WO2009131166A1 - インスリン様増殖因子結合タンパク質を含有するWntシグナル伝達阻害剤 - Google Patents

インスリン様増殖因子結合タンパク質を含有するWntシグナル伝達阻害剤 Download PDF

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wnt signaling
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一成 小室
一朗 塩島
偉東 朱
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Definitions

  • the present invention relates to a Wnt signaling inhibitor containing an insulin-like growth factor binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as IGFBP).
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention also relates to a Wnt signaling inhibitor containing a polynucleotide encoding IGFBP.
  • the present invention further relates to a method for inhibiting Wnt signaling, which comprises using IGFBP.
  • the present invention relates to a method for inhibiting Wnt signaling, which comprises using a polynucleotide encoding IGFBP.
  • the present invention also relates to the use of IGFBP and / or a polynucleotide encoding IGFBP in the manufacture of a Wnt signaling inhibitor.
  • the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by enhanced Wnt signaling, comprising the Wnt signaling inhibitor. Furthermore, the present invention relates to a method for preventing and / or treating a disease caused by enhanced Wnt signaling, which comprises administering the Wnt signaling inhibitor. The present invention also relates to the use of the Wnt signaling inhibitor in the prevention and / or treatment of diseases caused by enhanced Wnt signaling. Furthermore, the present invention relates to a cardiomyocyte differentiation inducer containing the Wnt signaling inhibitor. Furthermore, the present invention relates to a method for inducing cardiomyocyte differentiation, comprising contacting the Wnt signaling inhibitor with a cell capable of differentiating into a cardiomyocyte. The present invention also relates to a method for inducing cardiomyocyte differentiation, comprising administering the Wnt signaling inhibitor. The present invention further relates to cardiomyocytes obtained by the cardiomyocyte differentiation inducing method and uses thereof.
  • the heart is the first organ formed in the embryogenesis stage, and abnormalities in this process cause congenital heart disease, which is the most common cause of human congenital damage (Non-patent Documents 1 and 2). Molecules that lead to heart development are of particular interest because of their potential use for cardiac regeneration (3, 4).
  • Non-Patent Documents 2 and 4 humoral factors such as Wnt, Wnt inhibitors, bone morphogenetic protein (hereinafter abbreviated as BMP), and fibroblast growth factor (hereinafter abbreviated as FGF) have been shown to mediate tissue interactions critical to cardiomyocyte specification (Non-Patent Documents 2 and 4).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • FGF fibroblast growth factor
  • Wnt is a protein that regulates morphogenesis and is known to be involved in various phenomena such as development, stem cell differentiation control, and cell canceration. It has also been reported that Wnt is an important factor for stem cell proliferation regulation and survival (Non-patent Documents 5 and 6).
  • Wnt is known to express its action by binding to cell membrane receptors and transmitting intracellular signals via at least three different pathways.
  • Cell membrane receptors to which Wnt binds include 7-transmembrane receptor frizzled (sometimes abbreviated as Frizzled, Frz) and 1-transmembrane receptor low-density lipoprotein receptor-related protein 5 And 6 (sometimes abbreviated as LRP5 and LRP6, respectively) are known (Non-Patent Documents 7 and 8). It is considered that there are at least three types of signal transduction pathways controlled by Wnt: ⁇ -catenin pathway, PCP (planar cell polarity) pathway, and calcium ion (Ca 2+ ) pathway.
  • the ⁇ -catenin pathway has been known for a long time and is also called the canonical pathway. This pathway is characterized by the stabilization of cytoplasmic ⁇ -catenin, which plays an important role in the transmission of Wnt signals to the nucleus, and its abnormal activation is thought to be related to carcinogenesis.
  • the PCP pathway and the Ca 2+ pathway are called non-canonical pathways.
  • the PCP pathway is characterized by activation of Rho, which is a low molecular weight G protein, and Jun kinase belonging to the MAP kinase family.
  • the Ca 2+ pathway is also characterized by activation of protein kinase C (PKC) and calmodulin kinase, which are downstream protein kinases, due to an increase in intracellular calcium concentration.
  • PKC protein kinase C
  • calmodulin kinase which are downstream protein kinases
  • IGFBP insulin-like growth factor
  • IGF-I and IGF-II are structurally highly similar to insulin and bind to various receptors on the cell surface, type I and type IGF receptors, and various cells Plays an important role in the growth and differentiation of
  • IGFBP-1 to IGFBP-6 The existence of six molecular species called IGFBP-1 to IGFBP-6 has been clarified and IGFBP is widely expressed in various tissues. All of IGFBP-1 to IGFBP-6 regulate the interaction between IGF and its receptor by binding to IGF, and as a result, control the action of IGF.
  • Kikuchi A., Yamamoto, H. & Kishida, S., Multiplicity of the interactions of Wnt proteins and their receptors., Cell Signal 19, 659-71 (2007). Firth, S.M. & Baxter, R.C., Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins., Endocr Rev 23, 824-54 (2002). Mohan, S. & Baylink, D.J., IGF-binding proteins are multifunctional and act via IGF-dependent and-independent mechanisms., J Endocrinol 175, 19-31 (2002).
  • An object of the present invention is to provide a new humoral factor that regulates morphogenesis and cell proliferation, such as cardiac development and / or cardiomyocyte differentiation.
  • the present inventors have conducted intensive research using a cell line P19CL6 cells that differentiate into cardiomyocytes.
  • IGFBP-4 induces differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes in vitro
  • IGFBP-4 knockdown reduces cardiomyogenesis both in vitro and in vivo.
  • Frizzled 8 (hereinafter abbreviated as Frz8), which is a Wnt receptor for IGFBP-4, and physical properties of LRP5 / 6 Interaction of Wnt3A to inhibit Frz8 and LRP6 binding, and these results indicate that IGFBP-4 inhibits Wnt signaling and inhibition of Wnt signaling induces cardiomyocyte differentiation It revealed that. Furthermore, the present inventors have found that in addition to IGFBP-4, IGFBP-1, IGFBP-2, and IGFBP-6 also bind to Frz8 and LRP6 and inhibit Wnt signaling. The present invention has been achieved based on these findings.
  • the present invention relates to a Wnt signaling inhibitor containing at least one protein that is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and can bind to a Wnt receptor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • At least one protein that is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and can bind to a Wnt receptor is at least one protein selected from the following protein group, and at least one of the proteins
  • a Wnt signaling inhibitor containing an effective amount thereof as an active ingredient (1) a protein represented by the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8 in the sequence listing; (2) a protein having 70% or more homology with the protein of (1) and capable of binding to the Wnt receptor, and (3) 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence of the protein of (1)
  • a protein represented by an amino acid sequence having an amino acid mutation and capable of binding to a Wnt receptor is at least one protein selected from the following protein group, and at least one of the proteins
  • the present invention provides an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), wherein at least one protein capable of binding to a Wnt receptor is described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8 in the sequence listing.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention relates to the Wnt signaling inhibitor, which is a protein represented by an amino acid sequence.
  • the present invention is a protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein at least one protein that is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and can bind to the Wnt receptor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention relates to the Wnt signaling inhibitor.
  • the present invention also relates to any one of the aforementioned Wnt signaling inhibitors, wherein the Wnt receptor is low density lipoprotein receptor 6 (LRP6) and Frizzled8 (Frz8).
  • LRP6 low density lipoprotein receptor 6
  • Frizzled8 Frizzled8
  • the present invention relates to a Wnt signaling inhibitor containing at least one kind of polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention provides at least one polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and a protein capable of binding to a Wnt receptor, wherein the polynucleotide is selected from the following polynucleotide group: And a Wnt signaling inhibitor containing an effective amount of at least one of them as an active ingredient: (1) a polynucleotide represented by the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing, (2) a polynucleotide encoding a protein having 70% or more homology with the polynucleotide of (1) and capable of binding to a Wnt receptor; (3) a polynucleotide encoding a protein represented by a base sequence having a mutation of 1 to 30 nucleotides in the base sequence of the polynucleotide of (1) and capable of binding to a Wnt receptor, and (4) A polynucleotide comprising the polyn
  • At least one polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor is any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 in the sequence listing.
  • the Wnt signaling inhibitor which is a polynucleotide represented by the nucleotide sequence according to claim 1.
  • At least one kind of polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor is represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is related with the said Wnt signal transduction inhibitor which is a polynucleotide.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention relates to any one of the aforementioned Wnt signaling inhibitors, wherein the Wnt receptors are low density lipoprotein receptor 6 (LRP6) and Frizzled8 (Frz8).
  • LRP6 low density lipoprotein receptor 6
  • Frizzled8 Frizzled8
  • the present invention also relates to a method for inhibiting Wnt signaling, which comprises using at least one kind of insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention provides the method for inhibiting Wnt signaling, wherein at least one protein that is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and can bind to a Wnt receptor is at least one protein selected from the following protein group: About: (1) a protein represented by the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8 in the sequence listing; (2) a protein having 70% or more homology with the protein of (1) and capable of binding to the Wnt receptor, and (3) 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence of the protein of (1) A protein represented by an amino acid sequence having an amino acid mutation and capable of binding to a Wnt receptor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), wherein at least one protein capable of binding to the Wnt receptor is described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8 in the sequence listing.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the Wnt signaling inhibition method which is a protein represented by the amino acid sequence of
  • the present invention is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), wherein at least one protein capable of binding to a Wnt receptor is a protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention relates to a method for inhibiting Wnt signaling.
  • the present invention relates to any one of the aforementioned Wnt signaling inhibition methods, wherein the Wnt receptor is low density lipoprotein receptor 6 (LRP6) and Frizzled8 (Frz8).
  • LRP6 low density lipoprotein receptor 6
  • Frizzled8 Frizzled8
  • the present invention relates to a method for inhibiting Wnt signaling, comprising using at least one kind of polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • At least one polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor is at least one polynucleotide selected from the following polynucleotide group:
  • a certain method for inhibiting Wnt signaling is as follows: (1) a polynucleotide represented by the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing, (2) a polynucleotide encoding a protein having 70% or more homology with the polynucleotide of (1) and capable of binding to a Wnt receptor; (3) a polynucleotide encoding a protein represented by a base sequence having a mutation of 1 to 30 nucleotides in the base sequence of the polynucleotide of (1) and capable of binding to a Wnt receptor, and (4) A polynucleotide comprising the polynucleotide according to any one of (1) to (3) above.
  • the present invention relates to an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and at least one polynucleotide encoding a protein capable of binding to a Wnt receptor is any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 in the sequence listing.
  • the Wnt signaling inhibition method which is a polynucleotide represented by the nucleotide sequence according to claim 1.
  • the present invention provides that at least one polynucleotide encoding an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) that can bind to a Wnt receptor is represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is related with the said Wnt signal transmission inhibition method which is the polynucleotide which is made
  • the present invention also relates to any one of the aforementioned Wnt signaling inhibition methods, wherein the Wnt receptor is low-density lipoprotein receptor 6 (LRP6) and Frizzled 8 (Frz8).
  • LRP6 low-density lipoprotein receptor 6
  • Frizzled 8 Frizzled 8
  • the present invention relates to the use of a protein capable of binding to a Wnt receptor which is an insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) and / or a polynucleotide encoding the protein, in the manufacture of a Wnt signaling inhibitor.
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by enhancement of Wnt signaling, which contains any of the aforementioned Wnt signaling inhibitors as an active ingredient in an effective amount thereof.
  • the present invention also relates to a method for preventing and / or treating a disease caused by enhancement of Wnt signaling, which comprises administering an effective amount of any one of the aforementioned Wnt signaling inhibitors to a subject.
  • the present invention relates to the use of any of the aforementioned Wnt signaling inhibitors in the prevention and / or treatment of diseases caused by enhanced Wnt signaling.
  • the present invention relates to a cardiomyocyte differentiation inducing agent containing any one of the aforementioned Wnt signaling inhibitors as an effective ingredient.
  • the present invention also relates to a method for inducing cardiomyocyte differentiation, comprising contacting an effective amount of any one of the aforementioned Wnt signaling inhibitors with cells capable of differentiating into cardiomyocytes.
  • the present invention relates to the method for inducing cardiomyocyte differentiation, wherein the cells that can differentiate into cardiomyocytes are pluripotent stem cells.
  • the present invention relates to the method for inducing cardiomyocyte differentiation, wherein the cells that can differentiate into cardiomyocytes are embryonic stem cells.
  • the present invention also relates to a cardiomyocyte obtained by any one of the cardiomyocyte induction methods described above.
  • the present invention relates to the use of cardiomyocytes obtained by any of the cardiomyocyte induction methods described above.
  • the present invention relates to a method for inducing cardiomyocyte differentiation, comprising administering an effective amount of any one of the aforementioned Wnt signaling inhibitors to a subject.
  • a Wnt signaling inhibitor containing IGFBP a protein that binds to a Wnt receptor, and / or a polynucleotide that encodes the protein as an active ingredient.
  • the Wnt signal is involved in the control of morphogenesis, and is important for various phenomena such as development, stem cell differentiation control, growth regulation and survival, and cell canceration. Therefore, the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is useful in the pharmaceutical development field, the scientific research field, and the like as a drug that regulates morphogenesis and cell proliferation such as cardiac development and / or cardiomyocyte differentiation.
  • the present invention further provides a preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by enhanced Wnt signaling, and a cardiomyocyte differentiation inducing agent, containing the protein and / or a polynucleotide encoding the protein as an active ingredient. it can.
  • the present invention also provides a protein that binds to a Wnt receptor and is an IGFBP in the manufacture of a Wnt signaling inhibitor, a preventive and / or therapeutic agent for a disease caused by enhanced Wnt signaling, and a cardiomyocyte differentiation inducer, and The use of a polynucleotide encoding the protein can be provided.
  • the present invention provides an IGFBP that binds to a Wnt receptor and / or the protein in inhibiting Wnt signaling, preventing and / or treating a disease caused by enhanced Wnt signaling, and inducing cardiomyocyte differentiation.
  • Use of the encoding polynucleotide can be provided.
  • a method for inhibiting Wnt signaling comprising using a protein that binds to a Wnt receptor and / or a polynucleotide that encodes the IGFBP, and a disease caused by enhanced Wnt signaling
  • Prevention and / or treatment method cardiomyocyte differentiation inducing method, cardiomyocyte obtained by the cardiomyocyte differentiation inducing method, and use thereof can be provided.
  • FIG. 3 is a diagram showing that treatment with IGFBP-4 (1 ⁇ g / ml) induced differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes in the absence of dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMSO). Differentiation into cardiomyocytes was evaluated by induction of MF20 positive region (left panel) and induction of cardiac marker genes ( ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4) and cTnT protein (right panel). In the figure, IGFBP-4 is displayed as BP4 and the control as C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FIG. Differentiation into cardiomyocytes was evaluated by induction of MF20 positive region (upper panel) and induction of cTnT protein expression (middle panel).
