹 類が挙げられる。 その他、 P E G—リン酸カルシウム法、 エレク トロボレ一ショ ン法、 パーティクルボンバ—ドメント法等による形質転換が可能な植物として は、 イネ、 トウモロコシ等に代表されるイネ科植物等の単子葉植物がある。 動物 では、 ヒト、 マウス等の各種培養細胞 （BALB/ C-3T3等） が挙げられる。 これらの 宿主に使用されるベクタ—を以下に例示する。

文献 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, 1989 等） に記載の各種プラス ミ ドベク タ—

(pBR322. pUC系プラスミ ド等） およびファージベクタ一 （ス gtlO、 A gtlK λ ZAP 等） などがあり、 酵母、 動物細胞のベクターとしては、 文献 （Molecular Cloning: A Laboratory Manual /Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, 1989 等） に記載の各種ベクターが挙げられる。 植物のベクターとして は、 通常クローニングに用いられるプラスミ ド由来の各種ベクターやバイナリ一 ベクタ— （pGA482、 pBinl9等） などの T iプラスミ ド由来のベクタ—類が挙げら れる （文献： An, G. et al (1986) Plant Physiol. 81, 301 ; Bevan, M. , (1984)

Nucleic Acids Research 12, 8711 等） 。 但し、 T iプラスミ ド由来の植物べク ターの場合は、 得られた組換え D N Aを一旦ァグロパクテリゥム ·ツムファシェ ンス等 （LBA4404 等） のァグロパクテリゥム属の細菌に導入し、 本組換え微生物 を植物組織あるいはカルスと共存培養等により感染させることによって、 宿主植 物に該 c D N Aを導入することができる （文献： Komari, T. (1989) Plant Science, 60. 223 ; Visser, R. G. F. et al. , (1989) Plant Molecular Biology

12, 329等） 。 なお、 植物においてこれらの組換え D N Aを有する個体を育成す るには、 公知の組織培養法により器官あるいは個体を再生させればよい。

以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。

1 ：バレイショ P FKの精製

バレイショ品種 Recordあるいは Maris piper の塊茎 5 k gから Kruger等の方法 (Arch. Bioichem. Biophys." 261- 690-700. 1988 )に従って P F Kを精製した。 但 し、 AT Ρァガロースカラムクロマ トグラフィ一を行ったのちモノ Qカラムクロ マトグラフィ一は行わず、 4 M尿素を含むドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル アミ ドゲル電気泳動 （SDS— PAGE) により分画、 精製した。 具体的には、 PFK活性を含む画分を限外濾過により約 0. 5m lに濃縮したのち、 等量の試 料用緩衝液 （62.5 mM Tris-HCl(pH6.8), 2% SDS, 5 % 2—メルカプトエタノー ル、 10% グリセロール、 4 M尿素、 0.001!¾ ブロムフエノールブルー） を加え 65°Cで 10分間加熱処理した試料を電気泳動に供試した。 ゲル組成は、 Kruger 等の方法 (Arch. Bioichem. Biophys. 267, 690-700. 1988 )に従った。 泳動後のゲ ルをクマシ一ブリ リアントブル— R— 250 (CBB) で染色したのち分子量約 53 kDaの PFKポリぺプチドを含む部分を力ミソリで切り出した。 ポリぺブ チドはバイオラッ ド社製電気溶出装置 （Model422 Electroeluter) を使ってゲル から溶出し、 5 OmM重炭酸アンモニゥム、 0. 001 %SD S溶液中で透析 後、 真空乾燥した試料を最終精製標品とした。

2 ：バレイショ PFKのアミノ酸配列の決定

Kruger等の方法（Arch. Bioichem. Biophys. 267, 690-700. 1988 ：)に従って、 V 8プロテア—ゼ (Staphylococcus aureus 由来） で消化した精製 PFK標品 は、 Kruger等の方法（Arch. Bioichem. Biophys. 261, 690-700. 1988 )に従って SDS— PAGEで分画したのち、 電気的に PVDF膜 （Millipore ) に転写し た。 転写されたポリべプチドを CBBで染色したのち染色バンドを PVDF膜と 共に力ミソリで切出し、 N末端アミノ酸配列決定に供試した。 精製 PFKの N末 端アミノ酸配列の決定には、 PFK最終精製標品をそのまま供試した。 解析は、 固相あるいは気相シークェンシング法により行った （リーズ大学生化学部あるい はケンブリ ッジ大学生化学部に委託） 。 いずれの試料からも精製 PFKの N末端 アミノ酸配列が得られ、 その結果を表 1に示した。 このアミノ酸配列をデータべ —ス検索 （The Swiss Prot data bank (Release 23) ) により既知のタンパク質 のァミノ酸配列と比較したが有意な相同性は見られなかった。

1 決定 し たバ レ イ シ ョ 塊茎 P F Kの N末端 ア ミ ノ 酸配列

N末端側か ら

Thr Glu Ser Asn Tyr Gin Met Lys Val Val Lys Gly Asp Tyr Gly Tyr Val Leu Glu Asp Val ？ ？ Leu

Val Glu Asp

Ala

3 ：決定したバレイショ PFKの部分的ァミノ酸配列をコードする DN Aの合成 決定したァミ ノ酸配列に基づき、 表 2に示した DN A配列を DN A合成機

(Applied Biosystems) でマニュアルに従って合成し、 下記のポリメラーゼチェ イン反応 （PCR) にプライマ一として使用した。

表 2 決定したアミノ酸配列をもとに合成した DNAプライマー プライマー名 DNA配列 （ 5' 3' ) 組合わせ数

N 10 ACGGAAAGTAATTATCAAATG 256

A GTC C C G T C

N 2 OR I ： TCCTCGAG I ACGTA I CCGTA 64

T A A A A T

C

* A： アデニン、 T： チミ ン、 G： グァニン、 C ： シトシン、 I ： イノシン 4 ：ポリ （Α) + RNAの調製

5 ° Cで 4力月貯蔵したバレイショ品種 Brodick の塊茎、 品種 Recordあるいは Brodickの塊茎芽生えから SDS-フヱノール法により全 RNA を単離した。 RNAから ポリ （A) + RNAの精製は、 ダイナビーズ mRM 精製キッ ト（DYNAL) を用い、 添付されているマニュアルに従って行なった。

5 ： cDNA合成

単離したポリ （A) + RN Aを铸型として、 オリゴ dT(12-18) あるいはラン ダムへキサヌクレオチドをプライマ—として RNase H- free逆転写酵素 (BRL) - を使い、 まず 1本鎖 c DNAを合成した。 次に、 cDNA合成キッ ト （Amersham) を 使い 2本鎖 c DN Aを合成した。 ここで合成した 1本鎖 c DNAは下記の P CR の铸型として、 2本鎖 c DN Aは下記の c DN Aライブラリ一の作成に使用し た。 cDNAの合成方法は、 試薬あるいはキッ 卜に添付されている方法に従つ

6 ： A tlO cDNA ライブラリーの作成

品種 Brodick塊茎のポリ （A) + R N Aからオリゴ d T (12- 18) をプライマー として合成した、 あるいはを品種 Recordの塊茎芽生えのポリ （A) + RNAから ランダムへキサヌクレオチドをプライマ一として合成した 2本鎮 c DN Aを使い AgtlO cDNA ライブラ リーを作製した。 AgtlOcDNAクローニングキッ ト

(Amersham) を使い、 添付されているマニュアルに従ってライブラリーを作成し た。 但しキッ トに含まれるアダプタ―は用いず、 Eco Rl/Not 1アダプタ―

(Pharmacia LKB)を使用した。

7 ：精製した PFKの N末端部分をコ—ドする c DNAの単離

表 1に示すァミノ酸配列をもとに DNA合成機で合成した N 10、 N 20 R I (表 2) 各 500 pmo 1をプライマーとして、 品種 Recordのゲノム DN Aある いは Brodick芽生えポリ （ A) + R N A由来の一本鎖 c D N A各々 1. 0、 0. 1 gを铸型として P CRを行った。 緩衝液は T a qポリメラーゼ （Ampri Taq:Perkin-Elmer Cetus) に添付されているものをマニュアルに従って使用し た。 酵素は 2. 5 U、 各ヌクレオチドは 20 nmo 1ずつ加え、 総容量 100 / 1で反応を行った。 94°C 1分、 50°C 2分、 72°C 2分の一連の反応を 35回繰り返したのち 72°Cで 10分反応させた。 反応液の一部を取り、 4%ァ ガロースゲル電気泳動で解析したところ、 いずれの D N Aを铸型にした場合も約 60塩基対の P CR産物が検出された。 これら約 60塩基対の DNAをプラスミ ドベクタ一 pCRlOOO (Invitrogen) に添付されているマニュアルに従ってサブク 口—ニングした。 その結果、 数多くの組換えプラスミ ドを有する大腸菌コロニー を得た。 このうち、 約 60塩基対の挿入断片を持つ 7クローン （Record cDNA 由 来 4クローン、 Brodick ゲノム DNA由来 3クローン） から常法に従ってプラス ミ ドを回収した。 これら 7クローンが有する PCR産物の塩基配列をジデォキシ チェインターミネーション法で決定した。 SEQUENASE Var2 (U. S. Biochemical Corp ) を使い、 添付されているマニュアルに従って塩基配列を決定した。 1クロ -ンを除き他の 6クローン （Record cDNA 由来 4クローン、 Brodick ゲノム DNA由来 2クローン） は共通の DNA塩基配列 （2 3塩基対） を有していた。 こ の 2 3塩基を DNA合成機で合成したものを PFK 2 3 (表 3) と名付け、 下記 の P CRのプライマーとして、 あるいは cDNAライブラリ一のスクリ一ニングの際 にプローブとして使用した。

表 3 P FK 2 3の DNA塩基配列 （5， →3' )

ATGAAGGTGGTGAAAGGAGATTA

8 ：部分長 PFK c DNAの単離

品種 Record芽生えス gtlO c DNAライブラリ— （1 5万 pfu) をプレートライ セート法で増幅したのち精製した； I DNA 1. O ^ gを铸型として、 PFK 2 3 と； IgtlOの DNA塩基配列を持つ; 11232 (表 4) 各 1 0 0 pmo 1をプライマ一 として P CRを行った。 アニーリング温度が 6 0°Cである点を除き、 反応条件は 前出の P CRと同様である。 その結果、 約 6 0 0塩基対の P C R産物が得られ た。 この P CR産物を前出のプラスミ ドベクター pCRlOOOにサブクロ—ニング し、 得られた組換えプラスミ ドの 1つを pPFKOlと命名した。 プラスミ ド pPFKOlに 挿入されている P CR産物の DN A塩基配列を前出の方法に従って決定した。 DN A 基配列からァミノ酸配列を推定したところ、 一部は既知の P FKのァミ ノ酸配列と有意な相同性を示した。 また 5' 末端には上記の精製 PFKから決定 されたアミノ酸配列をコ—ドする DN A塩基配列が存在した。

9 ：完全長 PFK c DNAの単離

プラスミ ド pPFKOlを制限酵素 Not 1 で切断して得られる約 6 0 0塩基対の DNA断片を放射性同位元素 32 Pで標識し、 これをプローブとして品種 Brodick 塊茎ス gtlOcDNAライブラリー （約 4 0万 pfu ) をブラ—クハイブリダイゼ—ショ ン法によりスクリーニングした。 その結果、 5 7個の独立の陽性ブラ—クを得 た。 このうち 24プラークを無作為に選び、 上記約 600塩基対の DNA断片と PFK 2 3をプローブとして 2次スクリ一二ングを行った。 その結果、 1 1クロ —ンが両標識プローブに対し陽性であった。 更に三次スク リーニングの後、 これ ら独立の 1 1クローンからプレートライセ一トを調製した。 ライセ一ト 10 1 を铸型として、 また表 4に示した合成 DNAス 1232およびス 1231各 50 pmo 1 をプライマーとして P CRを行った。 ァニーリング温度が 60°Cである点を除 き、 前出の P CRと同様に反応を行った。 PCR産物を 0. 8%ァガ口—スゲル 電気泳動で解析した結果、 λ DNAの部分を除いた c DNA断片のみの長さは約 1700 - 2200塩基対と推定された。 前出の約 600塩基対の DNA断片を 放射性同位元素 32Ρで標識したプローブを使い、 バレイショ塊茎ポリ （Α) + RNAを常法に従ってノーザン解析したところ、 P CRの結果とほぼ一致する約 2000-2300塩基のポリ （Α) + RN Αが検出された。 これらの 1 1個の igtlOクローンから制限酵素 Not 1 で切出された挿入 DNA断片部分をプラスミ ドベクター pBruescript SK II(-) (Stratagene) の制限酵素 Not 1 認識部位に サブクロ一ニングした組換えプラスミ ドを pPFK16、 17、 19、 26、 28、 29、 31、 32、 33、 34、 35と命名した。

表 4 P CRに用いた； IgtlO由来のプライマ—の DNA塩基配列 （5'→3') λ 1232 ： CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA

λ 1231 ： AGCAAGTTCAGCCTCGTTAAG

PPFK32の cDNA揷入断片については全 DNA塩基配列 1978塩基対を前出 の方法に従って決定し、 アミノ酸配列と共に配列表の配列番号 1に示した。 決定 した精製 PFKの N末端ァミノ酸配列 （配列表の配列番号 1中の第 3番目のスレ ォニンから第 26番目のロイシンまで （もっとも、 精製 PFKの第 24、 25番 目のァミノ酸は表 1に示すように決定できなかった） ） を含む 485アミノ酸に 翻訳される 1455塩基対からなる領域を有していた。 推定アミノ酸配列から、 精製バレイショ塊茎 P F Kポリぺプチドの N末端よりも 2ァミノ酸上流に開始コ ドンにコー ドされるメチォニンがあった。 推定分子量は 53· 8キロダル卜ンで、 Kruger等 (Arch. Bioichem. Biophys. 267, 690-700. 1988 ) が推定したバレイシ ョ塊茎 PFK— dポリべプチドの分子量 53キロダルトンとほぼ一致した。 133 ― 135番目の ATGが P FKの開始コドンである理由は、 まず、 この AT Gの 前にフレームの異なる終止コ ドン （例えば TG A : 1 5— 17番目、 TAA : 26— 28番目、 TGA : 55— 57番目） が存在し、 単離した c DNAの 1番 目の塩基 C以前に AT Gがたとえ存在してもそれは P FKの開始コドンとはなら ないからである。 また、 36— 38番目に ATGが存在するが、 90— 92番目 に終止コドン （TGA) が同じフレームで存在し、 この ATGは P FKの開始コ ドンにはならない。

《単離した cDNAにコ—ドされる PFKの特性》

10 ：植物 P F K遺伝子の大腸菌での発現

単離した遺伝子がまちがいなく酵素活性を持つ PFKをコ―ドする遺伝子であ ることを証明するためには、 その遺伝子を実際に発現させる必要がある。 そこ で、 単離した遺伝子を下記のように大腸菌に導入してその発現を試みた。

まず、 プラスミ ド _PPFK32 250 n gを铸型として、 制限酵素 Eco Rl、 Pst 1 認輕部位をそれぞれ導入した P FK 32と PFK32R (表 5) 各 30 p gをプ ラ 、：'一として P CRを行った。 アニーリ ング温度が 30、 35あるいは 40 °C であること、 反応回数が 5回であるこ と、 D NAポ リ メ ラーゼと して p f u DNAポリメラーゼ （Stratagene) を使用したことを除き、 前出の方法と 同様に反応を行った。 PCR産物を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で分画後、 目的の約 1800塩基対のバンドを切り出し、 常法に従って DN Aをゲルの中から回 収した。 この約 1800塩基対の DN Aを制限酵素 Eco Rl、 Pst 1 で切断後、 制限酵 素 Eco Rl、 Pst 1 で切断した大腸菌発現プラス ミ ドベク ター pKK223- 2

(Pharmasia LKB ) に組込んだ。 この組換えプラスミ ド （pKK32 ) を常法に従つ て大腸菌 XL 1—B l u e (Biotechniques. 5, 4. 376-378， 1987) に導入後、 抗生物質力—ペニシリ ン （ 50 c g /m 1 ) を含む Luria- Bertani (以下し Bと 称する） 寒天培地上、 37° Cで一晩培養した。 出現した多数のコロニーの中か ら 1 10個を選び、 プラスミ ド p PFK32から制限酵素 Not 1 で切り出される 約 2000塩基対の DNA断片を放射性同位元素 32Pで標識し、 これをプローブ としてコロニーハイブリダイゼ―ションを行った結果、 66個の陽性コロニ—を 得た。 これらバレイショ P FK遺伝子の導入が確認された大腸菌は、 微生物 PFKとは活性制御の受け方の異なる PFKが発現して代謝を乱すためか、 ィソ プロピル^— D—チォガラク トピラノシ ド （以下 I PTGと称する） ImMを含 む LB寒天培地上ではほとんど生育できなかった。 そこで、 以下のように大腸菌 に導入した P FK遺伝子を発現させた。 まず、 力—ペニシリ ン （50 / g/ m 1 ) を含む L B液体培地中で 600nm吸光値が 0.3-0.7 になるまで 37 ° Cで振 盪培養した。 次に I PTG (ImM) を加え、 一定時間振盪培養後菌体を回収 し、 Tabita等の方法 （Anal. Biochem. 84. 462-472, 1978) に従いトルエンで溶 菌後、 P FK活性を Kruger等の方法 （Arch. Bioichem. Biophys. 267. 690-700. 1988 ) に従い測定した。 大腸菌 No. 58株は、 コントロールの大腸菌 No. 1 株 （PKK223- 2を導入） に比べ約 7倍高い PFK活性を示した （図 1 ) 。

表 5 制限酵素 Eco Rl、 Pst 1 認識部位を導入した PCRプライマ—の DNA 塩基配列 （5' →3' )

P FK 32 TATATATTTGGAATTCATGGGTACTGAG

Eco R1

* 氺

PFK 32 R CAAAAGACCCTGCAGCCACACAG

Pst 1

木： ミ スマツチ部位 次に、 大腸菌 No. 58株の持つ高 PFK活性が植物 PFKに由来するのか、 それとも大腸菌 XL 1 -B 1 u eの PFK活性に由来するのかを調べるため、 免 疫滴定実験を Kruger等の方法 （Arch. Bioichem. Biophys. 267, 690-700. 1988 ) に従って行った。

免疫滴定実験の結果、 大腸菌 N o. 58株の持つ高 PFK活性は抗大腸菌 PFK抗体ではほとんど除去されなかったが、 抗バレイショ PFK— c抗体 （ォ ックスフォード大学植物科学部 Kruger博士から譲渡） では有意に除去された （図 2) 。 この抗バレイショ P FK— c抗体は、 ノくレイショ PFK— cおよび PFK 一 dと強く反応し、 大腸菌 P F Kとはほとんど反応しないことがゥヱスタンプ口 ッ ト解析、 あるいは免疫滴定実験により確認されている。

以上の結果から、 大腸菌 No. 58株で I PTG誘導発現した蛋白質は間違い なくバレイショ P FKであると同定され、 プラスミ ド p P FK 32に揷入されて いる c DNAはバレイショ P FK遺伝子と同定された。

1 1 ：バレイショ P FKと他生物 P FKのァミノ酸配列の比較

p PFK 32の有するバレイショ P FKをコードする c DN Aの塩基配列から 推定したァミノ酸配列をデ—夕べ一ス （The Swiss Prot data bank (Release 23) ) 検索により既知の P FKアミノ酸配列と比較した。 報告のある PFKと数十％ 以下の相同性しか示さなかったが、 相同部位は PFKを特徴付ける基質、 補酵 素、 制御物質の結合部位 (Evans, P. R and Hudson, P. J. (1979) Nature. , 279, 500-504 ) とその周辺部に集中していた。 有意な相同性を示した領域はアミノ酸 番号でおよそ 98— 321であり、 アミノ酸番号 1— 97、 322— 485の N 末端、 C末端領域では、 報告のある他生物 PFKと有意な相同性はほとんど見い 出せなかった。 報告のある真核生物 PFKは F 6 Pが結合する触媒部位と、 それ とアミノ酸配列が良く似ているフルクロース- 2, 6-ニリン酸が結合する制御部位 の 2つが 1本のポリべプチド鎖上にあるデュプリケート構造を有している。 今回 単離した植物 P F K遺伝子の塩基配列から決定されたァミノ酸配列はそのような 構造を持たないことが明らかになった。 また、 他生物 P FKに共通して保存され ているアミノ酸であるにもかかわらずバレイショ P FKでは保存されていないァ ミノ酸が F 6 Pの推定結合部位のいくつかを含めて数十個も存在した。 以上のこ とは、 植物 PFKが今まで報告のある PFKとは異なる構造、 機能を持つことを 示唆している。

また、 植物には、 プラスチド型と細胞質型の 2種類の PFKがあると言われて いる。 本発明のバレイショ P FK c DNAにコードされる PFKは、 精製タンパ ク質に比べ 2アミノ酸 (Met. Gly) 長い N末端を有しているが、 この相違が精製 によって生じた切断によるものか細胞内で生じた切断によるものか不明である。 しかし、 ァミ口プラストゃ葉緑体といったプラスチドへのポリべプチドの輸送に 関与する トランジッ トぺプチドを持たず、 細胞質型 PFKをコードしていること が明らかになった。 12 ：大腸菌で発現したバレイショ由来 P FKの精製

ノ レイショ P FKの発現が確認された大腸菌 N o. 58株からバレイショ P FKを以下のように精製し、 低温下での安定性について調査した。 約 0. 3 g の菌体を抽出用緩衝液 （lOOmM Tris- HCl(pH8.0)， 2mM MgC12, ImM EDTA, 14mM 2-メルカプトエタノール、 ImM PMSF, ロイぺプチン、 1/ M ぺプスタチ ン） に懸濁後、 超音波破砕し、 50， O O O xgで 30分間遠心後、 上清を回収 した。 次に、 抽出用緩衝液にグリセロールを 10% (v/v) 添加した緩衝液 A で平衡化したシバクロンブル一ァガロース （type3000— C L、 Sigma ) カラ ム （16X55mm) に上清を掛けた。 この操作により大部分の大腸菌 P F Kは ゲルに強く吸着し、 バレイショ PFKの大部分は、 吸着せずフロースルーとして 回収された。 次に、 回収液を緩衝液 Aで平衡化したリアクティブレッ ド 120— ァガロース （type 3000— CL、 Sigma ) カラム （16X 1 1 Omm) に掛け て PFKを吸着させた。 25m 1の緩衝液 Aで洗浄後、 0— 1. 0MKC 1直線 濃度勾配をつけた緩衝液 A 150m lを使い PFKを溶出した。 PFK活性を含 む画分を集め、 限外濾過 （AmiconPMl 0膜） により 3m 1に濃縮後、 緩衝液 A で平衡化したバイオゲル P— 6カラム （Bio-Rad ) で脱塩した。 最後に、 脱塩し た試料を緩衝液 Aで平衡化したモノ Qカラム （0. 5X50mm， Pharmacia LKB ) に掛けた。 5 m 1の緩衝液 Aで洗浄後、 0— 1 · 5 MK C 1直線濃度勾配をつ けた緩衝液 A 150m lを使い PFKを溶出した。 P F K活性を含む画分を集め 精製標品とした。 精製標品を尿素 ZSDS— PAGEで分画後、 ゲルを CBB染 色、 あるいはニトロセル口一スフィルターにポリペプチドを転写し、 抗バレイシ ョ PFK— c抗体を使ったウェスタンブロッ ト解析を行った結果、 両者とも 53 キロダルトンのポリペプチドを検出した （図 3) 。 この結果、 単離した PFK遺 伝子は PFK— dをコードすることが判明した。

13 ：大腸菌で発現したバレイショ P F Kの低温耐性の確認

この精製した P F Kを使用し酵素活性の低温安定性を 0〜 25ての温度範囲で Hammond等の方法 （Planta 180， 613-616, 1988)に従って調査した。 低温下での 酵素の安定性を示す指標として Q 10値を使用した。 X軸に温度、 Y軸に酵素活 性の対数を取ったグラフのある温度での傾きを d y/d xとすると、 d v/d x =0. l l o gQ I Oで表される。 大腸菌で発現させたバレイショ品種 Brodick 由来の P FKは 0°Cの低温下で Q 10値が 2. 42という低い値を示し、 25 °C の室温下の Q 10値 1. 66に比べてもさほど変化しなかった （表 6) 。 プラス ミ ド p P FK 32に揷入されている c D N Aがコ— ドする P F Kの 5 °Cでの Q10値は 2. 24であったが、 この値を他の報告されている P FKの Q 10値 と比較してみると、 大腸菌 P FK— 1では 5°Cでの Q 10値が 2. 89 (Kruger, N.J. (1989)Biochemical Society Transaction 629th Meeting, London Vol.17760 -761) .、 低温低糖性を有さないバレイショ品種 Recordの塊茎 P F Kでは、 2— 6 °Cでの Q 1 0値が 3. 1 0 (P F KIII ) および 4. 2 0 (P F KIV) (Hammond, J. B. W. et al. Planta (1990)180.613-616) であり、 本発明で単離し たバレイショ P F K遺伝子にコードされる P F Kが、 大腸菌 P F Kや低温低糖性 を有さな t、バレイショ品種の P F Kに比べ有意に低温耐性を有していることが証 明された。 また PFKと基質 F 6 Pを巡って競合関係にあるスークロース合成系 の律速酵素 S P Sの Q 10値は、 2— 10°Cで 2. 25と ap Rees等が報告して いるが (Plants and Temperature ed. Long, S. P. and Woodward, F. I.) Society of Experimental Biology Seminor Series No. 42. Cambridge, UK; Cambridge University Press, pp.377 - 393)、 本発明の PFKは SPSと同レベル の低温耐性を有している （表 6) 。 よって本発明の PFK遺伝子を、 低温貯蔵中 の塊茎で強く発現するプロモータ一の支配下で発現させることにより、 低温貯蔵 塊茎中のスークロース含量の低いバレイショ品種を開発することができ、 その結 果、 低温低糖性 （グルコース、 フルク ト一ス含量の低い） バレイショ品種を作出 できる。

表 6 大腸蘭で発現させたバレイショ P FKの Q 10値 温度 (°C) 0 1 2 5 7 10 15 20 25

Q 10値 2.42 2.38 2.35 2.24 2.18 2.10 1.93 1.79 1.66

14 ：種々植物 PFK遺伝子の単離 単離したバレイショ P FK c DNAをプロ—ブとして、 種々植物 P FK遺伝子 の単離を試みた。 イネ （品種月の光） 未熟胚由来カルス、 トウモロコシ胚乳由来 カルス、 フラベリア緑葉、 ラディッシュ緑葉から前述のバレイショと同様の方法 で mRNAを単離し、 以下の方法で c DNAライブラリーを作成した。 イネ、 フ ラベリア、 ラディ ッシュ c D N Aライブラリ一は、 TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmasia) ヽ ス ZAP Π Cloning kitCStrstagene)ヽ Gigspsckll Gold (Stratagene) を使用し、 添付されているマニュアルに従って作成した。 トウモロ コシ c D N Aライブラリ一は、 cDNA Synthesis Kit(Amersham)、 λ gtlO cDNA cloning kit (Amer sham) を用いて、 キッ トに添付されているマニュアルに従って 作成した。

作成した cDN Aライブラリ一から、 P FK c DNAが組み込まれたラムダフ ァ一ジをブラ一クハイブリダィゼーシヨン法によって単離した。 その際、 前出の プラスミ ド pPFK32から制限酵素 Not Iを用いて切り出される約 2キロ塩基対の DNA断片を放射性同位元素 32Pで標識しプローブとして使用した。 その結果、 作成した全ての cDN Aライブラリ—から本プローブと反応する陽性ブラ—クを 得ることができた。 トウモロコシ PFKc DNAは、 プレートライセ一ト法を使 つて精製した； I D N Aを制限酵素 EcoR Iで消化し、 P F K c D N Aを含むィンサ 一ト部分をプラスミ ド pBluescr ipt SK Π (-) (Stratagene) にサブクロ—ニング 後、 前出のバレイショ PFKと同様の方法で DN A塩基配列を決定した。 その他 の植物 PFKcDNAは、 λΖΑΡ Π Cloning kit (Stratagene)に含まれるヘルパ 一ファージ （ExAssist helper phage(M13)) と大腸菌 （SOLR strain ) を使い、 添付されているマニュアルに従ってプラスミ ド pBluescript SK(-) (Stratagene) にサブクロ—ニング後、 前出のバレイショ P FKと同様の方法で DNA塩基配列 を決定した。 フラベリア、 イネ、 トウモロコシ、 ラディッシュ P FKの DNA塩 基配列を各々配列表の配列番号 3、 5、 7、 9に示し、 DNA塩基配列から推定 されるアミノ酸配列を各々配列表の配列番号 4、 6、 8、 10に示した。 いずれ の植物 P F Kァミノ酸配列もバレイショ PFK— dァミノ酸配列 （配列表の配列 番号 2) と非常に高い相同性を示したが、 報告されている細菌、 ほ乳類、 酵母等 の他生物 PFK塩基配列との相同性はそれに比べ有意に低かった。 今回バレイシ ョ P FK遺伝子をプローブに使用して P FKが単離された植物は、 単子葉植物 (イネ、 トウモロコシ） 、 双子葉植物 （フラベリア、 ラディ ッシュ） の両者を含 み、 植物種では、 イネ科 （イネ、 トウモロコシ） 、 キク科 （フラベリア） 、 十字 花科 （ラディッシュ） と広範囲に渡り、 配列表の配列番号 1に示したバレイショ PFKcDNAは種々植物 PF K遺伝子の単離に広く利用できることが証明され た。