  • combinations of neutralizing antibodies (the above combinations are indicated as ⁇ IGFs, and the control as C). It is a figure which shows that the variant IGFBP-4 (IGFBP-4-H74P) which cannot be couple
  • Cardiomyogenic activity was evaluated by differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes. Differentiation into cardiomyocytes was evaluated by induction of MF20 positive region (upper panel) and induction of cTnT protein expression (middle panel).
  • IGFBP-4-H74P is displayed as BP4 (H74P), and the control is displayed as C.
  • the combination of IGF-I and -II reduces the differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes induced by wild-type IGFBP-4 (left panel), but induced by mutant IGFBP-4-H74P It is a figure which shows that the differentiation to the myocardial cell of the P19CL6 cell made is not reduced (right panel).
  • FIG. 4 shows that IGFBP-4 reduced Wnt / ⁇ -catenin signaling in P19CL6 cells.
  • P19CL6 cells were transfected with an expression vector of TOPFLASH reporter gene and LRP6 or Frz8 and treated with Wnt3A and IGFBP-4, TOPFLASH activity decreased compared to treatment with Wnt3A alone.
  • IGFBP-4 is displayed as BP4.
  • XIGFBP-4 is displayed as XBP4.
  • XIGFBP-4 is displayed as XBP4.
  • IGFBP-4 interacted directly with LRP6N.
  • the interaction is the reaction of LRP6N-Myc with IGFBP-4-V5, immunoprecipitation (IP) with anti-Myc antibody followed by immunoblotting with anti-V5 or anti-Myc antibody (IB) (left panel), and anti-myc Evaluation was performed by immunoblotting (IB) (right panel) with anti-Myc antibody or anti-V5 antibody after immunoprecipitation (IP) with V5 antibody.
  • IB immunoblotting
  • IB right panel
  • IGFBP-4 interacted directly with Frz8 cysteine rich domain (henceforth abbreviated as Frz8CRD).
  • FIG. 4 shows that IGFBP-4 inhibited the binding of 125 I-labeled Wnt3A to LRP6N in a dose-dependent manner.
  • FIG. 4 shows that IGFBP-4 inhibited the binding of 125 I-labeled Wnt3A to Frz8CRD in a dose-dependent manner. It is a figure which shows the change of an IGFBP family member expression during the differentiation induction to the myocardial cell of P19CL6 cell by DMSO.
  • IGFBP expression was observed on the reverse transcription polymerase chain reaction (RT) on Day 0 (D0), Day 2 (D2), Day 4 (D4), Day 6 (D6) and Day 8 (D8) after addition of DMSO. -PCR). Shows that knockdown of IGFBP-4 in P19CL6 cells reduced cardiac marker ( ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4) expression (left panel) and cTnT expression (right panel) in response to DMSO treatment of the cells FIG. IGFBP-4 was knocked down using two types of IGFBP-4 siRNA (indicated as BP4-1 and BP4-2 in the figure).
  • IGFBP-3 siRNA shown as BP3 in the figure
  • IGFBP-5 siRNA shown as BP5 in the figure
  • the treatment with the neutralizing antibody (40 microgram / ml) with respect to IGFBP-4 reduced the differentiation to the myocardial cell of the P19CL6 cell induced by DMSO.
  • Differentiation into cardiomyocytes was evaluated by induction of MF20 positive region (left panel), and induction of cardiac marker genes ( ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4) and cTnT protein (right panel).
  • the neutralizing antibody against IGFBP-4 is expressed as ⁇ BP4.
  • ⁇ BP4 ⁇ MHC-green fluorescent protein
  • Upper left panel shows IGFBP-4 staining
  • upper right panel shows GFP expression of differentiated cardiomyocytes
  • lower left panel shows nuclear staining with DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)
  • lower right panel shows superimposed images Show.
  • Scale line 100 ⁇ m.
  • MF20 positive region left panel
  • cardiac marker genes ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4
  • cTnT protein right panel.
  • expression of early cardiac marker Nkx2.5, mature cardiac marker cardiac troponin I (cTnI), liver marker Hex, and XIGFBP-4 mRNA were expressed in stages 34, 38 and 42 in situ It is a figure which shows the result of having analyzed hybridization. In the figure, XIGFBP-4 mRNA is indicated as XBP4.
  • the white, diagonal, crossed, stippled, and black columns indicate normal heart, abnormal heart, small heart, no heart and death cases, respectively.
  • the right column shows a section of embryos injected with control and MO. The arrow points to the heart in the control embryo. No heart-like structures were observed in embryos injected with MO.
  • IGFBP-4 did not change FOPFLASH activity which is a negative control of TOPFLASH. It is a figure which shows that IGFBP-4 did not change the activation by BMP of a BRE-luc reporter gene. BMP-responsive BRE-luc was activated in a concentration-dependent manner by BMP2 (left panel), and this activation was not altered by IGFBP-4 (right panel). In the figure, IGFBP-4 is displayed as BP4. Reporter gene assays were performed in 293 cells. It is a figure which shows the result of having investigated inhibition of the classical Wnt pathway by IGFBP-4 by the animal cap assay.
  • LRP6, ⁇ -catenin, ⁇ -galactosidase, or XIGFBP-4 RNA was injected into the animal pole of each 2-cell embryo, the animal cap was excised in step 85, and the Wnt target genes (Siamois and Xnr-3) This was performed by measuring the expression of.
  • XIGFBP-4 reduced the expression of Siamois and Xnr-3 induced by LRP6, but did not affect the expression induced by ⁇ -catenin.
  • ODC represents ornithine decarboxylase and was measured as a control.
  • FIG. 4 shows that IGFBP-4 inhibited classical Wnt signaling activated by Wnt3A or LRP6 (left panel and right panel, respectively).
  • IGFBP-4 Activation of classical Wnt signaling was measured by TOPFLASH reporter gene assay and assessed by TOPFLASH activity.
  • IGFBP-4 is displayed as BP4.
  • the TOPFLASH reporter gene assay was performed in 293 cells. IGFBP-4 did not inhibit classical Wnt signaling induced by ⁇ -catenin, Dishevelled-1 (left panel), or lithium chloride (right panel), a GSK3 (glycogenglycsynthase kinase 3) inhibitor
  • the TOPFLASH reporter gene assay was performed in 293 cells.
  • FIG. 6 shows the results of binding assays between 125 I-labeled Wnt3A and Frz8CRD in the presence or absence of various concentrations of IGFBP-4.
  • the rectangular symbol indicates no IGFBP-4
  • the circular symbol indicates IGFBP-4 50 nM
  • the triangular symbol indicates IGFBP-4 100 nM.
  • the inset is a line Weber-Burg plot, indicating that IGFBP-4 is a competitive inhibitor of Wnt3A binding to Frz8CRD.
  • 1 is a schematic diagram of an LRP6 deletion mutant (LRP6 deletion mutants) used in Example 1.
  • FIG. All deletion mutants are soluble.
  • SP represents a signal peptide
  • ⁇ -pro represents a ⁇ -propeller domain
  • EGF represents an EGF-like domain
  • LDLR represents an LDL receptor type A repeat
  • TM represents a transmembrane domain.
  • IGFBP-4 immunoprecipitation
  • IB immunoblot with anti-V5 antibody or anti-Myc antibody
  • IB immunoblotting
  • IB immunoblotting
  • IGFBP-4 is displayed as BP4. It is a figure which shows that IGFBP-4 interacted with L mutant of LRP6, E1-2 / L mutant, and E3-4 / L mutant.
  • IGFBP-4 Interaction between each LRP6 mutant added with Myc tag and IGFBP-4-V5, immunoprecipitation (IP) with anti-Myc antibody followed by immunoblot with anti-V5 antibody or anti-Myc antibody (IB) (left) Panel) and immunoblotting (IB) (right panel) with anti-Myc antibody or anti-V5 antibody after immunoprecipitation (IP) with anti-V5 antibody (right panel).
  • IGFBP-4 is displayed as BP4. It is a figure which shows that IGFBP-4 interacted with the E1-2 variant and E3-4 variant of LRP6.
  • Dkk1 used as a control interacted mainly with the LRP6E3-4 mutant.
  • IGFBP-4 and the LRP6 mutant were achieved by reacting each LRP6 mutant with a Myc tag and IGFBP-4-V5, followed by immunoprecipitation (IP) with anti-Myc antibody and immunoblotting with anti-Myc antibody.
  • IP immunoprecipitation
  • IB immunoblotting
  • IB immunoblotting
  • IB immunoblotting with anti-Myc antibody after immunoprecipitation (IP) with the anti-V5 antibody
  • IGFBP-4 interacted with LRP6 and Frz8, whereas the carboxy terminal thyroglobulin domain deletion mutant did not interact with them.
  • Immunoprecipitation (IP) with anti-Myc antibody by reacting full length IGFBP-4 with V5 tag, amino terminal deleted IGFBP-4 and carboxy terminal deleted IGFBP-4 with Myc-tagged LRP6 or Frz8 The interaction between each IGFBP-4 and Frz8 or LRP6 was evaluated by subsequent immunoblotting with an anti-V5 antibody (IB) or immunoblotting with an anti-Myc antibody (IB) (middle panel). A schematic diagram of full-length IGFBP-4 and IGFBP-4 deletion mutants is shown in the left panel.
  • IGFBP-4 full-length IGFBP-4 is indicated as FL or BP4FL
  • amino-terminal deletion IGFBP-4 is indicated as ⁇ N or BP4 ⁇ N
  • carboxy-terminal deletion IGFBP-4 is indicated as ⁇ C or BP4 ⁇ C.
  • IGF means an IGF binding domain
  • TG means a thyroglobulin domain.
  • IGFBP-4 (1 ⁇ g / ml) was applied from day 0 to day 3 (D0-3), differentiation of ES cells into cardiomyocytes was suppressed, while from day 3 Cardiac development was enhanced when applied up to day 5 (D3-5).
  • ES cells were stably transfected with ⁇ MHC-GFP reporter gene, and differentiation into cardiomyocytes was induced by the hanging drop method.
  • IGFBP-4 (1 ⁇ g / ml) was applied from day 0 to day 3 (D0-3), differentiation of ES cells into cardiomyocytes was suppressed, while from day 3 Cardiac development was enhanced when applied up to day 5 (D3-5).
  • the degree of differentiation of ES cells into cardiomyocytes was evaluated by the ratio of GFP positive regions. It is a figure which shows the result of having examined the effect of IGFBP-4 with respect to the differentiation induction of the ES cell to the cardiac muscle cell.
  • ES cells were stably transfected with ⁇ MHC-GFP reporter gene, and differentiation into cardiomyocytes was induced by the hanging drop method.
  • IGFBP-4 (1 ⁇ g / ml) was applied from day 0 to day 3 (D0-3), differentiation of ES cells into cardiomyocytes was suppressed, while from day 3 Cardiac development was enhanced when applied up to day 5 (D3-5).
  • the degree of differentiation of ES cells into cardiomyocytes was evaluated by expression of cardiac marker genes ( ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4) and cTnT protein (right panel). It is a figure which shows the expression of the IGFBP family member in the differentiation into the cardiac muscle cell of an ES cell. IGFBP expression was measured by RT-PCR on day 0 (D0), day 3 (D3), day 4 (D4), and day 5 (D5) of differentiation induction.
  • ES cells are stably transfected with ⁇ MHC-GFP reporter gene, and IGFBP-4 is knocked down using two types of IGFBP-4 siRNA (labeled BP4-1 and BP4-2 in the figure)
  • IGFBP-4 siRNA labeled BP4-1 and BP4-2 in the figure
  • Differentiation into cardiomyocytes was induced by the hanging drop method.
  • Differentiation into cardiomyocytes was evaluated by cardiac marker gene ( ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4) expression (left panel), GFP positive region and cTnT expression (right panel).
  • Scale line 100 ⁇ m. It is a figure which shows that the strong signal was detected by the pharyngeal arch, the liver bud, and the limb bud in the in-situ hybridization analysis of IGFBP-4 in a mouse embryo (E95). S and AS show the results of in situ hybridization analysis using a sense probe and an antisense probe, respectively. Partial sequence of two alleles of XIGFBP-4, target sequence and position of MO1 and MO2 for XIGFBP-4, MO sensitivity (MO-s), partial sequence of XIGFBP-4 cDNA, and MO resistance (MO-r) It is a figure which shows the partial arrangement
  • the mismatch introduced to create the start codon ATG and the MO-resistant XIGFBP-4 cDNA is underlined. It is a figure which shows the result of having verified the activity and specificity of MO1 and MO2 with respect to XIGFBP-4.
  • MO-sensitive (MO-s) and MO-resistant (MO-r) XIGFBP-4-Myc mRNA was injected into Xenopus embryos. Expression of XIGFBP-4-Myc protein translated from MO-sensitive mRNA was reduced by co-injection with MO1 or MO2, whereas protein expression from MO-resistant mRNA was not affected. RT-PCR analysis indicated that the injected mRNA (injected mRNA) was equivalent.
  • FIG. 6 illustrates the specificity of the cardiac phenotype induced by MO1 and MO2 for XIGFBP-4.
  • XIGFBP-4 MO1 or MO2 caused a cardiac defect.
  • white columns, diagonal lines, crossing columns, stippling columns, and black columns indicate normal heart, abnormal heart, small heart, no heart and death cases, respectively.
  • FIG. 5 shows that normal heart development was impaired by activation of the Wnt pathway.
  • Plasmid DNA (pCSKA-Xwnt8), which encodes Xwnt8 and is under the control of the cytoskeletal actin promoter, is transformed into two dorsal plant blastomeres destined for the heart and liver primordium at the 8-cell stage in Xenopus embryos. Infusion into the dorsal region activated Wnt in the cardiogenic region. Embryos injected with pCSKA-Xwnt8 (lower panel) had a reduced heart size compared to control embryos (upper panel) at stage 42. It is a figure which shows that the heart development in the late stage of embryogenesis was caused by activation of the Wnt pathway.
  • Xwnt8 mRNA was introduced by electroporation near the heart primordium of Xenopus at stage 28. At this time, GFP-mRNA was co-injected to evaluate the efficiency of the electroporation method. In stage 34, GFP expression was observed in the cardiogenic part (upper panel, head on the left and dorsal side up). Abnormalities in heart morphogenesis were observed at stage 42 in the embryos injected with Xwnt8 and GFP mRNA (lower panel) compared to control embryos injected with GFP mRNA alone (middle panel). It is a figure which shows the result of having quantitatively analyzed the effect of Wnt activation on heart development.
  • the amount of nuclear ⁇ -catenin increased by treatment of L cells with Wnt3A was decreased by IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6, but not by IGFBP-3 and IGFBP-5. It is a figure which shows that. In the figure, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 and IGFBP-6 are denoted as BP1, BP2, BP3, BP4, BP5 and BP6, respectively. In cells transfected with the TOPFLASH reporter gene, the TOPFLASH activity increased by Wnt3A treatment was decreased by IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6, but decreased by IGFBP-3 and IGFBP-5.
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 and IGFBP-6 are denoted as BP1, BP2, BP3, BP4, BP5 and BP6, respectively. It is a figure which shows that IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6 all interacted with LRP6, but IGFBP-3 and -5 did not interact.
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 and IGFBP-6 are denoted as BP1, BP2, BP3, BP4, BP5 and BP6, respectively.
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6 all interacted with Frz8, but IGFBP-3 and -5 did not interact.
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 and IGFBP-6 are denoted as BP1, BP2, BP3, BP4, BP5 and BP6, respectively.
  • the present invention relates to a Wnt signaling inhibitor containing an effective amount of a protein that is an IGFBP and can bind to a Wnt receptor as an active ingredient.
  • the Wnt signaling inhibitor according to the present invention may be an IGFBP that contains one type of protein that can bind to a Wnt receptor, and contains two or more types of the protein. Good.
  • Wnt signal transduction refers to signal transduction that occurs in the cell by Wnt belonging to the family of secreted glycoprotein ligands binding to its cell membrane receptor.
  • Wnt signaling is broadly divided into classical Wnt signaling and non-classical Wnt signaling.
  • Classical Wnt signaling refers to Wnt signaling that functions in a ⁇ -catenin-dependent manner.
  • Wnt protein binds to its cell surface receptor Frizzled family and activates the deschedled family protein, and as a result induces nuclear translocation of ⁇ -catenin and activates transcription factor Tcf, which is a Wnt-responsive gene Signal transduction that promotes transcription.
  • PCP pathway Two types of pathways known as PCP pathway and Ca 2+ pathway are known for non-classical Wnt signaling.
  • the PCP pathway is characterized by activation of Rho, which is a low molecular weight G protein, and Jun kinase belonging to the MAP kinase family.
  • the Ca 2+ pathway is characterized by the activation of PKC and calmodulin kinase, which are downstream protein kinases, due to an increase in intracellular calcium concentration.
  • the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is preferably a classic Wnt signaling inhibitor.
  • IGFBP inhibits Wnt signaling by binding to Wnt receptor and inhibiting the binding between Wnt and Wnt receptor.
  • Wnt receptors to which IGFBP binds include Frizzled and LRP, more preferably Frz8, LRP6, and LRP5.
  • Bind to a Wnt receptor means to interact by non-covalent bonds such as hydrogen bonds, hydrophobic bonds or electrostatic interactions so as to form a complex with a Wnt receptor protein. The binding between the Wnt receptor and the protein is sufficient if the Wnt receptor and the protein bind to each other in a part of the molecule.
  • “Inhibiting the binding between Wnt and the Wnt receptor” means reducing the binding between Wnt and the Wnt receptor or preventing the binding. “Inhibiting Wnt signaling” refers to inhibiting the generation of Wnt signaling and / or reducing Wnt signaling.
  • the IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is not particularly limited as long as it is an IGFBP that can bind to a Wnt receptor.
  • IGFBP that binds to the Wnt receptor and inhibits Wnt signaling is suitable.
  • Preferred examples of IGFBP that can bind to the Wnt receptor include IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6.
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4 and IGFBP-6 all inhibited Wnt signaling induced by Wnt3A (see Example 2).
  • IGFBP-4 has the highest binding activity with Wnt receptor and Wnt signaling inhibition action. Therefore, IGFBP-4 can be more preferably exemplified as an IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention.
  • the IGFBP may be derived from any species, and is preferably derived from the same species as the subject to which the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is applied and the tissue or cell derived from the subject. is there.
  • the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is applied to human and human-derived tissues or cells
  • the IGFBP contained in the inhibitor is preferably derived from human.
  • IGFBP-4 is a human-derived protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • IGFBP-1 is preferably a human-derived protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • IGFBP-2 is a human-derived protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6.
  • IGFBP-6 is a human-derived protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8.
  • the range of IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is represented by the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8. Proteins that have sequence homology with the protein and that can bind to the Wnt receptor are included.
  • the sequence homology is usually about 50% or more of the entire amino acid sequence, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and even more preferably about 95% or more. .
  • the range of IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is 1 in the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8. 1 or more, for example 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2
  • a protein represented by an amino acid sequence having a mutation such as amino acid deletion, substitution, addition or insertion, and capable of binding to a Wnt receptor is included.
  • the degree of mutation and the position thereof are not particularly limited as long as the protein having the mutation is a protein capable of binding to a Wnt receptor, and more preferably a protein that inhibits Wnt signaling.
  • a protein having such a mutation may be a protein naturally occurring, for example, by mutation or post-translational modification, or may be a protein obtained by introducing a mutation based on a gene derived from nature.
  • Means for introducing mutation are known per se, and for example, site-specific mutagenesis, gene homologous recombination, primer extension, polymerase chain reaction (PCR), etc. can be used alone or in appropriate combination. For example, it may be carried out according to the method described in the book (eg Sambrook J.,. Russell DW, Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory) Yes, Ulmer's technology (Ulmer KM, Science, 219, 666-671 (1983)) can also be used.
  • homologous amino acids polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic amino acids, Mutual substitution between hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.
  • Selection of IGFBP that can bind to the Wnt receptor can be carried out, for example, by performing a binding reaction with IGFBP using Frz8 or LRP6 which are Wnt receptors.
  • the binding reaction can also be performed using the Wnt binding domain Frz8 cysteine rich domain (Frz8CRD), LPR6 extracellular part (LRP6N), or the like (see Example 1).
  • the binding reaction can be performed by conventional protein binding assays.
  • IGFBP can be modified as long as it is not accompanied by a significant change in function such as modification of its constituent amino group or carboxyl group, for example by amidation.
  • it may be a protein labeled by adding another protein or the like to the amino terminal side or the carboxy terminal side directly or indirectly using a genetic engineering technique or the like via a linker peptide or the like. .
  • labeling so that the basic properties of IGFBP are not inhibited is desirable.
  • proteins to be added include enzymes such as glutathione, S-transferase, ⁇ -galactosidase, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag.
  • enzymes such as glutathione, S-transferase, ⁇ -galactosidase, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag.
  • tag peptides include, but are not limited to, tag peptides, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate or phycoerythrin, maltose binding protein, Fc fragment of immunoglobulin or biotin. It is also possible to label with a radioisotope.
  • the Wnt signal inhibitor containing these labeled IGFBPs can be effectively used for eluci
  • IGFBP is available on the market.
  • IGFBP can be produced by a general chemical synthesis method.
  • a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method is known as a protein chemical synthesis method, and any of them can be used.
  • the protein synthesis method is based on the amino acid sequence information, and a so-called stepwise elongation method in which each amino acid is sequentially linked one by one to extend the chain, and a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance.
  • the fragment condensation method in which each fragment is then subjected to a coupling reaction, and IGFBP can be synthesized by any of them.
  • Condensation methods used in the above protein synthesis methods can also follow conventional methods, for example, azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + addition Examples thereof include 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide method, and Woodward method.
  • the IGFBP obtained by chemical synthesis can be further appropriately purified according to various conventional purification methods. Separation and / or purification can be performed with the function of IGFBP, for example, binding activity with IGF or Wnt receptor as an index.
  • the separation operation method for example, ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis method and the like can be used alone or in appropriate combination.
  • a specific adsorption method using a specific antibody against IGFBP for example, affinity chromatography using a column to which the antibody is bound.
  • IGFBP is also based on general genetic engineering techniques (Sambrook J., Russell DW, Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory; Ulmer KM, Science, 219, 666-671 (1983); Ehrlich HA, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, 1989 (Stockton Press, New York etc.).
  • a cDNA library is prepared from various cells and tissues in which the expression of the gene encoding IGFBP has been confirmed, or cultured cells derived therefrom according to a conventional method, and appropriate primers specific to the gene are prepared. It can be obtained by amplifying the gene by use and inducing expression of the obtained gene by a known genetic engineering technique.
  • IGFBP-4 is observed at a high level in the liver, and is also observed in ovary, thyroid gland, smooth muscle cells and the like. Expression of the gene encoding IGFBP-1 has been observed in the liver. Expression of the gene encoding IGFBP-2 is observed in the prostate, liver, heart, pancreas and the like. Expression of the gene encoding IGFBP-6 is observed in smooth muscle, prostate, thyroid, cardiomyocytes and the like.
  • IGFBP can be produced by genetic engineering techniques. For example, a gene encoding IGFBP is first inserted into an appropriate expression vector, and the resulting recombinant vector is introduced into an appropriate host cell to transform the transformant.
  • Expression vectors and host cells can be appropriately selected from those generally used for protein expression.
  • the culture conditions and culture method of the transformant can be carried out under conditions and methods known per se that are optimal for the selected host.
  • IGFBP can be appropriately recovered from the obtained culture. Since IGFBP is a secreted protein, it is produced not only in the transformant but also in the culture solution. Therefore, IGFBP can be recovered from the disrupted transformant after culturing or the culture solution by the various conventional purification methods.
  • the present invention also relates to a Wnt signaling inhibitor containing an effective amount of a polynucleotide encoding an IGFBP and a protein capable of binding to a Wnt receptor as an active ingredient.
  • the Wnt signaling inhibitor according to the present invention may be an IGFBP that contains one type of polynucleotide encoding a protein capable of binding to a Wnt receptor, and two or more types of the polynucleotides may be used. It may be contained.
  • IGFBP can be expressed in an appropriate cell by introducing a polynucleotide encoding a protein that can bind to a Wnt receptor into IGFBP. Since IGFBP is a secreted protein, it is secreted extracellularly. Therefore, the drug containing the above polynucleotide acts as a Wnt signaling inhibitor through the expression of IGFBP by being introduced into the cell. Introduction of a polynucleotide into a cell can be performed by a conventional genetic engineering technique using an appropriate expression vector into which the polynucleotide has been inserted.
  • a range of Wnt signaling inhibitors containing a polynucleotide encoding a protein capable of binding to a Wnt receptor, which is an IGFBP may be referred to as an expression vector in which the polynucleotide is inserted (hereinafter referred to as IGFBP expression vector).
  • IGFBP expression vector a Wnt signal transduction inhibitor containing the polynucleotide and a cell containing the polynucleotide and expressing the polynucleotide.
  • the IGFBP-expressing cell may preferably be a cell transfected with an IGFBP expression vector.
  • the expression vector and the cell into which the expression vector is transfected can be appropriately selected from those generally used for protein expression.
  • the vector DNA is not particularly limited as long as it can be replicated in the host.
  • a part of the DNA other than the part necessary for propagation is partially present. Missing vector DNA may be used.
  • plasmid, bacteriophage and virus-derived vector DNA can be exemplified.
  • plasmid DNA include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, and yeast-derived plasmids.
  • An example of bacteriophage DNA is ⁇ phage.
  • vector DNA derived from viruses examples include vectors derived from animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, papova virus, SV40, fowlpox virus, and pseudorabies virus, or vectors derived from insect viruses such as baculovirus.
  • vector DNA derived from a transposon, an insertion element, or a yeast chromosome element can be exemplified.
  • vector DNA prepared by combining these, specifically, vector DNA (cosmid, phagemid, etc.) prepared by combining plasmid and bacteriophage genetic elements can be exemplified.
  • a cell is a biological origin cell
  • it is an animal origin cell, More preferably, it is a mammal origin cell, More preferably, it is a human origin cell.
  • the cell is preferably an isolated cell or a cultured cell, and more preferably subjected to a growth suppression treatment.
  • the cell growth inhibition treatment can be performed by a known method such as irradiation.
  • the polynucleotide contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding IGFBP and a protein capable of binding to a Wnt receptor.
  • a polynucleotide encoding IGFBP that binds to a Wnt receptor and inhibits Wnt signaling is suitable.
  • a polynucleotide encoding IGFBP capable of binding to a Wnt receptor preferably a polynucleotide encoding IGFBP-1, a polynucleotide encoding IGFBP-2, a polynucleotide encoding IGFBP-4, and IGFBP-6
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6 IGFBP-4 has the highest binding activity with Wnt receptor and Wnt signaling inhibition action.
  • the polynucleotide encoding IGFBP-4 can be exemplified as the polynucleotide encoding IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention.
  • the polynucleotide encoding IGFBP may be derived from any species, and is preferably derived from the same species as the application target of the Wnt signaling inhibitor according to the present invention.
  • the application target of the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is human or human tissue or cell
  • the polynucleotide encoding IGFBP contained in the inhibitor is preferably human.
  • a preferred example of the polynucleotide encoding IGFBP-4 is a human-derived polynucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a human-derived polynucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 can be exemplified.
  • polynucleotide encoding IGFBP-2 is preferably a human-derived polynucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • polynucleotide encoding IGFBP-6 is preferably a human-derived polynucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the range of the polynucleotide encoding IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention includes a base according to any one selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7.
  • a polynucleotide encoding a protein having sequence homology and capable of binding to a Wnt receptor is included.
  • the sequence homology is usually about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more of the entire base sequence. .
  • the range of the polynucleotide encoding IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention is also described in any one selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7. 1 or more, for example 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, particularly preferably 1
  • a polynucleotide represented by a nucleotide sequence having a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of one or two nucleotides and encoding a protein capable of binding to a Wnt receptor is included.
  • the degree of mutation and the position thereof are a polynucleotide encoding a protein that can bind to a Wnt receptor, and more preferably a polynucleotide encoding a protein that inhibits Wnt signaling.
  • the polynucleotide having such a mutation may be a naturally occurring polynucleotide, or a polynucleotide obtained by introducing a mutation based on a gene derived from nature, for example, a polynucleotide having an induced mutation.
  • Means for introducing a mutation are known per se, and for example, site-specific mutagenesis, gene homologous recombination, primer extension, PCR or the like can be used alone or in appropriate combination.
  • the range of polynucleotides encoding IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention includes polynucleotides including the above polynucleotides.
  • Selection of a polynucleotide encoding IGFBP that can bind to a Wnt receptor is achieved by, for example, expressing a polynucleotide to be tested in a cell to obtain a protein encoded by the polynucleotide, and using the Wnt receptor Frz8 or LRP6.
  • the binding reaction can also be performed using their Wnt binding domain, Frz8 cysteine-rich domain (Frz8CRD), LRP6 extracellular part (LRP6N), etc. (see Example 1).
  • the binding reaction can be performed by conventional protein binding assays.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting Wnt signaling, which comprises using a protein that is IGFBP and can bind to a Wnt receptor.
  • the method for inhibiting Wnt signaling according to the present invention may be one using IGFBP and one type of protein capable of binding to a Wnt receptor, or two or more types of the protein.
  • Inhibition of Wnt signaling can be achieved by contacting a protein that can bind to a Wnt receptor, which is IGFBP, and a cell having a Wnt signaling pathway (hereinafter sometimes referred to as a target cell).
  • a protein that can bind to the Wnt receptor which is IGFBP
  • the treatment in vitro can be performed by adding a protein capable of binding to the Wnt receptor, which is IGFBP, during the culture of the target cells.
  • Treatment in vivo can be performed by administering to the subject a protein that can bind to the Wnt receptor.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting Wnt signaling, which comprises using a polynucleotide encoding a protein that is IGFBP and can bind to a Wnt receptor.