また種々植物 PFKのァミノ酸配列を比較した結果、 種々植物に共通して存在 するアミノ酸配列 （5アミノ酸以上） が 1 3箇所見つかった （表 7) 。 この中に は、 報告のある他生物 PFKには存在しない植物特異的なアミノ酸配列が含まれ ている （配列表の配列番号 1 1、 14、 21、 22) 。 特に、 配列表の配列番号 22に示したアミノ酸配列は、 この配列が PFKポリべプチド上に存在する位置 から判断して、 細菌 P FKで報告されている基質 F 6 Pの結合部位およびその近 傍のァミノ酸配列 （Leu Gly His Val Gin Arg Gly Gly付近） に相当すると考え られる （Evans, P. R. and Hudson, P. J. (1979)Nature. , 279, 500-504 ) 。 この 基質結合部位およびその近傍のアミノ酸配列は、 他生物間では非常に良く保存さ れているが (Heinisch, J. et al. , (1989) Gene. , 78, 309 - 321 ) 、 植物ではこ のァミノ酸配列は全く存在せず、 そのかわり配列番号 22に示した別のァミノ酸 配列が共通配列として存在することが明らかになった。

以上のように、 配列表の配列番号 1に示したバレイショ P F K c DN Αは、 種々植物 P F K遺伝子の単離にプローブとして利用可能であることが証明され た。 また、 種々植物 PFKアミ ノ酸配列の比較から、 植物 PFKに共通して存在 すると考えられるアミノ酸配列 （表 7) が同定され、 例えば、 PCR法を利用し て植物から P F K遺伝子を単離する際に D N Aプライマー合成の参考になるアミ ノ酸配列が本発明によって供給された。 さらに、 他生物 P FKには存在すること が報告されていないが植物 P FKには共通して存在すると考えられるァミノ酸配 列が同定された。 つまり、 本発明によって植物 P FKを特徴づけるアミノ酸配列 (配列表の配列番号 1 1、 14、 21、 22) が初めて同定された。 表 7 種々植物 P F Kに共通のアミノ酸配列

(番号は配列番号 1中のァミノ酸番号に対応）

(1) Arg Ala Gly Pro Arg

80

(2) lie Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Leu Asn

100 105

(3) Gly Tyr Arg Gly Phe

135

(4) He Val Asp Ser lie Gin

175

(5) Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie

220

(6) Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu

230 235

(7) Ala Gin Arg Ala He Asn

240

(8) Val Lys Leu Met Gly Arg

260 265

(9) Ser Gly Phe He Ala

270

(10) Ala Glu Gly Ala Gly Gin

320

(11) Asp Ala Ser Gly Asn

340

(12) Leu Lys Tyr lie Asp Pro Thr Tyr Met

370 375

(13) Cys Leu He Pro Glu

285 1 5 ：植物形質転換用プラスミ ドベクタ—の構築

バレイショ品種 Brodick の低温耐性遺伝子を植物に導入するために、 図 4に示 したプラスミ ド pPFK(35S) を作成した。 以下にプラスミ ド pPFK(35S) の詳しい作 成方法を述べる。 まず、 制限酵素 Hind ΙΠ、 Not I、 Bgl Π、 BamH I、 EcoR I , Sma

I、 Pst I、 Sst I、 Bel I、 Bgl Π、 Not I、 EcoR Iの認識配列をこの順番に 含むポリ リ ンカ— (Agricultural Genetics Company, Cambridge, United Kingdomより入手） を制限酵素 HindHU EcoR Iで消化したプラスミ ド pUC19 に連結 し、 これを pUC19(PL) と命名した。 次に、 プラスミ ド pAPT9 (Agricultural Genetics Company, Cambridge, United Kingdomより入手） から制限酵素 Sst I、 BamH Iによって切り出されるノパリ ン合成酵素遺伝子のポリアデニレ一ションシ グナル配列 （約 0 . 3キロ塩基対） を制限酵素 Sst I、 Bcl Iで消化した _PUC19 (PL) に連結し、 これを pUC19(nos term) と命名した。 次に、 パタチン （patatin

) プロモーター配列部分をプラスミ ド pBI240. 7 (Bevan et al. , Nucleic Acid research 14:4625-4638, 1986) から制限酵素 Bgl Π、 BamH Iを使って約 2. 3キ 口塩基対の断片として切り出し、 制限酵素 Bgl Π、 BamH Iで消化した pUC19(nos term) に連結し、 これを pUC19(pat/nos term) と命名した。 次に、 前述のプラス ミ ド pKK32 から制限酵素 EcoR I、 Pst Iを使って低温耐性 P F K遺伝子 （約 1 . 8キロ塩基対） を切り出し、 制限酵素 EcoR I、 Pst Iで消化した pUC19(pat nos term) に連結し、 それを pPFK(pat) と命名した。 次に、 プラスミ ド pPFK(pat) を 制限酵素 EcoR Iで消化後、 大腸菌 D N Aポリラーゼ Iのク レノウ断片（Klenow fragment) で平滑末端化した。 最後に、 この平滑末端化したプラスミ ドを制限酵 素 Sst Iで消化し、 切り出された約 1 . 8キロ塩基対の低温耐性 P F K遺伝子 を、 制限酵素 Sma I 、 Sst I で消化したプラス ミ ド pROK2 (pBinl9由来 ： Baulcombe, D. et al. , (1986) Nature. , 321, 446- 449)に連結し、 これを pPFK (35S) と命名した （図 4 ) 。

1 6 ：バレイショの形質転換

シェンとフォー ドが報告したエレク トロポレーシヨ ン法 （Shen, W-J and Forde, B. G ( 1989 ) Nucleic Acid Research 17, 8385) を禾 ij用して、 Agrobacterium tumefaciens LBA44Q4 に図 4に示したベクタープラスミ ド pPFK (35S) を導入し、 その菌株を LBA4404(35S/PFKd) と命名した。 次に LBA4404(35S, PFKd) を用いて植物の 1例としてバレイショ品種 Bintjeの形質転換を試みた。 以 下に形質転換法について詳しく述べる。 まず、 バレイショ品種 Bintjeのウィルス フリ一無菌植物体はスコテツシュアグリカルチユラルザ一ビスエージヱンシ一 (Scottish Agricultural Services Agency, Edinburgh, United Kingdom) より 購入した。 購入したインビトロ植物体から複数の単節を無菌的に切り出し、 各節 をリ ンスマイァ—とスクーグの培地 （以下 L S培地と称する） （Linsmaier, E. and Skoog, F. (1965) Physiol. Plant. , 18， 100-127) の無機塩、 スクロース

30 gZL、 寒天 8 gZLを含む固形培地に置床し培養することによって無菌植 物体を増殖した。 この増殖した植物体の茎ある 、は葉を以下の形質転換に利用し た。 無菌的に切り出した茎 （長さが約 0. 5— 2. 0 cm) あるいは葉 （縦が約 0. 6— 1. 0 cm、 横が約 0. 5— 1. 0 c mの大きさ） は、 L S培地の無機 塩、 30 gZLのダルコ—スを含む液体培地中で LBA4404(35S/PFKd) と 25°Cで

48時間共存培養した。 共存培養開始時の LBA4404(35S/PFKd) の濃度は約 108 細胞 ZmLに調整した。 共存培養終了後、 茎あるいは葉の切片を抗生物質セフォ タキシム （cefotaxim：) を 250 m g ZL含む滅菌水で数回洗浄した。 洗浄後、 笠岡らが報告した KS 1培地 （特開平 6— 133783) に茎あるいは葉の切片 を置床した。 置床後約 20日で抗生物質カナマイシン （kanamycin ) 抵抗性カル スが出現し、 更に 10— 30日培養を続けるとカルスから植物体が再分ィ匕した。 このカナマイシン抵抗性を示す植物体を単節毎に切断し、 各々を L S培地の無機 塩、 スクロース 30 gZL、 セフオタキシム 250mg/L、 カナマイシン l O OmgZL、 寒天 8 gZLを含む固形培地に置床し培養することによって力 ナマイシン抵抗性植物体を増殖した。 増殖した植物体は、 ポッ 卜に移植後、 温室 で栽培した。 コントロールには、 非形質転換体の品種 Bintjeを用いた。 コント口 ール植物体は、 形質転換体と同様に試験管内で無菌的に増殖後、 温室でポッ ト栽 培した。 形質転換植物体およびコントロールの非形質転換植物体は、 ポッ 卜に移 植してから約 4ヶ月後、 植物体が完全に自然枯死した時点で塊茎を収穫した。 収 穫した塊茎は、 低温貯蔵庫 （庫内温度 5. 5-8. 5°Cあるいは 15°C) に貯蔵 した。 この塊茎を以下の種々の解析に供試した。

17 ：形質転換体バレイショにおける低温耐性 P F Kの発現

非形質転換体系統 B 40とカナマイシン抵抗性を有する形質転換体系統 B 75 の茎葉から C TAB法 (Doyle, J.J. and Doyle, J.L. (1987) Phytochemical Bulletin. , 19, 11-15 ) により DNAを抽出し、 Sambrook等の方法 （Molecular Cloning ： A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ) に従ってサザン解析を行った。 具体的には、 DNAを 制限酵素 EcoR Iで消化後、 0 · 8 %ァガロ—スゲル電気泳動により D N A断片を 分離し、 DNAをナイロン膜に転写後、 放射性同位元素 32Pで標識した DN Aプ ローブと反応させた。 プロ—ブとして、 nos terminator領域 （280塩基対） あ るいは前出の rプラスミ ド PKK32 を制限酵素 Bgl Iと Pst Iで消化することによつ て切り出される低温耐性 PFKDNAの 3' 非翻訳領域 （235塩基対） を用い た。 いずれの DNA断片をプローブとして用いた場合も系統 B 75ではテトラプ ロイ ド当たり 5コピ—の遺伝子が導入されていることが確認された （データは示 していない） o

次に温室でポッ ト栽培した系統 40あるいは系統 B 75から収穫した塊茎 (1 5°Cで 2ヶ月貯蔵） から RNAを精製し、 Sambrook等の方法 （Molecular Cloning ： A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ) に従ってノーザン解析を行った。 試料として全 RNA 30 gを用いた。 プロ—ブとして、 前出のプラスミ ド pKK32 を制限酵素 Bgl Iと Pst Iで消化することによって切り出される低温耐性 PFKDNAの 3' 非翻訳領域 （235塩基対） を放射性同位元素 32Pで標識した DN Aを用い た。 その結果を図 5に示した。 系統 B 75の塊茎では非常に強いシグナルが検出 されたが、 非形質転換体系統 B 40では、 全く PFKポリ （A) + RNAは検出 されなかった。 本発明者の経験から、 バレイショ塊茎中の P FKポリ （A) + RN Aをノーザン解析によって検出する場合、 全 RN Aではなく、 さらに精製さ れたポリ （A) + RN Aを試料として使用しなければ検出が困難なことが判明し ている。 このことから判断して、 系統 B 75の塊茎中では通常のバレイショでは 考えられないほど大量の PFKポリ （A) + RN Aが発現しており、 この過剰の PFKポリ （A) + RN Aは導入された低温耐性 P FK遺伝子の転写産物と考え られた。

次に、 収穫後 1 5 °Cで 2ヶ月貯蔵した系統 B 75と B 40の塊茎から Kruger等 の方法 （Kruger, N.J. et al. , (1989) Arch. Biochem. Biophys. , 267, 690-700) に従って粗抽出液を調製し、 ウエスタン解析を行った。 抗体は、 前出の抗バレイ ショ PFK— c抗体を用いた。 その結果を図 6に示したが、 使用した抗体と非特 異的あるいは特異的に反応し検出されたポリべプチドの中で、 系統 B 75と系統 B 40で違いが見られたのはこの P FK— dのみであった。 系統 B 75の塊茎で はコントロール系統 B40の塊茎に比べ約 3— 4倍多い PFK—dポリべプチド が発現していることが判明した。 この結果は、 前出のノーザン解析の結果を裏付 けるものであるが、 系統 B 75では、 PFKポリ （A) + mRNAの発現量に比 ベ PFK— dポリべプチドの発現量は低かつた。 これは外来 P F K遺伝子のポリ (A) + mRNAへの転写量とそのタンパク質への翻訳量の比が、 バレイショ塊 茎が本来有する PFK遺伝子のポリ （A) + mRNAへの転写量とそのタンパク 質への翻訳量の比に必ずしも一致しないことに起因するものと考えられる。

次に系統 B 75と B 40の塊茎 （収穫後 1 5 °Cで 2ヶ月貯蔵） から Kruger等の 方法 (Kruger, N.J. et al. , (1989) Arch. Biochem. Biophys. , 267, 690-700) に 従って粗抽出液を調製し、 PFK活性を測定した。 1回の測定に塊茎 1個を使用 し、 3回の測定値の平均値を表 8に示した。 その結果、 系統 B 75は系統 B 40 の約 1. 3倍高い全 PFK活性を有していることが確認された。 全 PFK活性と は、 Kruger等 (Kruger, N. J. et al. , (1989) Arch. Biochem. Biophys.， 267, 690 -700) が報告した PFK— a、 一 b， 一 c， 一 dの 4種のポリペプチドの種々の 組合せによって構成される P FK I、 Π、 ΙΠ、 IVの活性の合計である。 前出の大 腸菌での発現実験で、 PFK—dポリべプチドのみで活性のある酵素を構築でき ることが証明されたが、 系統 B 75の塊茎で観察された PFK活性上昇は、 導入 された P FK— d遺伝子の過剰発現によってのみもたらされたと考えると、 全 PFK活性が約 1. 3倍の増加したという結果は、 前出のウェスタン解析の結果 - (?? _(1が3— 4倍に増加） と矛盾しない。

次に系統 B 75の塊茎 （収穫後 1 5°Cで 2ヶ月貯蔵） から粗抽出液を調製後、 レツ ドアガロース、 モノ Qカラムを用いて P FK— dを含む P FKIVを部分精製 し、 種々の低温下で PFK活性を測定した。 以下に具体的方法を説明する。 ま ず、 約 20 gの塊茎を約 2— 5 mmの厚さにスライスし液体窒素中で凍結させ、 マイナス 70°Cの低温下で保存した試料を酵素精製に用いた。 以下全ての精製操 作は 4 °Cで行った。 凍結試料は、 4 OmLの抽出緩衝液 （前出の緩衝液 Aに 2mM benzamidine, ImM PMSF, 1 μ M leupeptin, 1 μ M pepstatin, 1%(W V) insoluble polyvinylpyrrolydonを添加したもの） を加え、 乳棒と乳鉢で充分摩砕 した。 摩砕液をミラクロスで濾過後、 濾液を 20, OOOg で 30分間遠心し、 上清を 回収した。 上清をフィルタ-- （0.45 m ) で濾過後、 緩衝液 Aで平衡化したリア ク テ ィ ブ レ ツ ド 1 2 0ァガ口一ス （Type 3000-CL, Sigma ) カ ラ ム