  • the method for inhibiting Wnt signaling according to the present invention may use one type of polynucleotide that encodes a protein that is IGFBP and can bind to a Wnt receptor, and uses two or more types of the polynucleotides. It may be a thing.
  • Inhibition of Wnt signaling can be achieved by introducing into a cell a polynucleotide that encodes a protein that is IGFBP and can bind to a Wnt receptor. Since IGFBP is a secreted protein, IGFBP expressed intracellularly is secreted extracellularly and inhibits Wnt signaling by inhibiting the binding of Wnt and Wnt receptors. Moreover, since IGFBP has an effect on the paracrine mode, Wnt signaling can be inhibited by treating target cells with IGFBP-expressing cells that secrete IGFBP.
  • the IGFBP-expressing cell may preferably be a cell transfected with an IGFBP expression vector.
  • Treatment of a target cell with a polynucleotide encoding an IGFBP-binding protein capable of binding to a Wnt receptor, an IGFBP expression vector, and an IGFBP-expressing cell may be performed in vitro or in vivo.
  • the treatment in vitro can be carried out by introducing the above-mentioned polynucleotide or IGFBP expression vector into the cultured target cells by a known genetic engineering technique, or by adding IGFBP-expressing cells to the target cell culture.
  • the treatment in vivo can be carried out by administering the polynucleotide, IGFBP expression vector, or IGFBP expression cell to the subject.
  • the cell When administering an IGFBP-expressing cell in an in vivo treatment, the cell is preferably an isolated cell or a cultured cell, and more preferably a cell that has undergone a growth inhibition treatment.
  • the cell growth inhibition treatment can be performed by a known method such as irradiation.
  • cells collected from a subject are preferably transformed with an expression vector into which a polynucleotide encoding a protein capable of binding to Wnt receptor, which is IGFBP, and then administered to the same subject.
  • the present invention also relates to the use of a protein capable of binding to a Wnt receptor, which is IGFBP, and / or a polynucleotide encoding the protein, in the manufacture of a Wnt signaling inhibitor.
  • the present invention also relates to a preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by enhancement of Wnt signaling, which contains the above-mentioned Wnt signaling inhibitor as an active ingredient in an effective amount thereof. Furthermore, the present invention relates to a method for preventing and / or treating a disease caused by enhanced Wnt signaling, which comprises using the above-mentioned Wnt signaling inhibitor. The present invention also relates to the use of the Wnt signaling inhibitor in the prevention and / or treatment of diseases caused by enhanced Wnt signaling.
  • Wnt is a protein that regulates morphogenesis and is known to be involved in various phenomena such as development, stem cell differentiation control, and cell canceration. It has also been reported that Wnt is an important factor for stem cell proliferation regulation and survival (Non-patent Documents 5 and 6). Therefore, abnormalities in Wnt signaling cause diseases due to developmental abnormalities such as congenital heart failure and diseases related to abnormal cell functions, such as cancer diseases.
  • Classical Wnt signaling plays a critical role in cardiomyocyte differentiation (Non-Patent Documents 2 and 4).
  • Classic Wnt signaling also inhibits heart development in chick and frog embryos, and Wnt antagonists such as Dkk (dickkopf) and crescents secreted from the anterior endoderm or organizer region are Wnt It has been shown to induce cardiac development in the anterior lateral mesoderm against the mediated inhibition signal (Naito, AT et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt / beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Tzahor, E.
  • classical Wnt signaling has a counter-effect on heart development at various stages of development. That is, classical Wnt signaling (i) promotes cardiac development at the time of gastrulation or mesoderm specification, and (ii) cardiac development at the time when cardiac mesoderm is specified in the anterior lateral mesoderm (Iii) promotes the proliferation of cardiac progenitor cells in the secondary heart region, and (iv) inhibits cardiac development later in the development of the embryonic heart.
  • the Wnt signaling inhibitor according to the present invention can be used for the preparation of cardiomyocytes by inducing differentiation of cardiomyocytes, and can also be applied to the induction of heart development.
  • IGFBP contained in the Wnt signaling inhibitor according to the present invention induced cardiomyocyte differentiation (see Example 1).
  • IGFBP-4 induced the differentiation of mouse-derived cell lines P19CL6 cells and embryonic stem cells (ES cells) into cardiomyocytes.
  • ES cells embryonic stem cells
  • knockdown of IGFBP-4 or activation of the Wnt pathway impaired normal heart development in Xenopus embryos, but cardiac defects due to knockdown of IGFBP-4 were also associated with IGFBP- It recovered by the expression of 4.
  • Such cardiomyocyte-inducing activity and cardiogenic activity of IGFBP-4 are due to WGF signaling inhibitory action of IGFBP-4. Inhibition of Wnt signaling in heart development is necessary late in development when the heart is already formed in the abdomen and begins to grow and reorganize to maintain embryonic blood circulation. Therefore, when IGFBP is used for, for example, differentiation of ES cells into cardiomyocytes, it is preferable to apply them after the late-stage embryoid body formation.
  • “Differentiation” or “differentiation of cells” refers to cells that have specific characteristics morphologically and functionally from so-called undifferentiated cells that do not have specific characteristics morphologically and functionally. What happens. In addition, specific genes that were not found in undifferentiated cells are expressed during the differentiation process. Expression of such genes is also included in “differentiation”. “Inducing differentiation” refers to generating cells having morphological and functional characteristics from undifferentiated cells. In addition, expression of a specific gene not found in undifferentiated cells is also included in “inducing differentiation”.
  • “Differentiation of cardiomyocytes” refers to the formation of morphological and functional cells as cardiomyocytes by the division of undifferentiated cells.
  • expression of genes characteristic of cardiomyocytes is also included in “cardiomyocyte differentiation”. Cardiomyocytes exhibit adhesion and extensibility as morphological features. As a functional feature, cardiomyocytes spontaneously pulsate when stratified. Examples of genes characteristic of cardiomyocytes include cardiac expression marker genes such as ⁇ myosin heavy chain ( ⁇ MHC) gene, Nkx2.5 gene, GATA-4 gene, cardiac troponin T (cTnT) gene and the like. “Inducing differentiation of cardiomyocytes” refers to generating cells having morphological and functional characteristics as cardiomyocytes from undifferentiated cells. In addition, expression of a gene characteristic of cardiomyocytes is also included in “inducing cardiomyocyte differentiation”.
  • a cardiomyocyte differentiation inducing agent containing an effective amount of the Wnt signaling inhibitor and a cardiomyocyte differentiation inducing method using the Wnt signaling inhibitor can be provided.
  • Induction of cardiomyocyte differentiation can be achieved by bringing the Wnt signaling inhibitor into contact with cells that can differentiate into cardiomyocytes.
  • Examples of cells that can differentiate into cardiomyocytes include pluripotent stem cells.
  • a “pluripotent stem cell” refers to a cell that can differentiate into cells having functional and morphological characteristics that constitute various tissues or organs and has the ability to self-replicate. Examples of pluripotent stem cells include tissue stem cells, embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells.
  • tissue stem cell refers to an undifferentiated cell that exists in an adult tissue and has a self-replicating ability.
  • tissue stem cells include bone marrow-derived stem cells and heart-derived stem cells.
  • ES cells are cell lines of stem cells made from the inner cell mass belonging to part of the embryo at the blastocyst stage, which is the early stage of animal development, and the functional and morphological structures that make up various tissues or organs Refers to a cell that can be differentiated into a characteristically characterized cell.
  • Artificial pluripotent stem cells refer to cells that have been made pluripotent by introducing several types of transcription factor genes into somatic cells such as fibroblasts.
  • the contact between the Wnt signaling inhibitor and a cell capable of differentiating into a cardiomyocyte can be carried out by either in vitro treatment or in vivo treatment.
  • In vitro treatment can be carried out by adding the above Wnt signaling inhibitor during cell culture.
  • the treatment in vivo can be performed by administering the above Wnt signaling inhibitor to the subject.
  • cardiomyocytes obtained by the cardiomyocyte differentiation inducing method and its use.
  • the cardiomyocytes are preferably cultured cardiomyocytes.
  • Cardiomyocytes were induced by the expression of cardiac expression marker genes such as ⁇ myosin heavy chain ( ⁇ MHC) gene, Nkx2.5 gene, GATA-4 gene, etc., and expression of cardiac troponin T (cTnT) protein in the cells. Can be confirmed. Measurement of the expression of these genes can be carried out by a gene detection method known per se. Specific examples of the gene detection method include plaque hybridization, colony hybridization, Southern blot method, Northern blot method, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, or RT-PCR. In addition, gene detection methods at the cell level using in-situ RT-PCR, in-situ hybridization, and the like can be exemplified. Moreover, you may detect the protein encoded by this gene using the antibody which recognizes this protein specifically.
  • ⁇ MHC ⁇ myo
  • the cardiomyocytes provided by the cardiomyocyte differentiation inducing method according to the present invention can be used for the construction or reconstruction of myocardial tissue in vitro or in vivo.
  • regenerative medicine by reconstructing myocardial tissue has been energetically studied as a treatment method for heart failure.
  • Heart failure is a pathophysiological condition in which cardiac function, such as the contraction and expansion of the heart, is reduced and the blood circulation necessary for whole body tissues is insufficient.
  • Cardiac disease, myocardial infarction, and valvular heart disease It is a condition that appears at the end of the period. In many of such heart diseases, damage or degeneration of myocardial tissue is observed.
  • Reconstruction of damaged or degenerated myocardial tissue can treat these diseases and prevent and / or treat heart failure.
  • Reconstruction of myocardial tissue is performed by injecting myocardial cells into damaged or degenerated myocardial tissue, or by culturing myocardial cell sheets obtained by culturing myocardial cells or layered cardiomyocytes laminated with cardiomyocyte sheets It can be carried out by transplanting using a conventional technique. Further, it has been reported that stratified cardiomyocytes spontaneously show pulsation when transplanted into a living body, and can be used as a heart for transplantation.
  • cardiomyocytes provided by this method are useful for the construction or reconstruction of myocardial tissue, they can be used for treatment aimed at repairing the myocardium in the heart in which damage or degeneration has occurred. It can be used to treat various heart diseases such as heart disease, myocardial infarction, and valvular heart disease.
  • the Wnt signaling inhibitor according to the present invention can be applied to the prevention and / or treatment of cancer diseases.
  • IGFBP-4 treatment reduced cell proliferation in vitro in several cancer cell lines, and that overexpression of IGFBP-4 reduced growth in prostate cancer in vivo.
  • IGFBP-4 IGFBP-4's carcinogenesis-inhibiting action has been known to be caused by binding to IGF and inhibiting its cell proliferation action, since IGF is known to cause cell proliferation action.
  • the inhibitory effect of IGFBP-4 on cell proliferation may be mediated in part by inhibition of classical Wnt signaling.
  • the drug according to the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition further containing various commonly used pharmaceutical carriers, if necessary, in addition to the active ingredient.
  • a pharmaceutical carrier for example, one or more pharmaceutically acceptable excipients, disintegrants, diluents, lubricants, flavoring agents, coloring agents, sweetening agents, corrigents, suspending agents, wetting agents Agents, emulsifiers, dispersants, adjuvants, preservatives, buffers, binders, stabilizers, coating agents and the like may be included.
  • the Wnt signal inhibitor according to the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition further containing a known Wnt signal inhibitor in addition to a pharmaceutical carrier.
  • the cardiomyocyte differentiation inducer according to the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition containing a known cardiomyocyte differentiation inducer in addition to a pharmaceutical carrier.
  • the amount of the active ingredient contained in the drug or pharmaceutical composition according to the present invention can be appropriately determined depending on the dose range of the active ingredient, the number of times of medication, and the like. For example, it is about 0.1 ⁇ g or more, preferably 1 ⁇ g or more, more preferably 10 ⁇ g or more, still more preferably 100 ⁇ g or more, and even more preferably 1 mg or more.
  • the dose of the drug or pharmaceutical composition according to the present invention is generally about 1 ng / ml to about 1 mg / ml, preferably about 10 ng / ml to about 100 ⁇ g / ml, more preferably when applied to cultured cells. Is effective at concentrations ranging from about 100 ng / ml to about 10 ⁇ g / ml, more preferably from about 100 ng / ml to about 1 ⁇ g / ml.
  • the dose range is not particularly limited, and the effectiveness of the contained components, the dosage form, the administration route, the type of disease, the nature of the subject (weight, age) And the use of other medical agents, etc.) and the judgment of the doctor in charge, etc.
  • a drug according to the present invention is administered to a subject
  • generally an appropriate dose is, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to about 100 mg, preferably about 0.1 ⁇ g to about 1 mg, per kg of the subject's body weight. preferable.
  • these dose modifications can be made using general routine experimentation for optimization well known in the art.
  • the above dose can be administered once to several times a day.
  • the administration route can be selected from systemic administration or local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like.
  • the drug according to the present invention can be administered by either oral route or parenteral route.
  • parenteral routes include normal intravenous administration and intraarterial administration, as well as subcutaneous, intradermal and intramuscular administration.
  • transmucosal administration or transdermal administration can be performed.
  • the dosage form is not particularly limited, and various dosage forms such as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, spirits, for oral administration, Syrups, extracts, and elixirs can be used.
  • parenteral agents include injections such as subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections; transdermal administration or patches, ointments or lotions; sublingual agents for oral administration Oral aerosol; as well as aerosols for nasal administration; suppositories, but not limited to.
  • These preparations can be produced by known methods usually used in the preparation process.
  • a tablet When preparing an oral solid preparation, after adding an excipient, if necessary, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a corrigent, a flavoring agent and the like to the active ingredient, a tablet by a conventional method, Coated tablets, granules, powders, capsules and the like can be produced.
  • Such additives may be those commonly used in the art.
  • excipients include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid As a binder, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • Disintegrants include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, lactose, etc.
  • lubricants include purified talc, stearate, C sand, polyethylene glycol, sucrose as a flavoring agent, orange peel, citric acid, can be exemplified tartaric acid.
  • an oral solution, a syrup, an elixir, etc. can be produced by adding a flavoring agent, a buffering agent, a stabilizer, a flavoring agent and the like to the active ingredient by a conventional method.
  • the flavoring agent may be those listed above
  • examples of the buffer include sodium citrate
  • examples of the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin.
  • pH adjuster and buffer examples include sodium citrate, sodium acetate, and sodium phosphate.
  • stabilizer examples include sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), thioglycolic acid, and thiolactic acid.
  • local anesthetics examples include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • isotonic agents include sodium chloride and glucose.
  • a formulation carrier known in the art as an active ingredient for example, polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglyceride, etc., if necessary, a surfactant such as Tween registered trademark , etc. Can be produced by a conventional method.
  • bases, stabilizers, wetting agents, preservatives and the like that are usually used as active ingredients are blended as necessary, and mixed and formulated in a conventional manner.
  • the base include liquid paraffin, white petrolatum, white beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin and the like.
  • the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and the like.
  • the ointment, cream, gel, paste or the like may be applied to a normal support by a conventional method.