(1 6X 1 1 Omm) に掛けて P F Kを吸着させた。 以後の精製操作は、 前出の 大腸菌で発現させた PFKの精製操作に従った。 モノ Qカラムクロマトグラフィ —によって P FKは 4つのピ―クに分離し、 その中の P FKIVに相当する画分を 回収し種々の温度で PFK活性を測定し Q 1 0値を求めた。 その結果を表 9に示 したが、 部分精製された P FKIVは低温下においても全く安定であり、 その Q 1 0値は 0°Cから 25°Cのいずれの温度においても 1. 9— 2. 0であった。 表 6に大腸菌 No. 58株から精製した PFKの Q 10値を示したが、 その結果 と表 9の結果を比較すると、 両者には同一遺伝子が導入されているが、 系統 B 75の P FKIVは大腸菌 N o. 58株で発現した P F Kに比べ低温に対しより 安定であつた。 また、 系統 B 75に導入された P F K遺伝子は元々バレイショ品 種 Brodick から単離された遺伝子であるが、 Hammond 等 （Ha誦 ond, J.B.I et al.， (1990) Planta. , 180， 613-616) が報告したバレイショ品種 Brodick の P FKIVよりも低温に対し安定であった。 ウェスタン解析の結果から判断して系 統 B 75で発現している PFK— dポリべプチドの 2Z3から 3/4は導入遺伝 子の発現に由来すること、 また Kruger等 （Kruger, N.J. et al. , (1989) Arch. Biochem. Biophys. , 267, 690-700) が報告しているように P F KIVが P F K— d ポリべプチドを主要に含むことから判断して、 B 75の P FKIVで確認された低 温耐性は導入遺伝子の効果である。

以上のように、 図 4に示したベクタープラスミ ドを用いて、 大腸菌で低温耐性 P F Kとして発現することが確認された遺伝子のバレイショへの導入を試みた結 果、 系統 Β 75で導入遺伝子の発現が確認され、 且つ系統 Β 75の P FKIVが低 温耐性を有することが確認された。

表 8 系統 Β 75の塊茎中の全 PFK活性 系統 PFK活性 (nmol 'min/g FW)

B40(コント π-ル） 108.4

B75 141.4

表 9 系統 B 75の塊茎から部分精製した P FKIVの Q 10値 温度 （°c) 2 5 7 10 15 20 25

Q 1 0値 1.91 1.92 1.92 1.93 1.94 1.95 1.96

18 ：低温耐性 PFK遺伝子を導入したバレイショ塊茎の低温貯蔵下での糖含量 の変化およびそれを材料として調製したポテトチップの色の変化

低温貯蔵 （5. 5-8. 5°C) した系統 B 75と B 40の塊茎の糖含量とポテ トチップ色を調査した。 その結果を表 10に示した。 糖としてグルコース含量を 市販の尿糖試験紙 （商品名：テステープ、 塩野義製薬株式会社製） を用いて測定 した。 具体的には、 塊茎 1個当たり 1箇所塊茎表面にスパチュラを強く押し当て て深さ約 5 mmの溝を切り込み、 そこに尿糖試験紙を差し込み、 グルコース含量 を測定した。 グルコース含量は、 変化した試験紙の色を試験紙の容器に添付され ているカラ—スケールと対比させ、 以下に説明したスコアで表示した。 容器のス コア 0、 十、 +十、 + + +、 + + + +は、 それぞれグルコース含量約 0 %、 0. 1%、 0. 25%、 0. 5%、 2%以上に相当する。 表 10に示した値は、 カラ —スケールのスコア 0、 +、 +十、 + +十、 + + +を便宜上それぞれ 0、 1. 0、 2. 0、 3 . 0、 4 . 0とした場合の値として表示している。 表 1 0に示し た値は、 5個の塊茎の測定値の平均値である。 この値は、 低いほどグルコース含 量が低いことを意味している。 その結果、 系統 B 7 5では低温貯蔵 4週間後の塊 茎において、 系統 B 4 0に比べグルコース含量が低いことが判明した。

一般に塊茎のグルコース含量とポテ卜チップ色の間には非常に高い相関関係が あることが知られている (Gray, D and Hughes, J. C. (1978) The Potato Crop (ed. P. . Harris), Capiann & Hall, London, pp. 504-544 ) 。 そこで、 実際に系統 B 7 5、 B 4 0の低温貯蔵 （2週間、 4週間、 1 2週間） 塊茎を材料にしてポテ トチップを調製し、 褐変度を比較した。 具体的には、 塊蓥を市販のスライサ—で 薄切りにし、 これを 1 8 0 °Cに熱した市販の食用油 （なたね油と大豆油の混合 油） の中で通常約 3分から 4分、 気泡が出なくなるまで揚げてポテトチップを調 製した。 ポテトチップは、 1系統 1試験当たり 5個の塊茎から 3枚ずつ、 合計 1 5枚調製し、 それぞれを肉眼によってポテトチップ用カラーカー ド （The Institute for Storage and Processing of Agricultural Produce, Wageningen, The Netherlands作成） と対比させ、 カラ—カードに書かれているスコアで褐変 度を表示した。 このスコアは、 値が高いほどポテトチップの褐変度が低いことを 意味している。 結果を表 1 0に示したが、 各スコアはポテトチップ 1 5枚の平均 値である。 系統 B 7 5では、 低温貯蔵 2週間、 4週間、 1 2週間後のいずれの塊 茎を供試しても系統 4 0に比べ褐変度の低いポテトチップが調製された。

以上のように、 図 4に示したベクタープラスミ ドを用いてバレイショを形質転 換し、 低温耐性 P F Kを塊茎中で発現させることにより、 低温貯蔵塊茎中のグル コースを減少させ、 その結果ポテトチップの褐変を軽減できることが証明され

/ o 表 10

低温耐性 P FKを発現させた系統 B 75のダルコ—ス含量とポテ 卜チップ色 グルコ-ス 含量（カラ-スコア） ポテトチップ 色（カラ-力-ドスコア）

0 4 (週間貯蔵後） 0 2 4 12 (週間貯蔵後）

B40 (control) 1.0 2.6 7.0 4.0 2.6 2.3

B75 1.0 1.2 7.0 5.5 3.7 3.5

配列表

配列番号： 1

配列の長さ ： 1978

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

起源

生物名 ： ソラナムチュベローサム（Solanum tuberosum L. )

品種名 ：ブロディック（Brodick)

組織の種類：塊茎

直接の起源

ライブラリ一名：低温貯蔵塊茎 mRNA由来ス gtlO c D N Aライブラリ— クロ—ン名 ： pPFK32

配列

CTCTTTTCTT GGGTTGACTC AAATTTAACA TATATATGTA TTTTTTTGTT TTTGTGATTC 60 TGTTTTCAGA TACCCTTTTG AATTTCCATT GAGAAAGTTG GAATCTTTTT TGTTTTTATA 120 TATTTGGGGA AG ATG GGT ACT GAG AGT AAT TAC CAG ATG AAG GTG GTG AAA 171

Met Gly Thr Glu Ser Asn Tyr Gin Met Lys Val Val Lys

1 5 10

GGA GAT TAT GGC TAT GTT CTT GAA GAT GTT CCT CAT TTG ACT GAT TAT 219 Gly Asp Tyr Gly Tyr Val Leu Glu Asp Val Pro His Leu Thr Asp Tyr

15 20 25

ATC CCT GAT CTT CCT ACT TAT GAC AAT CCA TTG CGG TCC AAT CCT GCA 267 lie Pro Asp Leu Pro Thr Tyr Asp Asn Pro Leu Arg Ser Asn Pro Ala 30 35 40 45

TAT TCA GTT GTG AAG CAG TAC TTT GTT GAC ATG GAT GAT ACT GTC CCC 315 Tyr Ser Val Val Lys Gin Tyr Phe Val Asp Met Asp Asp Thr Val Pro

50 55 60 CAA AAG GTT GTT GTT CAC AAG GAC AGT CCC AGA GGG GTG CAT TTC CGG 363 Gin Lys Val Val Val His Lys Asp Ser Pro Arg Gly Val His Phe Arg

65 70 75

CGT GCT GGT CCA CGT CAG AAG GTG TAT TTC AGT TCG GAT GAT GTT CGT 411 Arg Ala Gly Pro Arg Gin Lys Val Tyr Phe Ser Ser Asp Asp Val Arg

80 85 90

GCT TGT ATT GTA ACT TGT GGT GGT TTG TGC CCT GGG CTA AAC ACA GTG 459 Ala Cys lie Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Leu Asn Thr Val

95 100 105

ATC AGA GAG ATT GTA CAT AGC CTC GAT TAT ATG TAT GGA GTC AAC AAA 507 lie Arg Glu lie Val His Ser Leu Asp Tyr Met Tyr Gly Val Asn Lys 110 115 120 125

GTC TTT GGT ATC GAT GGA GGC TAC AGG GGT TTC TAT TCC AAG AAT ATC 555 Val Phe Gly lie Asp Gly Gly Tyr Arg Gly Phe Tyr Ser Lys Asn lie

130 135 140

ATC AAT TTG ACA CCA AAG ACT GTT AAT GAC ATT CAT AAA CGT GGT GGT 603 lie Asn Leu Thr Pro Lys Thr Val Asn Asp lie His Lys Arg Gly Gly

145 150 155

ACA ATT CTT GGA TCA TCA CGA GGA GGC CAT GAT ACC ACA AAG ATT GTT 651 Thr lie Leu Gly Ser Ser Arg Gly Gly His Asp Thr Thr Lys lie Val

160 165 170

GAC AGC ATA CAG GAC CGT GAA ATT AAT CAG GTA TAT ATA ATC GGT GGT 699 Asp Ser He Gin Asp Arg Glu lie Asn Gin Val Tyr lie lie Gly Gly

175 180 185

GAT GGA ACT CAG AAA GGA GCA GCT GTA ATA TAT GAG GAA ATC AGG CGG 747 Asp Gly Thr Gin Lys Gly Ala Ala Val He Tyr Glu Glu lie Arg Arg 190 195 200 205

CGT GGT CTC AAA GTA ATT GTT GCT GGG ATC CCA AAG ACA ATT GAT AAT 795 Arg Gly Leu Lys Val lie Val Ala Gly lie Pro Lys Thr lie Asp Asn 210 215 220

GAT ATC CCT GTT ATC GAC AAG TCA TTT GGT TTT GAT ACT GCT GTA GAG 843

Asp lie Pro Val lie Asp Lys Ser Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu

225 230 235

GAG GCT CAA CGT GCC ATA AAT GCA GCT CAT GTT GAA GCT GAA AGT GCT 891

Glu Ala Gin Arg Ala He Asn Ala Ala His Val Glu Ala Glu Ser Ala

240 245 250

GAA AAT GGT ATT GGT GTG GTG AAG CTA ATG GGA CGC TAT AGT GGA TTC 939

Glu Asn Gly lie Gly Val Val Lys Leu Met Gly Arg Tyr Ser Gly Phe

255 260 265

ATC GCA ATG TAT GCC ACT TTG GCG AGC AGA GAT GTT GAT CTC TGT TTA 987 lie Ala Met Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Arg Asp Val Asp Leu Cys Leu

270 275 280 285

ATT CCA GAG TCA CCC TTT TAT CTT GAA GGA GAT GGT GGA CTC TTT GAA 1035 lie Pro Glu Ser Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu

290 295 300

TAC ATT GAA AAA AGG CTC AAA GAA AAT GGG CAC ATG GTT ATT GTG ATA 1083

Tyr lie Glu Lys Arg Leu Lys Glu Asn Gly His Met Val lie Val lie

305 310 315

GCC GAA GGA GCA GGG CAA GAA CTT CTT GCA GAA GAG AAT GCG CAT GCC 1131

Ala Glu Gly Ala Gly Gin Glu Leu Leu Ala Glu Glu Asn Ala His Ala

320 325 330

AAA AAC GAA CAA GAT GCT TCG GGG AAC AAG CTT CTC CAG GAT GTT GGT 1179

Lys Asn Glu Gin Asp Ala Ser Gly Asn Lys Leu Leu Gin Asp Val Gly

335 340 345

TTG TGG ATT TCC CAA AAA ATC AGG GAT CAT TTT GCT ACA AAA ACT AAG 1227

Leu Trp lie Ser Gin Lys lie Arg Asp His Phe Ala Thr Lys Thr Lys

350 355 360 365 ·

ATG CCC ATT ACT CTT AAG TAT ATA GAT CCG ACT TAC ATG ATT CGT GCT 1275 Met Pro lie Thr Leu Lys Tyr l ie Asp Pro Thr Tyr Met lie Arg Ala

370 375 380

GTT CCA AGT AAT GCC TCT GAT AAT GTA TAT TGC ACT CTT CTT GCT CAA 1323 Val Pro Ser Asn Ala Ser Asp Asn Val Tyr Cys Thr Leu Leu Ala Gin

385 390 395

AGT TGT GTT CAT GGA GCA ATG GCA GGC TAC ACA GGT TTC ACC TCA GGA 1371 Ser Cys Val His Gly Ala Met Ala Gly Tyr Thr Gly Phe Thr Ser Gly

400 405 410

CTT GTC AAT GGT CGC CAG ACT TAT ATA CCA TTC AAT CGT ATT ACC GAG 1419 Leu Val Asn Gly Arg Gin Thr Tyr He Pro Phe Asn Arg lie Thr Glu

415 420 425

AAA CAA AAT ATG GTG GTT ATA ACT GAC AGG ATG TGG GCA CGT CTT CTT 1467 Lys Gin Asn Met Val Val lie Thr Asp Arg Met Trp Ala Arg Leu Leu 430 435 440 445

TCG TCA ACC AAT CAG CCA AGC TTC TTG CGC GTG AAA GAC ATT GAA GAG 1515 Ser Ser Thr Asn Gin Pro Ser Phe Leu Arg Val Lys Asp lie Glu Glu

450 455 460

ATT AAA AAG GAG GAG CAG CCG CAA ACT CAA CTG TTG GAT GGG GAT AAC 1563 He Lys Lys Glu Glu Gin Pro Gin Thr Gin Leu Leu Asp Gly Asp Asn

465 470 475

AAT GTA CAT GAG AAC TCA GGT CAC TGATACAGTA ATTACGAACT TGGCGTGACA 1617 Asn Val His Glu Asn Ser Gly His