  • a woven fabric, nonwoven fabric, soft vinyl chloride, polyethylene, polyurethane, or a film or foam sheet made of cotton, suf, or chemical fiber is suitable.
  • the drug according to the present invention may be a sustained or sustained release dosage form.
  • the drug and pharmaceutical composition according to the present invention are used as a gene therapy agent, it is preferably prepared as an injection, a drip infusion, or a liposome preparation.
  • the gene therapy agent is prepared in a form containing cells into which the gene has been introduced, the cell is formulated in phosphate buffered saline (pH 7.4), Ringer's solution, or an injection for intracellular composition. It can also be prepared. Moreover, it can also adjust to the form administered together with the substance which improves gene transfer efficiency, such as a protamine.
  • the pharmaceutical composition can be administered once or divided into several times a day, and can also be intermittently administered at intervals of 1 to several weeks. The administration method can follow the method used in general gene therapy.
  • XIGFBP-4 Materials and methods (plasmids and reagents) CDNA clones of mouse IGFBP and Xenopus IGFBP-4 (hereinafter sometimes abbreviated as XIGFBP-4) were purchased from Open Biosystmes. A mutant (XIGFBP-4-H74P) in which the 74th histidine (His) was replaced by proline (Pro) in XIGFBP-4 was prepared using a QuikChange registered Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene). Such mutants do not bind to IGF.
  • His-tagged human wild-type IGFBP-4 and mutant IGFBP-4-H74P (Qin, X., Strong, DD, Baylink, DJ & Mohan, S., Structure-function analysis of the human insulin-like growth factor binding protein-4., J Biol Chem 273, 23509-16 (1998)) was prepared and purified using the HitTrap HP kit (Amersham).
  • Soluble LRP6 deletion mutants and in situ hybridization analysis probes were prepared by PCR.
  • IGFBP-4, Wnt3A, IGF-I, IGF-II, and BMP2 were purchased from R & D.
  • Neutralizing antibodies were purchased from R & D (anti-IGFBP-4 antibody), Sigma (anti-IGF-I antibody and anti-IGF-II antibody), and Oncogene (anti-type I IGF receptor antibody).
  • the antibodies used for immunoprecipitation, western blotting, and immunostaining were Invitrogen (anti-Myc antibody and anti-V5 antibody), Santa Cruz (anti-troponin T (cTnT) antibody, anti-IGFBP-4 antibody, anti-ITO isomerase I ( TOPO-I) antibody, Sigma (anti- ⁇ -actin antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, and anti-FLAG (M2) antibody), and Developmental-Studies-Hybridoma-Bank (anti-sarcomeric myosin heavy chain antibody (MF20)).
  • Full length Frz8, Frz8 cysteine rich domain (Frz8CRD), and LRP6 extracellular part (LRP6N) are described in the literature (He, X. et al., A member of the Frizzled protein family mediating axis induction by Wnt-5A Science 275, 1652-4 (1997); Tamai, K. et al., LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction., Nature 407, 530-5 (2000)).
  • Full length LRP6, membrane-bound LRP6 deletion mutant, DKK1 (dickkopf-1) is described in the literature (Mao, B.
  • LDL-receptor-related protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins., Nature 411, 321-5 (2001)).
  • the expression vectors for Xenopus Wnt8 (Xwnt8), pXwnt8 and pCSKA-Xwnt8, are described in the literature (Christian, JL, McMahon, JA, McMahon, AP & Moon, RT, a Xenopus Wnt-1 / int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis., Development 111, 1045-55 (1991); Christian, JL & Moon, RT, Interactionsnt-8between and Spemann organizer signaling pathways generate dorsoventral pattern in the embryonic mesoderm of Xenopus., Genes Dev 7, 13-28 (1993)).
  • PCS2- ⁇ -catenin a ⁇ -catenin expression vector
  • ⁇ MHC-GFP an expression vector for green fluorescent protein (GFP) controlled by the ⁇ myosin heavy chain ( ⁇ MHC) promoter
  • the BMP-responsive reporter gene BRE-luc is described in the literature (Korchynskyi, O. & ten Dijke, P., Identification and functional characterization of distinct critically important bone morphogenetic protein-specific response elements in the Id1 promoter. , J Biol Chem 277, 4883-91 (2002)).
  • the pCGN-Dv1-1 a Disheveled-1 (Dvl-1) expression vector, has been described in the literature (Kishida, M. et al., Synergistic activation of the Wnt signaling pathway by Dvl and casein kinase Iepsilon ., J Biol Chem 276, 33147-55 (2001)).
  • P19CL6 cells or ES cells stably transfected with ⁇ MHC-GFP were prepared by transfecting P19CL6 cells or ht7 ES cells with ⁇ MHC-GFP and then selecting with G418.
  • Luciferase reporter gene assay was performed in a manner similar to that described in previous reports (Naito, AT et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt / beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006)).
  • the reporter gene assay was repeated at least 3 times.
  • PCR primers and PCR conditions are listed in Table 1.
  • siRNA construct Knockdown of IGFBP by a short interfering RNA (siRNA) construct was performed by expressing siRNA in cells using a pSIREN-RetroQ vector (Clontech). Specifically, pSIREN-RetroQ vector conjugated with double stranded oligonucleotide was transfected into P19CL6 cells or ES cells and puromycin resistant clones were isolated and propagated.
  • siRNA short interfering RNA
  • Table 2 lists the nucleotide sequences of the oligonucleotides that make up the double-stranded oligonucleotide.
  • ⁇ -catenin stabilization assay was performed using nuclear extract of L cells.
  • a nuclear extract of L cells was prepared using NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction reagent (Pierce). Data are shown as mean ⁇ standard deviation.
  • IP Immunoprecipitation
  • Western analysis and binding assay The IP / Western analysis was performed using 293 cells prepared with conditioned medium containing full-length IGFBP or various deletion mutants thereof, LRP6, Frz8CRD, and DKK1, respectively. The binding reaction was performed overnight at 4 ° C. Immunoprecipitation was performed using Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham). 125 I labeling of IGFBP-4 and Wnt3A was performed using IODO-BEADS ® iodination reagent (Pierce Co.).
  • the liquid phase binding assay was basically performed in the same manner as previously reported (Semenov, MV et al., Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6., Curr Biol 11, 951- 61 (2001)). Briefly, LRP6N with Myc tag (LRP6N-Myc) or Frz8CRD with Myc tag (Frz8CRD-Myc) was mixed with various concentrations of 125 I-labeled IGFBP-4 and overnight at 4 ° C. Incubated. After immunoprecipitation of LRP6N-Myc or Frz8CRD-Myc and extensive washing of Protein G Sepharose beads, the radioactivity of bound IGFBP-4 was measured.
  • conditioned media containing LRP6N-Myc or Frz8CRD-Myc was mixed with 125 I-labeled Wnt3A and unlabeled IGFBP-4 and incubated overnight at 4 ° C. LRP6N-Myc or Frz8CRD-Myc was then immunoprecipitated and the radioactivity of bound Wnt3A was measured.
  • Xenopus experiment and mouse in situ hybridization analysis The Axis duplication assay, animal cap assay, and in situ hybridization analysis in Xenopus were basically performed in the same manner as previously reported (Kobayashi, H. et al., Novel Daple-like). protein positively regulates both the Wnt / beta-catenin pathway and the Wnt / JNK pathway in Xenopus., Mech Dev 122, 1138-53 (2005)).
  • XIGFBP-4 two distinct cDNAs, possibly due to a pseudotetraploid genome, were identified by the 5′RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) method. Two separate MOs were designed that target both of these two IGFBP-4 transcripts (Gene Tools).
  • MO1 targets a sequence consisting of 25 nucleotides from the second nucleotide adjacent upstream of the translation initiation codon to the 23rd nucleotide of the translation region
  • MO2 targets a sequence consisting of 25 nucleotides of the untranslated region.
  • the MO-sensitive XIGFBP-4 cDNA contains a 41 bp 5 ′ untranslated region and was prepared by PCR.
  • MO resistant XIGFBP-4 cDNA wild type and H74P mutant was made by introducing 5 silent mutations into the MO1 target sequence and deleting the 5 ′ untranslated region.
  • MO-sensitive or MO-resistant XIGFBP-4-Myc mRNA was injected into Xenopus embryos with or without MO, and protein and mRNA expression was analyzed. PCR primers and PCR conditions are listed in Table 1 above.
  • MO and plasmid DNA were injected into the dorsal area of two dorsal plant blastomeres destined for the heart and liver primordia at the 8-cell stage.
  • the introduction of mRNA by electroporation was performed essentially in the same manner as previously reported (Sasagawa, S., Takabatake, T., Takabatake, Y., Muramatsu, T. & Takeshima, K.
  • P19CL6 cells 2000 cells / 35 mm petri dishes
  • a culture medium conditioned by various types of cells in the absence of DMSO
  • the cardiogenic activity of each conditioned medium was selected.
  • the degree of cardiomyocyte differentiation was evaluated by immunostaining using a monoclonal antibody that recognizes the sarcomeric myosin heavy chain (MF20, Developmental® Studies® Hybridoma® Bank).
  • MF20 monoclonal antibody that recognizes the sarcomeric myosin heavy chain
  • An increase in the MF20 positive area indicates differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes.
  • cardiac marker ⁇ myosin heavy chain ( ⁇ MHC), Nkx2.5, and GATA-4) gene expression in cultured P19CL6 cells, and cardiac cTnT protein were detected.
  • Detection of cardiac marker gene expression was performed by RT-PCR using primers for each gene. As a control, ⁇ -actin gene expression was detected. The primers and PCR conditions used are shown in Table 1 above.
  • the cTnT protein was detected by Western blotting using an anti-cTnT antibody (Santa Cruz). As a control, actin was detected using an anti- ⁇ -actin antibody (Sigma).
  • culture medium conditioned by mouse bone marrow mesenchymal cell line OP9 induced differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes without treatment with DMSO (FIG. 1-a, left and center panels).
  • the MF20 positive region increased with induction of cardiac marker genes such as ⁇ MHC, Nkx2.5, and GATA-4 and increased cTnT protein levels (FIG. 1-a, right panel).
  • culture media conditioned by COS7 cells, mouse embryonic fibroblasts, NIH3T3 cells, HeLa cells, END2 cells (visceral endoderm-like cells), neonatal rat cardiomyocytes, and neonatal rat cardiac fibroblasts are Differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes in the absence of DMSO was not induced (FIG. 1-a and data not shown).
  • OP9 cells secrete cardiogenic factor.
  • cDNA clones (Ueno, H. et al., A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells isolated from the OP9 cell cDNA library by the signal sequence strap method ., Nat Immunol 4, 457-63 (2003)) were tested for their cardiogenic activity by transient expression. Where possible, the results were also confirmed using recombinant proteins.
  • IGFBP-4 treatment induced differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes by increasing the MF20 positive region and inducing cardiac markers (FIG. 1-b).
  • P19CL6 cells were cultured in OP9 conditioned medium pretreated with anti-IGFBP-4 neutralizing antibody (R & D)
  • anti-IGFBP-4 neutralizing antibody R & D
  • application of anti-IGFBP-4 neutralizing antibody was applied to cardiomyocytes induced by OP9 conditioned medium. Differentiation efficiency was reduced (FIG. 1-c).
  • IGFBP-4 is a cardiogenic factor secreted from OP9 cells.
  • IGFBP-4 induces myocardial development Since IGFBP is considered to be a molecule that binds to IGF and regulates its action, IGFBP-4 enhances the action of IGF and Whether it was due to inhibition was examined.
  • P19CL6 cells were treated with a combination of an anti-IGF-I neutralizing antibody (manufactured by Sigma) and an anti-IGF-II neutralizing antibody (manufactured by Sigma), or a neutralizing antibody against an IGF type I receptor (manufactured by Oncogene). .
  • IGFBP-4 induces cardiomyocyte differentiation by inhibiting IGF signaling.
  • IGFBP-4 cardiac development it was determined that IGFBP-4 induces cardiomyocyte differentiation by enhancing IGF signaling.
  • IGFBP-4-H74P an IGFBP-4 mutant that does not bind to IGF instead of IGFBP-4.
  • IGFBP-4 induces cardiomyocyte differentiation in an IGF-independent manner.
  • Non-Patent Documents 2 and 4 It has been shown that classical Wnt signaling plays a crucial role in cardiomyocyte differentiation.
  • IGFBP-4 regulates classical Wnt signaling was examined.
  • the examination was performed using a reporter gene TOPLFASH (manufactured by Upstate) capable of measuring the transcriptional activity of the ⁇ -catenin-dependent transcription factor Tcf and its negative control FOPLFASH (manufactured by Upstate).
  • TOPLFASH manufactured by Upstate
  • P19CL6 cells were transfected with reporter genes TOPLFASH or FOPLFASH, and LRP6 or Frz8 expression vectors, and treated with Wnt3A and IGFBP-4.
  • TOPLFASH activity was evaluated by measuring luciferase activity.
  • IGFBP-4 inhibits ⁇ -catenin-dependent transcriptional activity by Wnt3A treatment. That is, it was suggested that IGFBP-4 is a specific inhibitor of the classical Wnt pathway.
  • IGFBP-4 inhibits classical Wnt signaling both in vivo and in vitro.
  • Xenopus cap assay and TOPLFASH reporter gene assay were performed.
  • LRP6 mRNA, ⁇ -catenin mRNA, ⁇ -galactosidase mRNA, and IGFBP-4 mRNA were injected into the animal pole of Xenopus two-cell stage embryos in the combination shown in Fig. 5-c, and then from stage 85 embryos
  • the animal cap was excised and cultured until the embryo reached stage 17 in Steinberg solution containing 5 ng / ml activin and 0.1% bovine serum albumin.
  • the expression of Wnt target genes, siamois and Xnr-3 in the obtained embryo was measured.
  • ornithine decarboxylase (ODC) gene was measured.
  • ODC ornithine decarboxylase
  • the TOPLFASH reporter gene assay was performed as described above. First, P19CL6 cells were transfected with LRP6 expression vector, ⁇ -catenin expression vector, or Dvl-1 expression vector and TOPLFASH, and treated with Wnt3A and IGFBP-4. Also, P19CL6 cells transfected with TOPLFASH alone were treated with lithium chloride and IGFBP-4 that activate the Wnt signal.
  • IGFBP-4 inhibited Wnt target gene expression induced by LRP6, but did not inhibit Wnt target gene expression induced by ⁇ -catenin (FIG. 5-c).
  • IGFBP-4 reduced TOPLFASH activity induced by Wnt3A or LRP6 (Fig. 5-d), but activated TOPLFASH activity induced by Wnt signaling factors Dvl-1 and ⁇ -catenin, and Wnt signal. It did not affect the TOPLFASH activity induced by lithium chloride (Figs. 5-d and 5-e).
  • IGFBP-4 inhibits classical Wnt signaling at the cell surface receptor stage.
  • IGFBP-4 competes for Wnt signaling by direct physical interaction with the Wnt receptors LRP5 / 6 or Frizzled.