480 485

CACTGAAGTA ACTCTGTTGT AATCATTTGC CTGTGCAGTG GTTCTCTTGT TGTCTTTGAA 1677 GCTTTTGCTG CTTACCATTG TGCCTTATAA AAACAGTCCT AGGAACTTAT TTGTTGAAGG 1737 TTTTGGGATC TTCTGCATCA GATGTTGGCA GTAGTAACAG ATATATTTCT GCCTAATTCA 1797 TCTAGAGTCC TAATTTCTTG AAGTGAAATT AGACATCTTT TTATAAAATA TTTTGTAATA 1857 AATTTAAATA GTGAGAACAT TTGCTATGCA CATAAATGAT GAACTCTGTG TGGCTGGATG 1917 GTCTTTTGAG ATCTAAAATA GTCCAAGATT TTGGCAGAAA TCAGAAGTAG AGGCAGACTT 1977 T 1978 配列番号： 2

配列の長さ ： 4 8 5

配列の種類：アミノ酸

配列

Met Gly Thr Glu Ser Asn Tyr Gin Met Lys Val Val Lys Gly Asp Tyr

1 5 10 15

Gly Tyr Val Leu Glu Asp Val Pro His Leu Thr Asp Tyr He Pro Asp

20 25 30

Leu Pro Thr Tyr Asp Asn Pro Leu Arg Ser Asn Pro Ala Tyr Ser Val

35 40 45

Val Lys Gin Tyr Phe Val Asp Met Asp Asp Thr Val Pro Gin Lys Val

50 55 60

Val Val His Lys Asp Ser Pro Arg Gly Val His Phe Arg Arg Ala Gly 65 70 75 80

Pro Arg Gin Lys Val Tyr Phe Ser Ser Asp Asp Val Arg Ala Cys lie

85 90 95

Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Leu Asn Thr Val lie Arg Glu

100 105 110

lie Val His Ser Leu Asp Tyr Met Tyr Gly Val Asn Lys Val Phe Gly

115 120 125

lie Asp Gly Gly Tyr Arg Gly Phe Tyr Ser Lys Asn lie lie Asn Leu

130 135 140

Thr Pro Lys Thr Val Asn Asp lie His Lys Arg Gly Gly Thr lie Leu 145 150 155 160

Gly Ser Ser Arg Gly Gly His Asp Thr Thr Lys lie Val Asp Ser lie

165 170 175

Gin Asp Arg Glu lie Asn Gin Val Tyr lie lie Gly Gly Asp Gly Thr 180 185 190

Gin Lys Gly Ala Ala Val lie Tyr Glu Glu He Arg Arg Arg Gly Leu

195 200 205

Lys Val lie Val Ala Gly lie Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie Pro

210 215 220

Val lie Asp Lys Ser Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Glu Ala Gin 225 230 235 240

Arg Ala He Asn Ala Ala His Val Glu Ala Glu Ser Ala Glu Asn Gly

245 250 255

He Gly Val Val Lys Leu Met Gly Arg Tyr Ser Gly Phe lie Ala Met

260 265 270

Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Arg Asp Val Asp Leu Cys Leu lie Pro Glu

275 280 285

Ser Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Tyr lie Glu

290 295 300

Lys Arg Leu Lys Glu Asn Gly His Met Val lie Val lie Ala Glu Gly 305 310 315 320

Ala Gly Gin Glu Leu Leu Ala Glu Glu Asn Ala His Ala Lys Asn Glu

325 330 335

Gin Asp Ala Ser Gly Asn Lys Leu Leu Gin Asp Val Gly Leu Trp lie

340 345 350

Ser Gin Lys lie Arg Asp His Phe Ala Thr Lys Thr Lys Met Pro lie

355 360 365

Thr Leu Lys Tyr He Asp Pro Thr Tyr Met He Arg Ala Val Pro Ser

370 375 380

Asn Ala Ser Asp Asn Val Tyr Cys Thr Leu Leu Ala Gin Ser Cys Val 385 390 395 400

His Gly Ala Met Ala Gly Tyr Thr Gly Phe Thr Ser Gly Leu Val Asn

405 410 415 Gly Arg Gin Thr Tyr lie Pro Phe Asn Arg lie Thr Glu Lys Gin Asn

420 425 430

Met Val Val He Thr Asp Arg Met Trp Ala Arg Leu Leu Ser Ser Thr

435 440 445

Asn Gin Pro Ser Phe Leu Arg Val Lys Asp lie Glu Glu lie Lys Lys

450 455 460

Glu Glu Gin Pro Gin Thr Gin Leu Leu Asp Gly Asp Asn Asn Val His 465 470 475 480

Glu Asn Ser Gly His

485 配列番号： 3

配列の長さ ： 1778

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

起源

生物名： フ ベリアブロウ二— （Flaberia brownii)

組織の種類：葉

直接の起源

ライブラリ一名：緑葉 mRNA由来ス ZAP Π c D N Aライブラ リー

クローン名 ： pPFK- FBI 配列

GTTAACAAGG GGGAAGTT ATG GAT AAT AAC ATC AGT TGT GAG ATG AAA GTT 51

Met Asp Asn Asn lie Ser Cys Glu Met Lys Val

1 5 10

GAA ACA GGG GAT GCA GGC TAT GTG CTT GAA GAT GTG CCT CAC ATA ACT 99 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Tyr Val Leu Glu Asp Val Pro His lie Thr

15 20 25

GAT TAC ATC CCT AAT CTC CCT ACC TAT CCT AAT CCA TTG CGT TCT AAT 147

Asp Tyr lie Pro Asn Leu Pro Thr Tyr Pro Asn Pro Leu Arg Ser Asn

30 35 40

CCT GCA TAT TCG GTT GTG AAG CAG TAC TTT GTT GAT GCG GAT GAT ACC 195

Pro Ala Tyr Ser Val Val Lys Gin Tyr Phe Val Asp Ala Asp Asp Thr

45 50 55

GTG CCT CAA AAG GTT GTT GTA CAC AAG GAC GGT CCA AGA GGA ATA CAC 243

Val Pro Gin Lys Val Val Val His Lys Asp Gly Pro Arg Gly lie His

60 65 70 75

TTT CGA CGT GCT GGT CCT CGT CAA AGG GTT TAT TTT GCA CCA GAT GAA 291

Phe Arg Arg Ala Gly Pro Arg Gin Arg Val Tyr Phe Ala Pro Asp Glu

80 85 90

GTG CAT GCT GCT ATA GTA ACA TGT GGT GGT TTA TGT CCT GGG CTA AAC 339

Val His Ala Ala He Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Leu Asn

95 100 105

ACA GTG ATC AGG GAA ATT GTT TGC GCA CTT TAT CAC ATG TAT GGT GTC 387

Thr Val He Arg Glu lie Val Cys Ala Leu Tyr His Met' Tyr Gly Val

110 115 120

ACC AAA GTT CTT GGG ATT GAT GGA GGG TAC AGA GGT TTT TAC TCA AAA 435

Thr Lys Val Leu Gly lie Asp Gly Gly Tyr Arg Gly Phe Tyr Ser Lys

125 130 135

AAC ACC ATC ACT TTG ACT CCA AAG GTT GTG AAT GAC ATC CAT AAA CGT 483

Asn Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Val Asn Asp lie His Lys Arg

140 145 150 155

GGT GGT ACA ATT ATT GGC ACC TCT CGT GGG GGC CAT GAT AAA CCA AAG 531

Gly Gly Thr lie lie Gly Thr Ser Arg Gly Gly His Asp Lys Pro Lys

160 165 170 ATA GTT GAC AGT ATT CAG GAT CGT GGT ATC AAT CAG GTT TAT ATA ATT 579 lie Val Asp Ser lie Gin Asp Arg Gly lie Asn Gin Val Tyr lie lie

175 180 185

GGA GGA GAC GGT ACT CAA AAG GGA GCA GCT GTT ATT TAT CAG GAA GTG 627 Gly Gly Asp Gly Thr Gin Lys Gly Ala Ala Val lie Tyr Gin Glu Val

190 195 200

AGA AGG CGT GGG CTT AAA GCT GTA GTG GCT GGG ATT CCT AAG ACA ATT 675 Arg Arg Arg Gly Leu Lys Ala Val Val Ala Gly lie Pro Lys Thr lie

205 210 215

GAT AAT GAC ATT CCG GTC ATT GAT AAG TCT TTT GGT TTT GAC ACG GCT 723 Asp Asn Asp lie Pro Val lie Asp Lys Ser Phe Gly Phe Asp Thr Ala

220 225 230 235

GTG GAA GAG GCT CAA CGT GCC ATT AAT GCT GCA CAT GTG GAG GCT GAA 771 Val Glu Glu Ala Gin Arg Ala lie Asn Ala Ala His Val Glu Ala Glu

240 245 250

AGT GCT GAG AAT GGC ATA GGG GTG GTC AAA CTT ATG GGA CGC TAT AGT 819 Ser Ala Glu Asn Gly lie Gly Val Val Lys Leu Met Gly Arg Tyr Ser

255 260 265

GGA TTC ATC GCA ATG TAT GCA ACT TTG GCT AGT CGA GAT GTT GAT TTA 867 Gly Phe He Ala Met Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Arg Asp Val Asp Leu

270 275 280

TGT TTA ATT CCT GAA TCA CCT TTT TAT CTT GAG GGA GAA GGT GGA CTT 915 Cys Leu lie Pro Glu Ser Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Glu Gly Gly Leu

285 290 295

TTA GAA TAT GTA GAA AAA CGT CTC AAG GAC GAT GGA CAC ATG GTC ATC 963 Leu Glu Tyr Val Glu Lys Arg Leu Lys Asp Asp Gly His Met Val lie 300 305 310 315 GTT GTA GCA GAA GGT GCT GGT CAG GAG CTG CTT GCA GCA GAA AAC TTG 1011 Val Val Ala Glu Gly Ala Gly Gin Glu Leu Leu Ala Ala Glu Asn Leu Α6^ΐ IIV0D03IIV IVV3VVI1VV VIVI3IVVVI 3IV OVO IVV V33 OVV OOV DOV DVO 1^ OLf 99^ 09，

^TO dsy naq naq u\ JSS OJJ OJJ ηχο UTO sAq UTO l ηχΰ an ε^ΐ νοΰ ivo on VII ovo xov voo VOD vva wo vvv ovo oio wo xxv

gg^ o

ΐ^Λ dsy ui9 OJJ 3jy naq aqj JSS OJJ UIO usy J¾ J3S J3S na na

56SI 113 3V0 330 VOD 0X1 III 33V VOD VV3 OVV 30V GDI VOL 313 113

96^ OS

3ュ v Βτν dJi Θ« Bay dsy J¾ 9T I Τ^Λ Ι^Λ usy usy UTO sAq ηχο J¾

Α^8Ϊ 03V V30 931 01V 39V IVO 33V VIV 910 110 OVV IVV OVO OVV OVO XOV

92^ 0 9ΐ^

θΐΐ S-iV usv ⁹¾1 OJd 9T I J -iqi S y λχθ usy Τ^Λ ^η9Ί ^ΐΰ J9S Ζ\ DXV IOD IVV 111 VDD IIV IVl I3V OVD VOV 130 IVV 3X0 IXD ΰΟΟ IOV

0 90f- 00，

■HU 3¾i Αχ3 J¾ JA A¾ BIV ϋ χΗΛ Αχο STH Τ^Λ SAQ jas UIQ ^

VDV OXX 300 33V 3VI 000 339 3IV 010 V39 XVD 110 X3I IOV WO 130 568 068 988 08δ

Π9ΐ naq jq SAQ λ "[ usy dsy JSS eiV usy J3S OJJ

B"[y §-tV

80ΖΪ 113 013 XOV 39X 3VX VXO IVV IVO XDI VOO IVV IOV VDO 1X9 300 IOD

9 S 0i8 59B

ST I -ΐΑ jqx ojj dsy STI sA naq jqi an OJJ n OJJ OJJ

99Π 3XV 3XV 3VI I3V V33 IV3 VIV 3VI VVV 313 IOV IXV 130 3IV ODD XD3

098 95ε 098

ΘΤ Ι sAi BTV sqd STH STV sAq an sAq dsy J9S ST I d¾ naq Αχθ T¾ 10Π XIV VVV 103 III 3V3 133 OVV IIV OVV IVO 131 IIV 001 0X1 VOO 3X3 m 9εε

dsy STH naq naq sA usy Axg jas Βχν ^DSV sAq Bfy ュ J9S ュ sA 650Ϊ IVO 3V3 1X3 VI3 VVV IVV VOO 10丄 133 IVO VVV V30 33V VOX X3V VVV

08ε 9Z8 028 Asp Ser Ser Lys Pro Asn Asp lie

480

TTAATGCACA AAAATAATAG CACTGCAAAT TTGGTTTTGT GGATGCAATT CATCATGTTT 1557 TTGCAGAATT TTCAAGATAA AGTTGCTTAT TCTTGACTGG ATTGATCATG GATTTAAGTC 1617 TCTTTGCAGG AATGAATTTT CCTCCAAAAA AAGAAACTGC ATAAAACCTA GTTTTGTTGT 1677 GTTGGGATCA AGCTATTGGT AGTCAAGTTA GAAAGTTTAA GCTGCAGTTT GTAATTGTTT 1737 GTGTTTGTTG GGTTAAGTGG CTTTGTTCAT CAGAAAAAAA A 1778 配列番号： 4

配列の長さ ： 484

配列の種類：アミノ酸

配列

Met Asp Asn Asn lie Ser Cys Glu Met Lys Val Glu Thr Gly Asp Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Val Leu Glu Asp Val Pro His He Thr Asp Tyr lie Pro Asn

20 25 30

Leu Pro Thr Tyr Pro Asn Pro Leu Arg Ser Asn Pro Ala Tyr Ser Val

35 40 45

Val Lys Gin Tyr Phe Val Asp Ala Asp Asp Thr Val Pro Gin Lys Val

50 55 60

Val Val His Lys Asp Gly Pro Arg Gly lie His Phe Arg Arg Ala Gly 65 70 75 80

Pro Arg Gin Arg Val Tyr Phe Ala Pro Asp Glu Val His Ala Ala lie

85 90 95

Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Leu Asn Thr Val lie Arg Glu

100 105 110

He Val Cys Ala Leu Tyr His Met Tyr Gly Val Thr Lys Val Leu Gly

115 120 125

lie Asp Gly Gly Tyr Arg Gly Phe Tyr Ser Lys Asn Thr lie Thr Leu 130 135 140

Thr Pro Lys Val Val Asn Asp He His Lys Arg Gly Gly Thr lie lie 145 150 155 160

Gly Thr Ser Arg Gly Gly His Asp Lys Pro Lys He Val Asp Ser lie

165 170 175

Gin Asp Arg Gly lie Asn Gin Val Tyr lie lie Gly Gly Asp Gly Thr

180 185 190

Gin Lys Gly Ala Ala Val lie Tyr Gin Glu Val Arg Arg Arg Gly Leu

195 200 205

Lys Ala Val Val Ala Gly lie Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie Pro

210 215 220

Val He Asp Lys Ser Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Glu Ala Gin 225 230 235 240

Arg Ala lie Asn Ala Ala His Val Glu Ala Glu Ser Ala Glu Asn Gly

245 250 255 lie Gly Val Val Lys Leu Met Gly Arg Tyr Ser Gly Phe lie Ala Met

260 265 270

Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Arg Asp Val Asp Leu Cys Leu lie Pro Glu

275 280 285

Ser Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Glu Gly Gly Leu Leu Glu Tyr Val Glu

290 295 300

Lys Arg Leu Lys Asp Asp Gly His Met Val lie Val Val Ala Glu Gly 305 310 315 320

Ala Gly Gin Glu Leu Leu Ala Ala Glu Asn Leu Lys Thr Ser Thr Ala

325 330 335

Lys Asp Ala Ser Gly Asn Lys Leu Leu His Asp Val Gly Leu Trp lie

340 345 350

Ser Asp Lys lie Lys Ala His Phe Ala Lys lie Pro Pro Met Pro lie

355 360 365 ISO- Mdd： ベ一 α ^ 一 Γι ^ V Ν αつ Π dVZ 来 EpVN i Cf ： ^y^

( ·Ί BAI^BS BZ 0) ^ ft ： ^

邈¾

篛本: Γ：籙©篛 mm ·· mourn i： ^ou ： ^m

9X1 dsy usy m ^L OL 99^ d sAq J3s J3S dsy χο dsy nsq naq uj^ JSS oュ d OJJ ηχο ηχο uxg

09 99^ og^ sAq UT9 ΤΒΛ ηχο an T¾ dsy UTO ojj S y ^nQl OJJ uxo usy on ¾

-i¾ J3S S Π9Ί 3JV BTV ^dj 1⁹W ^dsV T¾ ΐ¾ usy οε^ ^z

usy UT3 sA ηχο J 9TI S-iV ^sy sqd OJJ an J ュ S-iV ^ΐθ

S 0 S0

usy T^A χο J3S Jqi 9¾j χ^ J¾ ι Αχο BTV ϋ ΐ¾ ^TO ^STH

00， 569 068 988 ΐΒΛ SAQ J9S UT3 Βΐν nsq naq J SAQ Λχ T¾ usy dsy JSS ^TV usy

J3S ojj BTV 3ュ v 3TI m -ΐ χ j x

sAq na ュ¾

S Z XVV VIV X30 103 1V0 OVO OIV 30V DVO LIO XIV OVV 31V 33V 3V3 IVO

O ssi οει

^10 3ュ V ·ΐ¾ χο J¾ Αχο Αχο Sjy sAq STH an dsy 3D3 VOO 190 VOX VOV 030 1X3 110 X3V V30 103 33V VVV 3VD IVV OVO

921 ΟΖΐ 911

usy ΐ¾ S sAq OJd J9S nsq dsy ΘΙ Ι J¾ usy SAQ BTV ^^I ⁹¾I ^13

988 3VV VXO X9V OVV VOO IOV Oil 3V9 IIV 3DV OVV X9I XDO IVX Oil 130

Oil 90ΐ ΟΟΐ

3ュ v -ΐΑχ Λχο Τ3 UI9 Αχ naq I¾A 3JV J3S ΐ^Λ ^ΐθ dsy

88S VOV XVI 003 100 OVO XIV VOO 113 VIO 03V IOV 310 XOO IVX 3IV DVO

06 98

usy Π3Ί Αχ SXQ T¾ 911 "TO §ュ V ⁹Π Τ^Λ usv na Αχο OJJ SAQ

062 IVV VXD D33 IOX 1X3 IIV WO 33V IIV 310 IOV OVV 313 V33 130 391 08 Oi S9

Π3Ί Αχο A¾ sAo J¾ ΙΒΛ 3T I BTV SIH IBA "TO dsy S ⁿI3

ZU 0X3 VOO VOO 101 VOV 3X0 IIV 301 VOO IVO 319 OVO IV3 031 WO III

09 99 05

9 Β^ 3jy UTO S-iV OJJ Β γ Sjy S^V ^Md SJH usy Α ^ gjy OJJ

^6ΐ III 9X3 30V OVO V93 133 330 139 103 103 3IX DVO 3VV 300 VOV 103

0 58

ΑΤ3 dsV sAq STH I sn BIV sAq i j) SAQ χ¾ュ dsy dsy OJJ usy

9 333 IVO OVV 3V3 110 XIV 333 OVV OVO 001 313 I3V 3V9 IV3 V33 3VV

08 92 02

ΤΒΛ sqd JAX UIO sAq Λ A J3S JAX eiV OJJ usy dsy uxo na OJd

86 VIO ill 3VI VV3 OVV 310 1X3 031 3VI V30 ODD OVV IV3 VV3 0X3 V3D

5ΐ 01 9 ΐ usy s JAi J¾ OJJ naq dsy ngq ΙΒΛ STH §jy isyj STH BTV ΐ^ΒΛ ΐ¾

05 IVV VOX 3VI VOV 033 VIO IVO 313 3X3 3V3 393 9XV 3V3 VOO 3X0 VIO 31 園

9

rscio/t'edr/XDd LS SOIS6 OAV His Asp Thr Met Lys lie Val Asp Ser lie Gin Asp Arg Gly lie Asn

145 150 155 160

CAG GTT TAT GTA ATT GGT GGT GAT GGT ACT CAA AGG GGT GCA GGA GTG 530

Gin Val Tyr Val lie Gly Gly Asp Gly Thr Gin Arg Gly Ala Gly Val

165 170 175

ATT TTT GAA GAG ATT AGA AGA CGT GGT CTC AAG GTT GCT GTT GCT GGC 578 lie Phe Glu Glu lie Arg Arg Arg Gly Leu Lys Val Ala Val Ala Gly

180 185 190

ATT CCA AAG ACG ATT GAT AAT GAT ATA CCA GTA ATT GAC AGA TCA TTT 626 lie Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie Pro Val lie Asp Arg Ser Phe

195 200 205

GGT TTC GAC ACT GCA GTT GAG GAG GCC CAA CGT GCA ATA AAT GCT GCT 674

Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Glu Ala Gin Arg Ala lie Asn Ala Ala

210 215 220

CAT GTA GAA GCT GGA AGC GCC GAG AAT GGT ATA GGC CTC GTA AAG CTA 722

His Val Glu Ala Gly Ser Ala Glu Asn Gly He Gly Leu Val Lys Leu

225 230 235 240

ATG GGT CGA CAC AGT GGT TTT ATT GCA CAC TAT GCT ACT CTA GCC AGC 770

Met Gly Arg His Ser Gly Phe lie Ala His Tyr Ala Thr Leu Ala Ser

245 250 255

AGA GAC GTG GAT TGT TGT TTG ATT CCA GAG TCA CCT TTC TAT CTG GAA 818

Arg Asp Val Asp Cys Cys Leu lie Pro Glu Ser Pro Phe Tyr Leu Glu

260 265 270

GGT GAA GGT GGC CTT TTT AGA TAT TTG GAA AAG CGT CTG AAG GAG AAT 866

Gly Glu Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Leu Lys Glu Asn

275 280 285

GGT CAT ATG GTT ATC GTT GTT GCG GAG GGT GCA GGG CAG AAA CTT ATT 914

Gly His Met Val lie Val Val Ala Glu Gly Ala Gly Gin Lys Leu lie

290 295 300 AAT GAA ACA AAG GAA TCA ATG GGG AAA GAT GCT TCA GGC AAT TCG ATT 962 Asn Glu Thr Lys Glu Ser Met Gly Lys Asp Ala Ser Gly Asn Ser lie 305 310 315 320

CTT CTT GAT GTT GGT CTT TGG TTA TCT CAA AAG ATA AAA GAG CAT TTC 1010 Leu Leu Asp Val Gly Leu Trp Leu Ser Gin Lys l ie Lys Glu His Phe

325 330 335

AAG AAA ATC AAG ACT ACT ATA AAT CTC AAG TAT ATA GAT CCT ACA TAC 1058 Lys Lys lie Lys Thr Thr lie Asn Leu Lys Tyr l ie Asp Pro Thr Tyr

340 345 350

ATG ATA CGT GCC ATT CCT AGC AAT GCA TCT GAC AAT GTG TAT TGC ACA 1106 Met lie Arg Ala lie Pro Ser Asn Ala Ser Asp Asn Val Tyr Cys Thr

355 360 365

CTG TTG GCA CAC AGG GTG GTT CAT GGA GCC ATG GCT GGA TAC ACT GGT 1154 Leu Leu Ala His Arg Val Val His Gly Ala Met Ala Gly Tyr Thr GLy

370 375 380

TTC ACT GTT GGC CAA GTA AAT GGT CGG CAT TGC TAT ATC CCG TTT TAC 1202 Phe Thr Val Gly Gin Val Asn Gly Arg His Cys Tyr lie Pro Phe Tyr 385 400 405 410

AGG ATC ACA GAG AAG CAG AAC AAA GTT TCA ATT ACT GAT AGG ATG TGG 1250 Arg lie Thr Glu Lys Gin Asn Lys Val Ser lie Thr Asp Arg Met Trp

415 420 425

GCA AGA CTT CTC TCC TCA ACC AAC CAG CCA AGT TTC CTC AGC AAG AAA 1298 Ala Arg Leu Leu Ser Ser Thr Asn Gin Pro Ser Phe Leu Ser Lys Lys

430 435 440

GAT GTG GAG GAC GCA AAG ATG GAA GAA GAG AGA GCA TCC AAG TTT TTC 1346 Asp Val Glu Asp Ala Lys Met Glu Glu Glu Arg Ala Ser Lys Phe Phe

445 450 455

GAT GGC CCG CCT CCC AAC CCC AAG GTT GAA GAC AAA GTC GCT TCC AAT 1394 Asp Gly Pro Pro Pro Asn Pro Lys Val Glu Asp Lys Val Ala Ser Asn 460 465 470

GGC AAG GCT GTG AAG TGAGGCAGAA GGCTACTGAT CTATTATGTGC AGATGGATTA 1449 Gly Lys Ala Val Lys

475

ATTATTACTC AATAATGTCA GTAATCTATC TATGGCTAGT GAGATGGATT AGTAAATAAT 1509 ATTAGTATAT CTATGGCAAG TGATGCTCAG CTCTTCCTGT CCAAATTAAA ATGCCGAGAA 1569 TAGATCTCCT CTAGCAGGTT ATCGTCATTA TATTTAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1623 配列番号： 6

配列の長さ ： 479

配列の種類：アミノ酸

配列 '

Val Val Ala His Met Arg His Val Leu Asp Leu Pro Thr Tyr Ser Asn

1 5 10 15

Pro Leu Gin Asp Asn Pro Ala Tyr Ser Val Val Lys Gin Tyr Phe Val

20 25 30

Asn Pro Asp Asp Thr Val Cys Gin Lys Ala He Val His Lys Asp Gly

35 40 45

Pro Arg Gly Asn His Phe Arg Arg Ala Gly Pro Arg Gin Arg Val Phe

50 55 60

Phe Glu Ser Asp Glu Val His Ala Cys He Val Thr Cys Gly Gly Leu 65 70 75 80

Cys Pro Gly Leu Asn Thr Val lie Arg Glu lie Val Cys Gly Leu Asn

85 90 95

Asp Met Tyr Gly Val Ser Arg Val Leu Gly lie Gin Gly Gly Tyr Arg

100 105 110

Gly Phe Tyr Ala Cys Asn Thr lie Asp Leu Ser Pro Lys Ser Val Asn

115 120 125

Asp lie His Lys Arg Gly Gly Thr Val Leu Gly Thr Ser Arg Gly Gly 130 135 140

His Asp Thr Met Lys l ie Val Asp Ser lie Gin Asp Arg Gly lie Asn 145 150 155 160

Gin Val Tyr Val lie Gly Gly Asp Gly Thr Gin Arg Gly Ala Gly Val

165 170 175 lie Phe Glu Glu lie Arg Arg Arg Gly Leu Lys Val Ala Val Ala Gly

180 185 190 lie Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie Pro Val He Asp Arg Ser Phe

195 200 205

Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Glu Ala Gin Arg Ala lie Asn Ala Ala

210 215 220

His Val Glu Ala Gly Ser Ala Glu Asn Gly lie Gly Leu Val Lys Leu 225 230 235 240

Met Gly Arg His Ser Gly Phe lie Ala His Tyr Ala Thr Leu Ala Ser

245 250 255

Arg Asp Val Asp Cys Cys Leu lie Pro Glu Ser Pro Phe Tyr Leu Glu

260 265 270

Gly Glu Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Leu Lys Glu Asn

275 280 285

Gly His Met Val He Val Val Ala Glu Gly Ala Gly Gin Lys Leu He

290 295 300

Asn Glu Thr Lys Glu Ser Met Gly Lys Asp Ala Ser Gly Asn Ser lie 305 310 315 320

Leu Leu Asp Val Gly Leu Trp Leu Ser Gin Lys lie Lys Glu His Phe

325 330 335

Lys Lys lie Lys Thr Thr He Asn Leu Lys Tyr lie Asp Pro Thr Tyr

340 345 350

Met lie Arg Ala lie Pro Ser Asn Ala Ser Asp Asn Val Tyr Cys Thr

355 360 365 Leu Leu Ala His Arg Val Val His Gly Ala Met Ala Gly Tyr Thr GLy

370 375 380

Phe Thr Val Gly Gin Val Asn Gly Arg His Cys Tyr lie Pro Phe Tyr 385 400 405 410

Arg He Thr Glu Lys Gin Asn Lys Val Ser lie Thr Asp Arg Met Trp

415 420 425

Ala Arg Leu Leu Ser Ser Thr Asn Gin Pro Ser Phe Leu Ser Lys Lys

430 435 440

Asp Val Glu Asp Ala Lys Met Glu Glu Glu Arg Ala Ser Lys Phe Phe

445 450 455

Asp Gly Pro Pro Pro Asn Pro Lys Val Glu Asp Lys Val Ala Ser Asn

460 465 470

Gly Lys Ala Val Lys

475 配列番号： 7

配列の長さ ： 2048

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA 生物名： ジーメイズ （Zea mays L. )

組織の種類：胚乳由来カルス

直接の起源

ライブラリ一名： カルス mRNA由来; I gtlO c D N Aライブラリ一

クローン名 ： pPFK - ZM1

配列

CGAACCCGAA CCCTCCAAGC CGGCAGGCCG GAGCAGAGCG CGCTCCAAGC TGAATCCCCC 60 CATCTCCTAT CGCCGTCGAA AGCCGCAGGT CCATTATAAC TTTTTATGAC CTTGTCTGGG 120 ATG GCT GTT GCT TTC AAA GCA AGT ACA AGT TCT GTC ACA CAG CAA CAT 168 Met Ala Val Ala Phe Lys Ala Ser Thr Ser Ser Val Thr Gin Gin His