  • a conditioned medium containing IGFBP4 (IGFBP-4-V5) to which LRP6N-Myc, Frz8CRD-Myc, or V5 tag was added was prepared using 293 cells. Then, a binding reaction between IGFBP-4-V5 and LRP6N-Myc or Frz8CRD-Myc was performed overnight at 4 ° C.
  • Binding analysis was performed by immunoblotting with anti-V5 antibody or anti-Myc antibody after immunoprecipitation with anti-Myc antibody, and immunoblotting with anti-Myc antibody or anti-V5 antibody after immunoprecipitation with anti-V5 antibody. Furthermore, a liquid-phase binding assay (LBR) using 125 I-labeled IGFBP-4 was performed on a conditioned medium containing LRP6N-Myc or Frz8CRD-Myc. A similar liquid phase binding assay was performed using 125 I-labeled Wnt3A to examine the effect of IGFBP-4 on the binding of Wnt3A to LRP6N-Myc or Frz8CRD-Myc.
  • LBR liquid-phase binding assay
  • IGFBP-4 has been demonstrated to inhibit Wnt3A binding to LRP6N ( Figure 2-h) and Frz8CRD ( Figure 2-i), and IGFBP-4 binds Wnt3A to Frz8CDR by the Line Weber Berg plot. (Fig. 6-a).
  • IGFBP-4 interacts with a wide variety of LRP6 domains
  • IGFBP-4 The carboxy-terminal thyroglobulin domain was found to be important for the binding of IGFBP-4 to LRP6 or Frz8CRD (FIGS. 6-c to 6-f).
  • IGFBP-4 can be considered to promote cardiac development by inhibiting classical Wnt signaling.
  • IGFBP-4 was enhanced during the differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes (FIG. 3-a). IGFBP-3 and IGFBP-5 were also enhanced early and late in differentiation, respectively. Expression of IGFBP-2 was not changed and no expression of IGFBP-1 or IGFBP-6 was detected.
  • IGFBP-4 knockdown was performed using two separate siRNA constructs against IGFBP-4. Differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes was induced by addition of DMSO, and differentiation into cardiomyocytes was evaluated by expression of cardiac marker genes ( ⁇ MHC, Nkx2.5, GATA-4) and cTnT protein. Moreover, the effect of knockdown by siRNA of IGFBP-3 and IGFBP-5 was similarly examined.
  • IGFBP-4 siRNAs inhibited the differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes induced by DMSO (Fig. 3-b).
  • IGFBP-3BPsiRNA or IGFBP-5 siRNA did not inhibit DMSO-induced differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes ( Figure 3-b, right panel).
  • IGFBP-4 exhibits a paracrine effect mainly on myocyte differentiation.
  • FGF fibroblast growth factor
  • cTnI cardiac troponin I
  • IGFBP-4 promotes cardiac development by maintaining embryonic cardiomyocyte proliferation and / or survival.
  • IGFBP consists of 6 members, ie IGFBP-1 to IGFBP-6.
  • the inhibitory effect of Wnt signaling by these IGFBP family members was examined by reporter gene assay and ⁇ -catenin stabilization assay.
  • the interaction between each IGFBP family member and LRP6 or Frz8 was examined by IP / Western analysis. Reporter gene assay, ⁇ -catenin stabilization assay, and IP / Western analysis were performed in the same manner as described in Example 1.
  • IGFBP-4 was the strongest of the IGFBP family members and inhibited ⁇ -catenin expression by Wnt3A. IGFBP-1, IGFBP-2, and IGFBP-6 also showed moderate Wnt inhibitory activity, whereas IGFBP-3 and IGFBP-5 were found to show no such activity (FIG. 9). -a to Figure 9-c). Consistent with this result, IP / Western analysis shows that IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, and IGFBP-6 interact with LRP6 or Frz8CRD, whereas IGFBP-3 and IGFBP-5 interact with LRP6 or Frz8CRD. It became clear that it does not interact with (Figs. 9-d and 9-e).
  • Sequence number 1 The gene which codes IGFBP-4 (sequence number 2).
  • Sequence number 3 The gene which codes IGFBP-1 (sequence number 4).
  • Sequence number 5 The gene which codes IGFBP-2 (sequence number 6).
  • Sequence number 7 The gene which codes IGFBP-6 (sequence number 8).
  • SEQ ID NO: 9 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 10 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 11 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 12 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 13 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 14 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 15 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 16 oligonucleotide designed for primer.
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  • SEQ ID NO: 36 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 37 oligonucleotide designed for primer.
  • SEQ ID NO: 38 oligonucleotide designed for siRNA
  • SEQ ID NO: 39 oligonucleotide designed for siRNA
  • 40 oligonucleotide designed for siRNA
  • 41 oligonucleotide designed for siRNA
  • SEQ ID NO: 42 oligonucleotide designed for morpholino
  • SEQ ID NO: 43 oligonucleotide designed for morpholino
  • SEQ ID NO: 44 Partial sequence of Xenopus IGFBP-4 gene.
  • SEQ ID NO: 45 Partial sequence of Xenopus IGFBP-4 mutant gene.
  • SEQ ID NO: 46 Morpholino target sequence in Xenopus IGFBP-4 gene.
  • SEQ ID NO: 47 Morpholino target sequence in Xenopus IGFBP-4 gene.
  • SEQ ID NO: 48 Partial sequence of the morpholino-resistant Xenopus IGFBP-4 gene.

Abstract

【課題】形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する新たな液性因子を提供すること。 【解決手段】インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するWntシグナル伝達阻害剤；前記Wntシグナル伝達阻害剤を含有する、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤、並びに心筋細胞分化誘導剤；前記Wntシグナル伝達阻害剤を用いることを特徴とする、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法、心筋細胞分化誘導方法、並びに該心筋細胞分化誘導方法で得られた心筋細胞およびその使用。

Description

インスリン様増殖因子結合タンパク質を含有するWntシグナル伝達阻害剤
　本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（以下、IGFBPと略称することがある）を含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。また本発明は、IGFBPをコードするポリヌクレオチドを含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。さらに本発明は、IGFBPを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。さらにまた本発明は、IGFBPをコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。また本発明は、IGFBPおよび／またはIGFBPをコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用に関する。さらに本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を含有する、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤に関する。さらにまた本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を投与することを手段とする、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法に関する。また本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用に関する。さらに本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を含有する心筋細胞分化誘導剤に関する。さらにまた本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を心筋細胞に分化し得る細胞と接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。また本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を投与することを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。さらに本発明は、前記心筋細胞分化誘導方法により得られた心筋細胞およびその使用に関する。
　心臓は胚発生期に最初に形成される臓器であり、この過程の異常はヒトの先天的障害の最も一般的な原因である先天的心臓疾患を生じる（非特許文献1および2）。心臓発生をもたらす分子は、心臓再生へのその潜在的用途ゆえに特別な注目の的である（非特許文献3および4）。
　従前の研究において、Wnt、Wnt阻害剤、骨形成タンパク質（bone morphogenetic protein；以下、BMPと略称する）、および線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor；以下、FGFと略称する）等の液性因子が、心筋細胞（cardiomyocyte）の特異化に決定的に重要な組織間相互作用を媒介することが示されている（非特許文献2および4）。
　Wntは、形態形成を制御するタンパク質であり、発生、幹細胞分化制御および細胞癌化等の様々な現象に関わることが知られている。また、Wntが、幹細胞の増殖調節および生存に重要な因子であることが報告されている（非特許文献5および6）。
　Wntは、細胞膜受容体に結合し、そして少なくとも3種類の経路を介して細胞内シグナルを伝達することにより、その作用を発現していることが知られている。Wntが結合する細胞膜受容体には、7回膜貫通型受容体であるフリズルド（Frizzled、Frzと略称することがある）と1回膜貫通型受容体である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5および6（それぞれLRP5およびLRP6と略称することがある）が知られている（非特許文献7および8）。Wntにより制御されるシグナル伝達経路には、β－カテニン経路、PCP（planar cell polarity、平面内細胞極性）経路、およびカルシウムイオン（Ca2+）経路の少なくとも3種類存在すると考えられる。β－カテニン経路は古くから知られており、古典的（canonical）経路とも呼ばれる。本経路は、核へのWntシグナルの伝達に重要な役割を果たす細胞質β－カテニンの安定化を特徴とし、その異常な活性化は発がんに関連すると考えられている。一方、PCP経路およびCa2+経路は、非古典的（non-canonical）経路と呼ばれる。PCP経路は、低分子量Gタンパク質であるRhoやMAPキナーゼファミリーに属するJunキナーゼの活性化を特徴とする。また、Ca2+経路は、細胞内カルシウム濃度の上昇による下流のタンパク質リン酸化酵素であるプロテインキナーゼC（PKC）やカルモデュリンキナーゼの活性化を特徴とする。
　IGFBPは、インスリン様増殖因子（以下、IGFと略称する）に結合してその作用を調節するタンパク質である。IGFには2つの分子種の存在が明らかにされており、それぞれIGF-IおよびIGF-IIと呼ばれている。IGF-IおよびIGF-IIは構造的にインスリンと高度に類似しており、細胞表面上に存在するそれぞれの受容体であるI型IGF受容体およびII型IGF受容体に結合して様々な細胞の増殖や分化に重要な役割を果たす。
　IGFBPは、IGFBP-1～IGFBP-6と呼ばれる6つの分子種の存在が明らかにされており、様々な組織に広汎に発現している。IGFBP-1～IGFBP-6はいずれもIGFに結合することによりIGFとその受容体との相互作用を調節し、その結果IGFの作用を制御している。
　一方、IGFBPのいくつかの作用はIGFに依存していないという報告がある。しかし、IGF非依存性のIGFBP作用の詳細なメカニズムはほとんど知られていない（非特許文献9および10）。
Srivastava, D., Genetic assembly of the heart: implications for congenital heart disease., Annu Rev Physiol 63, 451-69 (2001). Olson, E.N. & Schneider, M.D. ,Sizing up the heart: development redux in disease., Genes Dev 17, 1937-56(2003). Leri, A., Kajstura, J. &Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration., Physiol Rev 85, 1373-416 (2005). Foley, A. & Mercola, M., Heart induction: embryology to cardiomyocyte regeneration., Trends Cardiovasc Med 14, 121-5 (2004). Willert K., Brown J.D., Danenberg E., Duncan A.W., Weissman I.L., Reya T., Yates JR 3rd, Nusse R., Nature 423, 448-52 (2003). Reya T., Duncan A.W., Ailles L., Domen J., Scherer D.C., Willert K., Hintz L., Nusse R., Weissman I.L., Nature 423, 409-14 (2003). Moon, R. T., Kohn, A.D., DeFerrari, G. V. & Kaykas, A., WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies., Nat Rev Genet 5, 691-701 (2004). Kikuchi, A., Yamamoto, H. & Kishida, S., Multiplicity of the interactions of Wnt proteins and their receptors., Cell Signal 19, 659-71 (2007). Firth, S.M. & Baxter, R.C., Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins., Endocr Rev 23, 824-54 (2002). Mohan, S. & Baylink, D.J., IGF-binding proteins are multifunctional and act via IGF-dependent and-independent mechanisms., J Endocrinol 175, 19-31 (2002).
　本発明の目的は、形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する新たな液性因子を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく、心筋細胞に分化する細胞株P19CL6細胞を用いて鋭意研究を行った。そして、（1）IGFBP-4がP19CL6細胞の心筋細胞への分化をインビトロで誘導すること、（2）IGFBP-4のノックダウンによりインビトロおよびインビボのいずれにおいても心筋発生（cardiomyogenesis）が低減すること、（3）IGFBP-4のこれら作用がそのIGF結合活性とは無関係であること、（4）IGFBP-4がWnt受容体であるFrizzled 8（以下、Frz8と略称する）およびLRP5／6と物理的に相互作用してWnt3AのFrz8およびLRP6への結合を阻害することを見出し、これら結果からIGFBP-4がWntシグナル伝達を阻害すること、およびWntシグナル伝達の阻害により心筋細胞分化が誘導されることを明らかにした。さらに本発明者らは、IGFBP-4の他に、IGFBP-1、IGFBP-2、およびIGFBP-6も、Frz8およびLRP6と結合し、Wntシグナル伝達を阻害することを見出した。本発明はこれら知見に基づいて達成したものである。
　即ち、本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類を含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。
　また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、下記タンパク質群より選ばれるタンパク質の少なくとも1種類であり、その少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する：
（1）配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
（2）前記（1）のタンパク質と70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
（3）前記（1）のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。
　さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。
　さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。
　また本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤に関する。
　さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類を含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。
　さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、下記ポリヌクレオチド群より選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも1種類であり、その少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する：
（1）配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
（2）前記（1）のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（3）前記（1）のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（4）前記（1）から（3）のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
　また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。
　さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。
　さらにまた本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤に関する。
　また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。
　さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、下記タンパク質群より選ばれるタンパク質の少なくとも1種類である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する：
（1）配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
（2）前記（1）のタンパク質と70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
（3）前記（1）のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。
　さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。
　また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。
　さらに本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害方法に関する。
　さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。
　また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、下記ポリヌクレオチド群より選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも1種類である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する：
（1）配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
（2）前記（1）のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（3）前記（1）のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（4）前記（1）から（3）のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
　さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。
　さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。
　また本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled 8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害方法に関する。
　さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用に関する。
　さらにまた本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤に関する。
　また本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の有効量を対象に投与することを手段とするWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法に関する。
　さらに本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用に関する。
　さらにまた本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有する心筋細胞分化誘導剤に関する。
　また本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の有効量を心筋細胞に分化し得る細胞と接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。
　さらに本発明は、心筋細胞に分化し得る細胞が多能性幹細胞である前記心筋細胞分化誘導方法に関する。
　さらにまた本発明は、心筋細胞に分化し得る細胞が胚性幹細胞である前記心筋細胞分化誘導方法に関する。
　また本発明は、前記いずれかの心筋細胞誘導方法により得られた心筋細胞に関する。
　さらに本発明は、前記いずれかの心筋細胞誘導方法により得られた心筋細胞の使用に関する。
　さらにまた本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の有効量を対象に投与することを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。
　本発明によれば、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するWntシグナル伝達阻害剤を提供できる。
　Wntシグナルは、形態形成の制御に関与し、発生、幹細胞の分化制御、増殖調節および生存、並びに細胞癌化等の様々な現象に重要である。従って、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する薬剤として医薬品開発分野や科学研究分野等において有用である。
　本発明によればさらに、前記タンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤、並びに心筋細胞分化誘導剤を提供できる。また本発明は、Wntシグナル伝達阻害剤、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤、並びに心筋細胞分化誘導剤の製造における、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供できる。さらに本発明は、Wntシグナル伝達阻害、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療、並びに心筋細胞分化誘導における、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供できる。本発明によればまた、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法、心筋細胞分化誘導方法、並びに該心筋細胞分化誘導方法により得られた心筋細胞およびその使用を提供できる。
OP9細胞により馴化された培養培地によりP19CL6細胞の心筋細胞への分化が誘導されたが、COS7細胞で馴化した培養培地では誘導されなかったことを示す図である。心筋細胞への分化は、細胞形態（左側2枚のパネル）、MF20陽性領域の誘導（中央パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αミオシン重鎖（αMHC）、Nkx2.5、GATA-4）および心臓トロポニン（cTnT）タンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。目盛り線＝100μm。 IGFBP-4（1μg/ml）での処理により、ジメチルスルホキシド（以下、DMSOと略称する）非存在下でP19CL6細胞の心筋細胞への分化が誘導されたことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4、コントロールはCと表示する。 IGFBP-4に対する中和抗体（40μg/ml）での処理により、OP9馴化培地により誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化が低減したことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4に対する中和抗体はαBP4と表示する。 IGF-Iに対する中和抗体およびIGF-IIに対する中和抗体の組み合わせ（各5μg/ml）による処理は、IGFBP-4により誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化になんら効果を示さなかったことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（上パネル）、およびcTnTタンパク質の発現の誘導（中パネル）により評価した。図中、中和抗体の組み合わせ（上記の組み合わせをαIGFs、コントロールをCと表示する。 IGFに結合できない変異体IGFBP-4（IGFBP-4-H74P）が心筋発生活性を維持していることを示す図である。心筋発生活性は、P19CL6細胞の心筋細胞への分化で評価した。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（上パネル）、およびcTnTタンパク質の発現の誘導（中パネル）により評価した。図中、IGFBP-4-H74PはBP4（H74P）、コントロールはCと表示する。 IGF-Iおよび-IIの組み合わせ（各100ng/ml）は野生型IGFBP-4により誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を低減するが（左パネル）、変異体IGFBP-4-H74Pにより誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化は低減しない（右パネル）ことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（上パネル）、およびcTnTタンパク質の発現の誘導（中パネル）により評価した。図中、IGF-Iおよび-IIの組み合わせはIGFs、IGFBP-4はBP4、IGFBP-4-H74PはBP4（H74P）、コントロールはCと表示する。 IGFBP-4がP19CL6細胞においてWnt／β－カテニンシグナル伝達を低減したことを示す図である。P19CL6細胞にTOPFLASHレポーター遺伝子およびLRP6またはFrz8の発現ベクターをトランスフェクションし、Wnt3AとIGFBP-4で処理すると、Wnt3Aのみで処理したときと比較して、TOPFLASH活性が低下した。TOPFLASH活性はルシフェラーゼ活性の測定により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。 アフリカツメガエルIGFBP-4（以下、XIGFBP-4と略称することがある）が、アフリカツメガエル胚においてアフリカツメガエルWnt8（以下、Xwnt8と略称する）により誘導される二次体軸形成を阻害したことを示す図である（各群N＝20）。図中、XIGFBP-4はXBP4と表示する。 XIGFBP-4が、アフリカツメガエル胚においてLRP6により誘導される二次体軸形成を阻害したことを示す図である（各群N＝30）。図中、XIGFBP-4はXBP4と表示する。 IGFBP-4がLRP6Nと直接的に相互作用したことを示す図である。相互作用は、LRP6N-MycとIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。 IGFBP-4がFrz8システインリッチドメイン（以下、Frz8CRDと略称する）と直接的に相互作用したことを示す図である。相互作用は、Frz8CRD-MycとIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。 125I標識IGFBP-4とLRP6Nとの結合アッセイの結果を示す図である。挿入図はスカッチャードプロットであり、異なった結合親和性（Kd）をもつ2箇所の結合部位が存在することを示す。 125I標識IGFBP-4とFrz8CRDとの結合アッセイの結果を示す図である。挿入図はスカッチャードプロットであり、結合親和性（Kd）が25nMである1箇所の結合部位が存在することを示す。 IGFBP-4が、125I標識Wnt3AのLRP6Nとの結合を用量依存的に阻害したことを示す図である。 IGFBP-4が、125I標識Wnt3AのFrz8CRDとの結合を用量依存的に阻害したことを示す図である。 DMSOによるP19CL6細胞の心筋細胞への分化誘導中の、IGFBPファミリーメンバー発現の変化を示す図である。IGFBP発現は、DMSO添加後、第0日（D0）、第2日（D2）、第4日（D4）、第6日（D6）および第8日（D8）に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により測定した。 P19CL6細胞におけるIGFBP-4のノックダウンにより、該細胞のDMSO処理に対する応答における心臓マーカー（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）発現（左パネル）およびcTnT発現（右パネル）が低減したことを示す図である。IGFBP-4のノックダウンは、2種類のIGFBP-4 siRNA（図中BP4-1およびBP4-2と表示する）を用いて行った。一方、IGFBP-3 siRNA（図中BP3と表示する）およびIGFBP-5 siRNA（図中BP5と表示する）によるIGFBP-3およびIGFBP-5のノックダウンはいずれもDMSO処理に対する応答におけるcTnT発現になんら影響しなかった（右パネル）。 IGFBP-4に対する中和抗体（40μg/ml）での処理により、DMSOにより誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化が低減したことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4に対する中和抗体はαBP4と表示する。 αMHC－緑色蛍光タンパク質（αMHC-GFP）レポーター遺伝子を安定トランスフェクションしたP19CL6細胞をDMSOにより分化誘導し、IGFBP-4を免疫染色した結果を示す図である。左上パネルはIGFBP-4染色、右上パネルは分化した心筋細胞を表すGFP発現、左下パネルはDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色、および右下パネルは重ね合わせた像を示す。目盛り線＝100μm。 IGFBP-4ノックダウンにより低減されたP19CL6細胞の心筋細胞への分化が、Wnt／β－カテニンシグナル伝達の阻害により回復したことを示す図である。コントロールP19CL6細胞およびIGFBP-4をノックダウンしたP19CL6細胞をGFPまたはLRP6細胞外部分（LRP6N）の発現ベクターで処理し、そしてDMSO処理により心筋細胞への分化を誘導した。LRP6Nは野生型LRP6に対してドミナントネガティブ作用を有し、その過剰発現はIGFBP-4ノックダウンにより低減された心筋細胞への分化を回復した。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域（左パネル）、並び心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現（右パネル）により評価した。 アフリカツメガエル胚において、初期心臓マーカーであるNkx2.5、成熟心臓マーカーである心臓トロポニンI（cTnI）、肝臓マーカーであるHex、およびXIGFBP-4 mRNAの発現を、段階34、38および42にin situハイブリダイゼーション解析した結果を示す図である。図中、XIGFBP-4 mRNAはXBP4と表示する。 XIGFBP-4を2つの別個のモルフォリノ（MO1またはMO2）によりノックダウンした結果、重大な心臓欠陥が生じたこと（左パネル）、および心臓欠陥がMO抵抗性野生型XIGFBP-4、変異体XIGFBP-4-H74P、またはLRP6細胞外部分（LRP6N）の共注入により回復したこと（中央パネルおよび右パネル）を示す図である。心臓の評価は段階42におけるcTnIのin situハイブリダイゼーションにより行った（各群N＝30）。図中、野生型XIGFBP-4はBP4、およびXIGFBP-4-H74PはBP4（H74P）と表示する。また、no inj.はモルフォリノによるノックダウンを行わなかったことを示す。中央パネルおよび右パネルにおいて、白カラム、斜線カラム、交差線カラム、点描カラムおよび黒カラムは、それぞれ正常心臓、異常心臓、小型心臓、無心臓および死亡例を示す。 XIGFBP-4のモルフォリノ（MO1またはMO2）によるノックダウンにより誘導される心臓欠陥の時間的特徴を示す図である。心臓の形態は、cTnIのin situハイブリダイゼーションにより評価したところ、段階34ではほとんど正常であったが、段階38および42では重大な乱れが生じた。図中、no inj.はモルフォリノによるノックダウンを行わなかったことを示す。右カラムはコントロールおよびMOを注入した胚の切片を示す。矢印はコントロール胚における心臓を指し示す。MOを注入した胚では、心臓様構造はなんら認められなかった。 IGFBP-4はTOPFLASHのネガティブコントロールであるFOPFLASH活性を変化させなかったことを示す図である。 IGFBP-4はBRE-lucレポーター遺伝子のBMPによる活性化を変化させなかったことを示す図である。BMP応答性BRE-lucは、BMP2により濃度依存性に活性化され（左パネル）、そしてこの活性化はIGFBP-4によって変化しなかった（右パネル）。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。レポーター遺伝子アッセイは293細胞中で実施した。 IGFBP-4による古典的Wnt経路の阻害をアニマルキャップアッセイにより検討した結果を示す図である。本アッセイは、LRP6、β－カテニン、β－ガラクトシダーゼ、またはXIGFBP-4のRNAをそれぞれ2細胞胚の動物極に注入し、段階85にアニマルキャップを切り出し、Wnt標的遺伝子（SiamoisおよびXnr-3）の発現を測定することにより実施した。XIGFBP-4は、LRP6により誘導されるSiamoisおよびXnr-3の発現を低減したが、β－カテニンにより誘導される該発現には影響しなかった。ODCはオルニチン脱炭酸酵素を表し、そしてこれはコントロールとして測定した。 IGFBP-4が、Wnt3AまたはLRP6により活性化される古典的Wntシグナル伝達を阻害したことを示す図である（それぞれ左パネルおよび右パネル）。古典的Wntシグナル伝達の活性化は、TOPFLASHレポーター遺伝子アッセイにより測定し、TOPFLASH活性で評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。TOPFLASHレポーター遺伝子アッセイは293細胞中で実施した。 IGFBP-4は、β－カテニン、Dishevelled-1（左パネル）、またはGSK3（glycogen synthase kinase 3）阻害剤である塩化リチウム（右パネル）により誘導される古典的Wntシグナル伝達を阻害しなかったことを示す図である。図中、IGFBP-4はBP4、Dishevelled-1はDiv-1と表示する。TOPFLASHレポーター遺伝子アッセイは293細胞中で実施した。 様々な濃度のIGFBP-4の存在下または非存在下における125I標識Wnt3AおよびFrz8CRD間の結合アッセイの結果を示す図である。図中、長方形の記号はIGFBP-4なし、円形の記号はIGFBP-4　50nM、および三角形の記号はIGFBP-4　100nMを示す。挿入図はラインウェーバー・バーグ　プロットであり、IGFBP-4がWnt3AのFrz8CRDへの結合の拮抗阻害剤であることを示す。 実施例1で用いたLRP6欠失変異体（LRP6 deletion mutants）の模式図である。欠失変異体はすべて可溶型である。図中、SPはシグナルペプチド、β－proはβ－プロペラドメイン、EGFはEGF様ドメイン、LDLRはLDL受容体タイプAリピート、TMは膜貫通ドメインを意味する。 IGFBP-4がLRP6NおよびLRP6のE1-4変異体と相互作用したことを示す図である。相互作用は、LRP6N-MycまたはLRP6変異体とIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。 IGFBP-4がLRP6のＬ変異体、E1-2/L変異体、およびE3-4/L変異体と相互作用したことを示す図である。相互作用は、Mycタグを付加した各LRP6変異体とIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。 IGFBP-4がLRP6のE1-2変異体およびE3-4変異体と相互作用したことを示す図である。一方、コントロールとして用いたDkk1はLRP6E3-4変異体と主に相互作用した。IGFBP-4とLRP6変異体との相互作用は、Mycタグを付加した各LRP6変異体とIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの左側3レーン）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの右側3レーン）により評価した。また、Dkk1とLRP6変異体との相互作用は、Mycタグを付加した各LRP6変異体とFLAGタグを付加したDkk1とを反応させ、抗FLAG抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの左側3レーン）、並びに、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの右側3レーン）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。また、NSは非特異的結合を意味する。 IGFBP-4のアミノ末端欠失変異体は、LRP6およびFrz8と相互作用したが、カルボキシ末端サイログロブリンドメイン欠失変異体は、これらと相互作用しなかったことを示す図である。V5タグを付加した全長IGFBP-4、アミノ末端欠失IGFBP-4およびカルボキシ末端欠失IGFBP-4と、Mycタグを付加したLRP6またはFrz8とを反応させ、抗Myc抗体によるによる免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）、または、抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）により、各IGFBP-4とFrz8またはLRP6との相互作を評価した（中パネル）。全長IGFBP-4およびIGFBP-4欠失変異体の模式図を左パネルに示す。図中、全長IGFBP-4はFLまたはBP4FL、アミノ末端欠失IGFBP-4はΔNまたはBP4ΔN、カルボキシ末端欠失IGFBP-4はΔCまたはBP4ΔCと表示する。また、IGFとはIGF結合ドメインを、TGとはサイログロブリンドメインを意味する。 ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を検討した結果を示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された。ES細胞の心筋細胞への分化の程度はGFP陽性領域の顕微鏡下による観察により評価した。目盛り線＝200μm。 ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を検討した結果を示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された。ES細胞の心筋細胞への分化の程度はGFP陽性領域の割合により評価した。 ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を検討した結果を示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された。ES細胞の心筋細胞への分化の程度は心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現（右パネル）により評価した。 ES細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBPファミリーメンバーの発現を示す図である。IGFBP発現は、分化誘導の第0日（D0）、第3日（D3）、第4日（D4）、および第5日（D5）にRT-PCRにより測定した。 