1 5 10 15

TGG TCA AGT CCA ACA AAG GAC CAG TGT CAA TAT GGT TTC ACT CAT TTA 216 Trp Ser Ser Pro Thr Lys Asp Gin Cys Gin Tyr Gly Phe Thr His Leu

20 25 30

AGC AGG CAA AAG TGC AGA AAA AGA GCA CTG TGT GTG ACA GCT ATA TCA 264 Ser Arg Gin Lys Cys Arg Lys Arg Ala Leu Cys Val Thr Ala l ie Ser

35 40 45

GGG AAG CTA GAC CTA GAT TTC ACT GAT CCT TCT TGG AAC CAA AAG TAC 312 Gly Lys Leu Asp Leu Asp Phe Thr Asp Pro Ser Trp Asn Gin Lys Tyr

50 55 60

CAG GAA GAC TGG AAC AGG CGT TTT AGT TTG CCA CAT ATT AAT GAT ATA 360 Gin Glu Asp Trp Asn Arg Arg Phe Ser Leu Pro His lie Asn Asp l ie 65 70 75 80

TAT GAT TTG GAA CCA AGA AGA ACT ACA TTC TCT TTG AAG AAA AAC AGA 408 Tyr Asp Leu Glu Pro Arg Arg Thr Thr Phe Ser Leu Lys Lys Asn Arg

85 90 95

ATT CCC CTG GGT GAT GGT GAT GGC TCA TCA ACT GAT ATG TGG AAC GGT 456 lie Pro Leu Gly Asp Gly Asp Gly Ser Ser Thr Asp Met Trp Asn Gly

100 105 110

TAT GTA AAT AAG AAT GAT AGA GCC CTT TTG AAG GTG ATA AAG TAT GCA 504 Tyr Val Asn Lys Asn Asp Arg Ala Leu Leu Lys Val lie Lys Tyr Ala

115 120 125

TCT CCT ACT TCT GCT GGA GCT GAG TGC ATT GAT CCT GAT TGT AGC TGG 552 Ser Pro Thr Ser Ala Gly Ala Glu Cys l ie Asp Pro Asp Cys Ser Trp

130 135 140

GTG GAA CAC TGG GTT CAT CGT GCA GGT CCT CGT AAG GAG ATA TAT TAC 600 Val Glu His Trp Val His Arg Ala Gly Pro Arg Lys Glu lie Tyr Tys

145 150 155 160

GAA CCT GAA GAA GTA AAG GCT GCC ATT GTT ACC TGT GGA GGG CTC TGT 648

Glu Pro Glu Glu Val Lys Ala Ala lie Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys

165 170 175

CCT GGT CTA AAT GAT GTC ATT AGG CAG ATA GTA TTT ACT TTG GAG ACT 696

Pro Gly Leu Asn Asp Val lie Arg Gin lie Val Phe Thr Leu Glu Thr

180 185 190

TAT GGG GTG AAG AAT ATT GTT GGA ATC CCA TTT GGT TAT CGT GGA TTT 744

Tyr Gly Val Lys Asn lie Val Gly lie Pro Phe Gly Tyr Arg Gly Phe

195 200 205

TTT GAG AAA GGC TTA AAA GAA ATG CCG CTC TCG CGT GAC GTG GTG GAA 792

Phe Glu Lys Gly Leu Lys Glu Met Pro Leu Ser Arg Asp Val Val Glu

210 215 220

AAC ATA AAT CTT TCT GGA GGA AGT TTC CTA GGA GTC TCT CGT GGA GGA 840

Asn lie Asn Leu Ser Gly Gly Ser Phe Leu Gly Val Ser Arg Gly Gly

225 230 235 240

GCT AAA ACT AGT GAG ATT GTA GAT AGC ATA CAA GCC AGA AGA ATT GAC 888

Ala Lys Thr Ser Glu lie Val Asp Ser lie Gin Ala Arg Arg lie Asp

245 250 255

ATG CTA TTT GTA ATT GGT GGA AAT GGT AGC CAT GCA GGA GCT AAT GCT 936

Met Leu Phe Val lie Gly Gly Asn Gly Ser His Ala Gly Ala Asn Ala

260 265 270

ATT CAT GAG GAG TGT CGA AAG AGA AAA CTG AAA GTT TCA GTT GTA GCA 984 lie His Glu Glu Cys Arg Lys Arg Lys Leu Lys Val Ser Val Val Ala

275 280 285

GTC CCA AAG ACA ATT GAT AAT GAT ATA CTT TTT ATG GAT AAG ACG TTT 1032

Val Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie Leu Phe Met Asp Lys Thr Phe

290 295 300 GGT TTT GAT ACA GCT GTA GAG AAA GCT CAG CGT GCT ATC AAT TCT GCC 1080 Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Lys Ala Gin Arg Ala lie Asn Ser Ala 305 310 315 320

TAT ATA GAG GCA CGT AGT GCA TAC CAC GGA ATT GGG TTA GTA AAA TTA 1128 Tyr lie Glu Ala Arg Ser Ala Tyr His Gly lie Gly Leu Val Lys Leu

325 330 335

ATG GGA AGA AGT AGT GGA TTC ATA GCC ATG CAT GCT TCT CTT TCC AGT 1176 Met Gly Arg Ser Ser Gly Phe lie Ala Met His Ala Ser Leu Ser Ser

340 345 350

GGA CAG ATT GAT GTT TGC CTG ATA CCT GAG GTA TCC TTC ACA CTT GAT 1224 Gly Gin lie Asp Val Cys Leu He Pro Glu Val Ser Phe Thr Leu Asp

355 360 365

GGA GAA CAT GGT GTC TTG CGA CAC CTT GAG CAT TTA CTT AAT ACA AAG 1272 Gly Glu His Gly Val Leu Arg His Leu Glu His Leu Leu Asn Thr Lys

370 375 380

GGA TTT TGT GTG GTT TGT GTT GCT GAA GGT GCA GGG CAG GAT TTA CTC 1320 Gly Phe Cys Val Val Cys Val Ala Glu Gly Ala Gly Gin Asp Leu Leu 385 390 395 400

CAA AAA TCA AAT GCA ACT GAC GCT TCA GGA AAT GTG ATA CTT AGT GAC 1368 Gin Lys Ser Asn Ala Thr Asp Ala Ser Gly Asn Val lie Leu Ser Asp

405 410 415

TTT GGT GTC CAC ATG CAG CAG AAG ATC AAG AAG CAT TTC AAG GAC ATC 1416 Phe Gly Val His Met Gin Gin Lys lie Lys Lys His Phe Lys Asp lie

420 425 430

GGT GTT CCC GCT GAT CTA AAA TAC ATT GAT CCA ACA TAT ATG GTT CGG 1464 Gly Val Pro Ala Asp Leu Lys Tyr lie Asp Pro Thr Tyr Met Val Arg

435 440 445

GCC TGC CGG GCA AAT GCA TCT GAT GCT ATT CTC TGC ACC GTA CTT GGG 1512 Ala Cys Arg Ala Asn Ala Ser Asp Ala lie Leu Cys Thr Val Leu Gly 450 455 460

CAA AAT GCT GTC CAT GGA GCA TTT GCT GGG TTC AGT GGC ATC ACG TCA 1560 Gin Asn Ala Val His Gly Ala Phe Ala Gly Phe Ser Gly l ie Thr Ser 465 470 475 480

GGT GTT TGC AAC ACA CAT TAT GTC TAC CTT CCC ATC ACA GAG GTC ATT 1608 Gly Val Cys Asn Thr His Tyr Val Tyr Leu Pro lie Thr Glu Val lie

485 490 495

ACA ACA CCA AAG CAC GTC AAC CCC AAC AGC AGA ATG TGG CAC CGC TGC 1656 Thr Thr Pro Lys His Val Asn Pro Asn Ser Arg Met Trp His Arg Cys

500 505 510

CTC ACA TCC ACT GGC CAG CCA GAC TTC CAT TGACTACTTC ATTAACACCT 1706 Leu Thr Ser Thr Gly Gin Pro Asp Phe His

515 520

GAGAGCAAGG CGCCAGGAGA ATATTTAATC CCACAAGGGA CTGCTAACAG GAACTTGAAT 1766 AAATCTGGCT AACCCAAAAT TTTGTGAGGC TGGAGGAGCT CATAACGAAA TTGCCAGAGC 1826 CACCCCCTGG TCATCCAGAC GTTGTAAGCA TGCATACCCT TTCTAGTGGT TTGCAATCCC 1886 AAGTGAAATT AAAAGTTAGG AGTTGTTTGT TCTCCAAACA ATTCACCATA ATCCCACCAG 1946 CACCAAACTG GCTCCAGCCT TGTGAGATGT TTTATTGATG ATGTACTATG CATAATAGGC 2006 AATTGGATAT TCTTACTGGG AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 2048 配列番号： 8

配列の長さ ： 522

配列の種類：アミノ酸

配列

Met Ala Val Ala Phe Lys Ala Ser Thr Ser Ser Val Thr Gin Gin His

1 5 10 15

Trp Ser Ser Pro Thr Lys Asp Gin Cys Gin Tyr Gly Phe Thr His Leu

20 25 30

Ser Arg Gin Lys Cys Arg Lys Arg Ala Leu Cys Val Thr Ala lie Ser 35 40 45

Gly Lys Leu Asp Leu Asp Phe Thr Asp Pro Ser Trp Asn Gin Lys Tyr

50 55 60

Gin Glu Asp Trp Asn Arg Arg Phe Ser Leu Pro His lie Asn Asp lie 65 70 75 80

Tyr Asp Leu Glu Pro Arg Arg Thr Thr Phe Ser Leu Lys Lys Asn Arg

85 90 95 lie Pro Leu Gly Asp Gly Asp Gly Ser Ser Thr Asp Met Trp Asn Gly

100 105 110

Tyr Val Asn Lys Asn Asp Arg Ala Leu Leu Lys Val lie Lys Tyr Ala

115 120 125

Ser Pro Thr Ser Ala Gly Ala Glu Cys lie Asp Pro Asp Cys Ser Trp

130 135 140

Val Glu His Trp Val His Arg Ala Gly Pro Arg Lys Glu lie Tyr Tys 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Val Lys Ala Ala lie Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys

165 170 175

Pro Gly Leu Asn Asp Val lie Arg Gin lie Val Phe Thr Leu Glu Thr

180 185 190

Tyr Gly Val Lys Asn lie Val Gly lie Pro Phe Gly Tyr Arg Gly Phe

195 200 205

Phe Glu Lys Gly Leu Lys Glu Met Pro Leu Ser Arg Asp Val Val Glu

210 215 220

Asn lie Asn Leu Ser Gly Gly Ser Phe Leu Gly Val Ser Arg Gly Gly 225 230 235 240

Ala Lys Thr Ser Glu lie Val Asp Ser He Gin Ala Arg Arg lie Asp

245 250 255 Met Leu Phe Val lie Gly Gly Asn Gly Ser His Ala Gly Ala Asn Ala

260 265 270 S Q SJV STH dJi §jy JSS usy OJJ usy ΐ^Λ STH sAq OJJ J¾ jqi

S6 06 S8

9T I ΐ¾ ηχο ュ ST I OJd ns ιΑχ 八 ュ A丄 SIH J¾ usy sA〕 A A¾

08， OL

S Jqi d\l ^1 ュ 3¾i Αχ BTV ^Md ^TV ^TO STH Τ^Λ ^TV usy ux

09， 99^ 05

naq 1 ュ q丄 sA;} risi 9χ \ Β γ dsy JSS BTV ^USV ^BTV ^3JCV ^s^3 ^TV on SS

3_iv T¾ WW JAi J¾ OJd dsy an J sAq nsq dsy BTV OJ^ T¾ ^TO οε s

3TI dsv sAq sqd STH sA sAq θχι sA ϋχο n STH Τ^Λ ^TO

S 0 90^

dsy J9S naq an 八 usy Axg J9g π ν dsy J¾ Βχν usy J3S sAq u^g

00 96S 068 988 ri9i n9i dsv "TO ^TO BIV ^TO ηχ BIV ΐ^Λ s Λ ΪΒΛ SAQ S Α

088 5 ,ε OAS sAq iqx usy naq nsq STH η ο naq STH 3JV n^l T¾ ^TO STH "ίθ ^TO

998 098 958

dsy naq J 9¾] jas m ηχ^ OJJ d\\ na s τ¾Λ dsy 9T I t j) Αχ

05ε s a

ュ J9S naq jss BIV STH ；3)< BTV 3T I s¾j Αχ^ J9S J9S SJV ^I

¾εε οεε ε

n9i sAq 八 naq Αχο θχ ΐ Αχο STH Α Βχν s §JV ^TV ηχο 9： I ュ A丄

02ε ςιε οτε οε

Βτνュ as usy 9ΐΙ Βΐν SJV UIO BTV sAq ηχο 八 BTV ュ clsy 3¾j Αχο

00S 562 062 sqdュ sAq dsy 9 naq 9χι dsy usy dsy 9i〖 ュ sAq OJJ 八

582 082 UZ

^TV T¾ l^k s Τ^Λ sAq naq sAq Siy s q Sjy SAQ ηχο STH an

ZS£lOIP6dT/LDd ム S0/S6 OAV 3T I ΐΒΛ J usv nsq χ OJJ OAQ naq Αχ Αχο SAQ jqj, ΐ^Λ 9TI SAQ 261 OIV 3X9 XOV IVV 1X0 300 VOD X3I Oil 330 100 191 VDV XX3 XIV 301

9 o ge

^TV ΙΒΛ Λ ^DSV dsy S dsy ^^ά Τ^Λ S-^V "TD Sjy OJJ Αχο BTV 330 XI3 XXO IVO IVO 031 IVO III 3VX 110 OOV WD X03 VOO V39 VOO

08 52 02

SJV S-iV 9¾I STH Jill Αχο Sjy οι^ J9S dsy OJd STH Τ^Λ ΐ¾ 9TI sAq 96 VOV 300 Oil IVO VDV V30 VOV VD3 X9V XV3 X33 XVD IIO 110 OIV OVV

9ΐ Οΐ 9 ΐ

UT9 ojj ΙΒΛ -i¾ dsv dsy ηχ^ dsy T¾ 9 丄 uxg sAq T¾ T¾ ュ ³S 8 3V3 103 110 OOV OVO IV3 OVO IVO 1X0 3X1 3V1 OVD OVV 113 XX3 X3I

ISa - M<id： ^ベ一 a ^

— ri ^ 4 v N aつ π dvz Y来申 u w ： §^ー ^ ^

麵

VNHtn oi VNdつ：難 ®匪 篛本ニ：鞣©篛 mm：

899ΐ： $晉©

6 ： ^"觀 3S

02S 515

STH 3 dsy ojj UTO χθ -t¾ s J¾ naq

OTS 505 009

89

ZS£lO/P6dT/LDd Z.SJ?S0/S6 OAV 50 55 60

AGA GAA ATC GTT TGT GGA TTG TCT TAC ATG TAT GGT GTC AAG AAA ATC 240

Arg Glu l ie Val Cys Gly Leu Ser Tyr Met Tyr Gly Val Lys Lys He 65 70 75

CTT GGC ATT GAG GGA GGT TAC AGA GGC TTC TAC GCT AGG AAC ACG ATC 288 Leu Gly He Glu Gly Gly Tyr Arg Gly Phe Tyr Ala Arg Asn Thr l ie

80 85 90

GAT TTG GAT TTG AAA ACA GTG AAT GAT ATT CAT AAA CGT GGA GGA ACC 336

Asp Leu Asp Leu Lys Thr Val Asn Asp l ie His Lys Arg Gly Gly Thr

95 100 105

ATC CTC GGG ACT TCA AGA GGT GGT CAC GAC ACT ACT AAG ATA GTT GAT 384 lie Leu Gly Thr Ser Arg Gly Gly His Asp Thr Thr Lys He Val Asp

110 115 120

AGT ATT CAA GAT CGT GGG ATT AAC CAG GTT TAT ATA ATC GGT GGA GAT 432

Ser l ie Gin Asp Arg Gly l ie Asn Gin Val Tyr He l ie Gly Gly Asp

125 130 135

GGA TCA CAG AAA GGA GCA GCT GTT ATA TTC GAG GAG ATT AGG AGA CGT 480

Gly Ser Gin Lys Gly Ala Ala Val l ie Phe Glu Glu l ie Arg Arg Arg 140 145 150 155

GGA CTC AAA GTT GCT GTT GCA GGG ATC CCC AAA ACA ATC GAC AAT GAC 528

Gly Leu Lys Val Ala Val Ala Gly l ie Pro Lys Thr l ie Asp Asn Asp

160 165 170

ATT CCT ATT ATC GAT AGA TCG TTC GGG TTT GAC ACA GCT GTA GAA GAG 576 lie Pro l ie He Asp Arg Ser Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Glu

175 180 185

GCT CAA CGT GCT ATC AAC GCA GCT CAT GTG GAA GCT ACA AGT TTT GAG 624

Ala Gin Arg Ala l ie Asn Ala Ala His Val Glu Ala Thr Ser Phe Glu

190 195 200

AAT GGT ATT GGT CTT GTC AAG TTA ATG GGA CGT TAT AGT GGA TTC ATT 672 Asn Gly lie Gly Leu Val Lys Leu Met Gly Arg Tyr Ser Gly Phe lie

205 210 215

GCG ATG TAT GCA ACA CTA GCC AGC AGA GAC GTG GAC TGC TGC TTG ATC 720 Ala Met Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Arg Asp Val Asp Cys Cys Leu He 220 225 230 235

CCG GAA TCT CCA TTT TTT CTT GAA GGC AAA GGC GGT CTT TTC GAG TTT 768 Pro Glu Ser Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Gly Gly Leu Phe Glu Phe

240 245 250

ATC GGT AAA CGG CTA AAG GAG ATT GGT CAC ATG GTG ATT GTG ATA GCA 816 lie Gly Lys Arg Leu Lys Glu He Gly His Met Val He Val l ie Ala

255 260 265

GAA GGT GCT GGA CAA GAT CTG TTG GCT GAA AGC AAT GAA CAG TCC ACA 864 Glu Gly Ala Gly Gin Asp Leu Leu Ala Glu Ser Asn Glu Gin Ser Thr

270 275 280

ACC CTC AAA GAT GCA TCT GGG AAC AAA CTT CTA CAA GAC GTT GGC CTA 912 Thr Leu Lys Asp Ala Ser Gly Asn Lys Leu Leu Gin Asp Val Gly Leu

285 290 295

TGG ATC TCC CAA CGG ATC AAG GAT CAT TTT GCC AAG AAG ATG ACC CTA 960 Trp l ie Ser Gin Arg lie Lys Asp His Phe Ala Lys Lys Met Thr Leu 300 305 310 315

AAC CTG AAA TAC ATA GAT CCA ACC TAC ATG ATA AGG GCT GTT CCG AGC 1008 Asn Leu Lys Tyr lie Asp Pro Thr Tyr Met lie Arg Ala Val Pro Ser

320 325 330

AAT GCA TCA GAC AAT GTA TGC TGC ACG CTG TTA GCT CAA AGC GCG GTT 1056 Asn Ala Ser Asp Asn Val Cys Cys Thr Leu Leu Ala Gin Ser Ala Val

335 340 345

CAT GGA GTG ATG GCT GGT TAC AAT GGC TTC ACC GTT GGT CTT GTT AAT 1104 His Gly Val Met Ala Gly Tyr Asn Gly Phe Thr Val Gly Leu Val Asn

350 355 360 ST I ΤΒΛ ュ usy ns Αχο OJJ OAQ naq Αχο Αχΰ SAQ jqi Τ^Λ θΤΙ sAo

9^ 0 98

BTV Τ^Λ Τ^Λ dsy dsy JSS dsy 9i¾ JA丄 χ^Λ "Τ3 §JV OJJ χθ ^TV

08 92 02

S-tV STH J ^TO 3JV oid s dsy OJJ STH m m 9 \ sAq

9ΐ οΐ g Ϊ

UTO OJj ΙΒΛ dsy dsy ηχο dsy l^A ュ "ΐΰ sAq χ^Λ Τ^Λ ュ

urn m r ； ：

： ^ ®½3S oi ：

8551 VVVVVVVVVV VVVVVVVVDl

8851 lOOXXXXOXV VV30VVIVID IVVVOVVIVV XVIIIX3V3V XXXVVIOIOV VV3D9II0V3 LH OliOIV IDV lliO^ VIIVI9IV30 IVVVlVSli IVVIVII9V3 VIVOIIOVVO 8I V03XI33X30 XXIV3VIVIV 3V3V0V9VVV 3V0VVVV03V VDIX3XIX3I mmLLl 85ST IVVVVDI3II 30VV0VXV0I LLLVJ iOLL I39VVI0VVV 3VVV9V9XIX 9XX1XV3XVV

OZf S

usv ism BTV ^TO ^TV ηχθ Αχο Αχ Jt9§

8621 OVOIOI01IO I0VV3VVV0I 991 OVV 9IV 009 109 V09 WO 190 IDO 131

0 90^ 00，

sin usy OJJ ηχο STH STH dsy dsy STH sAq ϋ 9¾} JSS OJJ ujg usy

8 ΐ XVD 3VV V33 9V3 3V0 3VD XV9 IV3 3V0 OVV 3IV 3X1 X9V 133 3V3 OVV 56S 068 588 08£ ュ S ュ ^ss na naq §jy V dai ism §jy ^dsV ⁹ΐΙ ΐ^ΒΛ ΐ¾ sA

0021 VOV 331 I3X OXX XI3 33V V30 ΟΰΧ 9XV VOV 3V3 X3V 3XV 0X3 OXO 3VV

usv "TO sAq ηχο 丄 ΘΠ Sjy ュ 3¾ ο 9χΐ χ J¾ SIH S y ^ΐθ sen vv ova vvv ovo iav oxv oov xvi an ODD IIV OVI XOV vov ooo

19 '

ZSZlO/P6dT/lDd S0/S6 OAV 50 55 60

Arg Glu lie Val Cys Gly Leu Ser Tyr Met Tyr Gly Val Lys Lys lie 65 70 75

Leu Gly lie Glu Gly Gly Tyr Arg Gly Phe Tyr Ala Arg Asn Thr lie

80 85 90

Asp Leu Asp Leu Lys Thr Val Asn Asp lie His Lys Arg Gly Gly Thr

95 100 105 lie Leu Gly Thr Ser Arg Gly Gly His Asp Thr Thr Lys lie Val Asp

110 115 120

Ser lie Gin Asp Arg Gly lie Asn Gin Val Tyr lie lie Gly Gly Asp

125 130 135

Gly Ser Gin Lys Gly Ala Ala Val lie Phe Glu Glu lie Arg Arg Arg 140 ' 145 150 155

Gly Leu Lys Val Ala Val Ala Gly lie Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp

160 165 170 lie Pro lie lie Asp Arg Ser Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu Glu

175 180 185

Ala Gin Arg Ala He Asn Ala Ala His Val Glu Ala Thr Ser Phe Glu

190 195 200

Asn Gly lie Gly Leu Val Lys Leu Met Gly Arg Tyr Ser Gly Phe lie

205 210 215

Ala Met Tyr Ala Thr Leu Ala Ser Arg Asp Val Asp Cys Cys Leu lie 220 225 230 235

Pro Glu Ser Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Gly Gly Leu Phe Glu Phe

240 245 250 lie Gly Lys Arg Leu Lys Glu lie Gly His Met Val He Val lie Ala

255 260 265

Glu Gly Ala Gly Gin Asp Leu Leu Ala Glu Ser Asn Glu Gin Ser Thr

270 275 280 Thr Leu Lys Asp Ala Ser Gly Asn Lys Leu Leu Gin Asp Val Gly Leu

285 290 295

Trp lie Ser Gin Arg lie Lys Asp His Phe Ala Lys Lys Met Thr Leu 300 305 310 315

Asn Leu Lys Tyr lie Asp Pro Thr Tyr Met lie Arg Ala Val Pro Ser

320 325 330

Asn Ala Ser Asp Asn Val Cys Cys Thr Leu Leu Ala Gin Ser Ala Val

335 340 345

His Gly Val Met Ala Gly Tyr Asn Gly Phe Thr Val Gly Leu Val Asn

350 355 360

Gly Arg His Thr Tyr lie Pro Phe Tyr Arg lie Thr Glu Lys Gin Asn

365 370 375

Lys Val Val He Thr Asp Arg Met Trp Ala Arg Leu Leu Ser Ser Thr 380 385 390 395

Asn Gin Pro Ser Phe Met Lys His Asp Asp His His Glu Pro Asn His

400 405 410

Ser Gly Gly Glu Ala Gly Ala Met Asn Trp

415 420 配列番号： 11

配列の長さ： 5

配列の型： アミノ酸

配列

Arg Ala Gly Pro Arg

1 5 配列番号： 12

配列の長さ： 12

配列の型： アミノ酸 配列

lie Val Thr Cys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Leu Asn 1 5 10 配列番号: 13

配列の長さ： 5

配列の型： アミノ酸

配列

Gly Tyr Arg Gly Phe

1 5 配列番号： 14

配列の長さ： 6

配列の型： アミノ酸

配列

lie Val Asp Ser He Gin

1 5 配列番号： 15

配列の長さ： 8

配列の型： アミノ酸

配列

Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie

1 5 配列番号： 16

配列の長さ： 8

配列の型： アミノ酸

配列 Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Glu 1 5 配列番号 '· 17

配列の長さ： 6

配列の型： アミノ酸

配列

Ala Gin Arg Ala lie Asn

1 5 配列番号： 18

配列の長さ： 6

配列の型： アミノ酸

配列

Val Lys Leu Met Gly Arg

1 5 配列番号： 19

配列の長さ： 5

配列の型： アミノ酸

配列

Ser Gly Phe lie Ala

1 5 配列番号： 20

配列の長さ： 6

配列の型： アミノ酸

配列

Ala Glu Gly Ala Gly Gin 配列番号： 21

配列の長さ： 5

配列の型： アミノ酸

配列

Asp Ala Ser Gly Asn

1 5 配列番号： 22

配列の長さ： 9

配列の型： アミノ酸

配列

Leu Lys Tyr lie Asp Pro Thr Tyr Met 1 5 配列番号: 23

配列の長さ： 5

配列の型： アミノ酸

配列

Cys Leu He Pro Glu

1 5

Claims

請求の範囲

1. 植物由来の ATP依存フルク トース 6リ ン酸 1ホスホ トランスフヱラーゼを コー ドする DNA。

2. 5 での010値が2. 4以下である植物由来の A TP依存フルク トース 6 リ ン酸 1ホスホ トランスフヱラーゼをコ一ドする請求項 1記載の DNA。

3. 配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコ—ドする請求項 1記載の DN A。

4. 配列表の配列番号 1で示される塩基配列を有する請求項 3記載の D N A。

5. 配列表の配列番号 4で示されるアミノ酸配列をコードする請求項 1記載の DNA。

6. 配列表の配列番号 3で示される塩基配列を有する請求項 3記載の D N A。

7. 配列表の配列番号 6で示されるアミノ酸配列をコードする請求項 1記載の DNA。

8. 配列表の配列番号 5で示される塩基配列を有する請求項 7記載の D N A。

9. 配列表の配列番号 8で示されるァミノ酸配列をコードする請求項 1記載の DNA。

10. 配列表の配列番号 7で示される塩基配列を有する請求項 9記載の DNA。

1 1. 配列表の配列番号 10で示されるアミノ酸配列をコードする請求項 1記載 の DNA。

1 2. 配列表の配列番号 9で示される塩基配列を有する請求項 1 1記載の DNA。

13. 配列表の配列番号 1 1で示されるァミノ酸配列をコードする D N A。

14. 配列表の配列番号 14で示されるァミノ酸配列をコードする D N A。

15. 配列表の配列番号 21で示されるァミノ酸配列をコードする D N A。

16. 配列表の配列番号 22で示されるアミノ酸配列をコ一ドする DNA。

17. 配列表の配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸又はその一部をコー ドする DN A及び配列表の配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸配列を コードする D N Aを含む D N Aの! <、ずれかと試料 D N Aとをハイブリダィズさせ ることから成る、 植物由来の A TP依存フルク トース 6リン酸 1ホスホトランス フ ラーゼ遺伝子の検出方法。

18. 配列表の配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸又はその一部をコー ドする DN A及び配列表の配列番号 1 1ないし 22で示されるアミノ酸配列を コードする DN Aを含む DN Aのいずれかを P CRのためのプライマーとして用 いて植物由来の ATP依存フルク トース 6リ ン酸 1ホスホ トランスフヱラーゼ遺 伝子を増幅する方法。

19. 請求項 1ないし 12のいずれか 1項に記載の DN Aを含み、 宿主細胞内で 植物由来の ATP依存フルク トース 6リン酸 1ホスホトランスフヱラーゼを発現 することができる組換えべクタ一。

20. 請求項 19記載の組換えベクターで植物を形質転換することから成る、 低 温下で植物細胞中の糖含量を変化させる方法。

21. 前記植物はバレイショである請求項 20記載の方法。