ES細胞におけるIGFBP-4のノックダウンにより、該細胞の心筋細胞への分化が低減されたことを示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、さらに2種類のIGFBP-4 siRNA（図中BP4-1およびBP4-2と表示する）を用いてIGFBP-4をノックダウンし、そして心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。心筋細胞への分化は、心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）発現（左パネル）並びにGFP陽性領域およびcTnT発現（右パネル）により評価した。一方、IGFBP-3 siRNA（図中BP3と表示する）およびIGFBP-5 siRNA（図中BP5と表示する）によるIGFBP-3およびIGFBP-5のノックダウンはいずれもGFP陽性領域の割合およびcTnT発現になんの効果も示さなかった（右パネル）。 IGFBP-4に対する中和抗体（40μg/ml）での処理により、ES細胞の心筋細胞への分化が低減したことを示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、そして心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。心筋細胞への分化は、GFP陽性領域の割合（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTの発現（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4に対する中和抗体はαBP4と表示する。 αMHC-GFPレポーター遺伝子を安定トランスフェクションしたES細胞を心筋細胞へ分化誘導し、IGFBP-4を免疫染色した結果を示す図である。左上パネルはIGFBP-4染色、右上パネルは分化した心筋細胞を表すGFP発現、左下パネルはDAPIによる核染色、および右下パネルは重ね合わせた像を示す。目盛り線＝100μm。 マウス胚（E95）におけるIGFBP-4のin situハイブリダイゼーション解析において、咽頭弓、肝芽および肢芽で強いシグナルが検出されたことを示す図である。SおよびASはそれぞれセンスプローブおよびアンチセンスプローブを用いたin situハイブリダイゼーション解析の結果を示す。 XIGFBP-4の2つの対立遺伝子の部分配列、XIGFBP-4に対するMO1およびMO2の標的配列並びにその位置、MO感受性（MO-s）XIGFBP-4 cDNAの部分配列、並びにMO抵抗性（MO-r）XIGFBP-4 cDNAの部分配列示す図である。開始コドンATG、およびMO抵抗性XIGFBP-4 cDNAを作成するために導入したミスマッチを下線で示した。 XIGFBP-4に対するMO1およびMO2の活性および特異性を検証した結果を示す図である。MO感受性（MO-s）およびMO抵抗性（MO-r）のXIGFBP-4-Myc mRNAをアフリカツメガエル胚に注入した。MO感受性mRNAから翻訳されたXIGFBP-4-Mycタンパク質の発現はMO1またはMO2の共注入により低減されたが、一方、MO抵抗性mRNAからのタンパク質発現は影響を受けなかった。RT-PCR分析により、注入されたmRNA（injected mRNA）が同等量であることが示された。ODCはオルニチン脱炭酸酵素を表し、そしてこれはRT-PCRコントロールとして測定した。 XIGFBP-4に対するMO1およびMO2により誘導される心臓表現型の特異性を説明する図である。XIGFBP-4 MO1またはMO2により心臓欠陥が生じた。一方、XIGFBP-4 MO1またはMO2により誘導される心臓欠陥はMO抵抗性XIGFBP-4 cDNAの共注入により回復した（各群N＝30）。図中、白カラム、斜線カラム、交差線カラム、点描カラムおよび黒カラムは、それぞれ正常心臓、異常心臓、小型心臓、無心臓および死亡例を示す。 Wnt経路の活性化により正常な心臓発達が損なわれたことを示す図である。Xwnt8をコードし細胞骨格アクチンプロモータの制御下にあるプラスミドDNA（pCSKA-Xwnt8）を、アフリカツメガエル胚の8細胞段階において、心臓および肝臓原基へと運命付けられた2つの背側植物割球の背側領域に注入することにより、心臓形成領域におけるWntを活性化した。pCSKA-Xwnt8を注入した胚（下パネル）は、段階42においてコントロール胚（上パネル）と比較して、心臓の大きさが低減していた。 Wnt経路の活性化により胚発生後期における心臓発生が異常をきたしたことを示す図である。Xwnt8のmRNAを、段階28のアフリカツメガエルの心臓原基近辺へ電気穿孔法により導入した。このとき、GFP mRNAを共注入し、電気穿孔法の効率を評価した。段階34において、GFP発現が心臓形成部分で観察された（上パネル、頭部は左であり背側は上方である）。GFP mRNAのみを注入したコントロール胚（中間パネル）と比較して、Xwnt8およびGFPのmRNAを注入した胚で、段階42において心臓形態形成の異常が観察された（下パネル）。 心臓発達へのWnt活性化の効果を定量分析した結果を示す図である。Xwnt8をコードし細胞骨格アクチンプロモータの制御下にあるプラスミドDNA（pCSKA-Xwnt8）を注入したアフリカツメガエル胚では、そのほとんどの心臓がコントロール胚の正常サイズ（normal size）の心臓と比較して小型（small size）であった。また、Xwnt8を電気穿孔法により導入したアフリカツメガエル胚でも同様に、小型の心臓である割合が高かった。 L細胞をWnt3A処理することにより増加した核内β－カテニン量が、IGFBP-4処理により低下したことを示す図である。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。TOPO-Iは核内タンパク質の発現コントロールであり、Wnt3AやIGFBP-4による処理で影響を受けなかった。 L細胞をWnt3A処理することにより増加した核内β－カテニン量が、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6により低下したが、IGFBP-3およびIGFBP-5によっては低下しなかったことを示す図である。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。 TOPFLASHレポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞において、Wnt3A処理により増加したTOPFLASH活性が、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6により低下したが、IGFBP-3およびIGFBP-5によっては低下しなかったことを示す図である。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。 IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6がいずれもLRP6と相互作用したが、IGFBP-3および-5は相互作用しなかったことを示す図である。相互作用は、LRP6N-MycとV5タグを付加した各IGFBPとを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（上パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（下パネル）により評価した。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。 IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6がいずれもFrz8と相互作用したが、IGFBP-3および-5は相互作用しなかったことを示す図である。相互作用は、Frz8-MycとV5タグを付加した各IGFBPとを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（上パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（下パネル）により評価した。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。
　本発明は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質の1種類を含有するものであってよく、また、該タンパク質の2種類以上を含有するものであってよい。
　「Wntシグナル伝達」とは、分泌糖タンパク質リガンドのファミリーに属するWntがその細胞膜受容体に結合することより細胞内に生じるシグナル伝達をいう。Wntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達および非古典的Wntシグナル伝達に大別される。古典的Wntシグナル伝達とは、β－カテニン依存性に機能するWntシグナル伝達をいう。すなわち、Wntタンパク質がその細胞表面受容体であるFrizzledファミリーに結合してディシェブルドファミリータンパク質を活性化し、その結果β－カテニンの核移行を誘導して転写因子Tcfを活性化してWnt応答性遺伝子の転写を促進するシグナル伝達をいう。非古典的Wntシグナル伝達には、PCP経路およびCa2+経路と呼ばれる2種類の経路が知られている。PCP経路は、低分子量Gタンパク質であるRhoやMAPキナーゼファミリーに属するJunキナーゼの活性化を特徴とする。また、Ca2+経路は、細胞内カルシウム濃度の上昇による下流のタンパク質リン酸化酵素であるPKCやカルモデュリンキナーゼの活性化を特徴とする。本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、好ましくは古典的Wntシグナル伝達阻害剤である。
　IGFBPは、Wnt受容体と結合して、WntとWnt受容体との結合を阻害することにより、Wntシグナル伝達を阻害する。IGFBPが結合するWnt受容体として、好ましくはFrizzledおよびLRP、より好ましくはFrz8、LRP6、およびLRP5を例示できる。「Wnt受容体と結合する」とは、Wnt受容体タンパク質と複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。Wnt受容体とタンパク質の結合は、Wnt受容体と該タンパク質とがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。「WntとWnt受容体との結合を阻害する」とは、WntとWnt受容体との結合を低減させること、または該結合を妨げることをいう。「Wntシグナル伝達を阻害する」とは、Wntシグナルの発生を阻害すること、および／またはWntシグナル伝達を低減させることをいう。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPは、Wnt受容体と結合し得るIGFBPであれば特に制限はない。好ましくはWnt受容体と結合してWntシグナル伝達を阻害するIGFBPが適当である。Wnt受容体と結合し得るIGFBPとして、好ましくはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6を例示できる。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6はいずれも、Wnt3Aにより惹起されるWntシグナル伝達を阻害した（実施例2参照）。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6のうち、IGFBP-4がWnt受容体との結合活性およびWntシグナル伝達阻害作用が最も高い。したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPとして、より好ましくはIGFBP-4を例示できる。IGFBPは、いずれの種由来のものであってもよく、好ましくは本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤が適用される対象および該対象由来の組織や細胞と同一の種由来であることが適当である。例えば、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤を、ヒトおよびヒト由来の組織や細胞に適用するときには、本阻害剤に含有されるIGFBPはヒト由来であることが好ましい。
　IGFBP-4として、好ましくは配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
　IGFBP-1として、好ましくは配列番号4に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
　IGFBP-2として、好ましくは配列番号6に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
　IGFBP-6として、好ましくは配列番号8に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPの範囲には、配列番号2、配列番号4、配列番号6、および配列番号8から選ばれるいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質と配列相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質が含まれる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で約50％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、さらにより好ましくは約95％以上である。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPの範囲には、また、配列番号2、配列番号4、配列番号6、および配列番号8から選ばれるいずれか1に記載のアミノ酸配列において1個以上、例えば1～100個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～5個、さらにより好ましくは1～3個、特に好ましくは1個または2個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であって、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質が含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するタンパク質が、Wnt受容体と結合し得るタンパク質であり、さらに好ましくはWntシグナル伝達を阻害するタンパク質である限り特に制限されない。かかる変異を有するタンパク質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたタンパク質であってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たタンパク質であってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等を単独でまたは適宜組み合せて用いることができる。例えば成書に記載の方法（例えば、Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（Ulmer K.M., Science, 219, 666-671 (1983)）を利用することもできる。変異の導入において、当該タンパク質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
　Wnt受容体と結合し得るIGFBPの選択は、例えばWnt受容体であるFrz8やLRP6を用いて、IGFBPとの結合反応を行うことにより実施できる。Frz8やLRP6の代わりに、それらのWntとの結合ドメインFrz8システインリッチドメイン（Frz8CRD）やLPR6細胞外部分（LRP6N）等を使用して結合反応を行うこともできる（実施例1参照）。結合反応は、慣用のタンパク質結合アッセイにより実施できる。
　IGFBPはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変が可能である。また、アミノ末端側やカルボキシ末端側に別のタンパク質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したタンパク質であってもよい。好ましくは、IGFBPの基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加するタンパク質等としては、例えばグルタチオン　S－トランスフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等の酵素類、His-tag、Myc-tag、HA-tag、FLAG-tagまたはXpress-tag等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）またはフィコエリスリン（phycoerythrin）等の蛍光物質類、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンのFc断片あるいはビオチン等が挙げられるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することも可能である。これら標識化されたIGFBPを含むWntシグナル阻害剤は、Wntシグナル伝達経路および該経路が関わる生理学的事象や疾患の解明に有効に利用できる。
　IGFBPは、市販されているものを入手して利用することができる。あるいは、一般的な化学合成法によりIGFBPを製造することができる。タンパク質の化学合成方法としては、例えば、固相合成方法、液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。かかるタンパク質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、IGFBPの合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記タンパク質合成法において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA（ジフェニルホスホリルアジド）法、DCC＋添加物（1－ヒドロキシベンゾトリアゾール、N－ヒドロキシサクシンアミド、N－ヒドロキシ－5－ノルボルネン－2，3－ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。化学合成により得られるIGFBPは、さらに慣用の各種精製方法に従って、適宜精製を行うことができる。分離および／または精製は、IGFBPの機能、例えばIGFやWnt受容体との結合活性を指標にして実施できる。分離操作方法としては、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組み合せて用いることができる。好ましくは、IGFBPに対する特異的抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。
　IGFBPは、また、IGFBPをコードする遺伝子の配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory; Ulmer K.M., Science, 219, 666-671 (1983); Ehrlich H.A., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (1989) Stockton Press, New York等）により製造できる。具体的には、IGFBPをコードする遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該遺伝子に特有の適当なプライマーを用いて該遺伝子を増幅し、得られた遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により発現誘導することにより取得することができる。IGFBP-4をコードする遺伝子の発現は、肝臓で高いレベルで認められ、その他、卵巣、甲状腺や、平滑筋細胞等に認められる。IGFBP-1をコードする遺伝子の発現は、肝臓で認められている。IGFBP-2をコードする遺伝子の発現は、前立腺、肝臓、心臓、膵臓等に認められる。IGFBP-6をコードする遺伝子の発現は、平滑筋、前立腺、甲状腺、心筋細胞等に認められる。IGFBPの遺伝子工学的手法による製造は、具体的には例えば、まずIGFBPをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、それにより得られた組み換えベクターを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、その後、該形質転換体を培養して培養物を得ることにより実施できる。発現ベクターや宿主細胞は、タンパク質の発現に一般的に用いられているものから適宜選択することができる。形質転換体の培養条件や培養方法は、選択した宿主に最適な自体公知の条件および方法で行うことができる。IGFBPは得られた培養物から適宜回収することができる。IGFBPは分泌タンパク質であるため、形質転換体中のみならず培養液中にも産生される。したがって、IGFBPは、培養後の形質転換体を破砕したものや培養液から、上記慣用の各種精製方法で回収できる。
　本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの1種類を含有するものであってよく、また、該ポリヌクレオチドの2種類以上を含有するものであってよい。
　IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な細胞内に導入することにより、IGFBPを該細胞に発現させることができる。IGFBPは分泌タンパク質であるため、細胞外に分泌される。したがって、上記ポリヌクレオチドを含有する薬剤は、細胞内に導入することによりIGFBPの発現を介してWntシグナル伝達阻害剤として作用する。ポリヌクレオチドの細胞内への導入は、該ポリヌクレオチドを挿入した適当な発現ベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するWntシグナル伝達阻害剤の範囲には、該ポリヌクレオチドが挿入された発現ベクター（以下、IGFBP発現ベクターと称することがある）を含有するWntシグナル伝達阻害剤、および該ポリヌクレオチドを含有し、かつ該ポリヌクレオチドを発現する細胞（以下、IGFBP発現細胞と称することがある）が含まれる。IGFBP発現細胞は、好ましくはIGFBP発現ベクターをトランスフェクションされた細胞であり得る。発現ベクターや発現ベクターをトランスフェクションする細胞は、タンパク質の発現に一般的に用いられているものから適宜選択することができる。例えば、ベクターDNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、天然に存在するDNAを抽出して得られたベクターDNAの他、増殖に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているベクターDNAでもよい。代表的なベクターDNAとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターDNAを例示できる。プラスミドDNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを例示できる。バクテリオファージDNAとして、λファージを例示できる。ウイルス由来のベクターDNAとして例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、SV40、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターDNAを例示できる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターDNA、具体的には、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターDNA（コスミドやファージミド等）を例示できる。細胞は、生体由来の細胞であれば特に制限はないが、好ましくは動物由来の細胞、より好ましくは哺乳動物由来の細胞、さらに好ましくはヒト由来の細胞である。細胞を阻害剤の有効成分として用いる場合、該細胞は単離された細胞または培養細胞であることが好ましく、さらに増殖抑制処理を施されたものであることがより好ましい。細胞の増殖抑制処理は、放射線照射等の公知方法により実施できる。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるポリヌクレオチドは、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば特に制限はない。好ましくはWnt受容体と結合してWntシグナル伝達を阻害するIGFBPをコードするポリヌクレオチドが適当である。Wnt受容体と結合し得るIGFBPをコードするポリヌクレオチドとして、好ましくはIGFBP-1をコードするポリヌクレオチド、IGFBP-2をコードするポリヌクレオチド、IGFBP-4をコードするポリヌクレオチドおよびIGFBP-6をコードするポリヌクレオチドを例示できる。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6のうち、IGFBP-4がWnt受容体との結合活性およびWntシグナル伝達阻害作用が最も高い。したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドとして、より好ましくはIGFBP-4をコードするポリヌクレオチドを例示できる。IGFBPをコードするポリヌクレオチドは、いずれの種由来のものであってもよく、好ましくは本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤の適用対象と同一の種由来であることが適当である。例えば、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤の適用対象がヒトまたはヒト由来の組織や細胞であるときには、本阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドはヒト由来であることが好ましい。
　IGFBP-4をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号1に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
　IGFBP-1をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号3に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
　IGFBP-2をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号5に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
　IGFBP-6をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号7に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドの範囲には、配列番号1、配列番号3、配列番号5、および配列番号7から選ばれるいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと、配列相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約50％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、さらにより好ましくは約95％以上である。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドの範囲には、また、配列番号1、配列番号3、配列番号5、および配列番号7から選ばれるいずれか1に記載の塩基配列において1個以上、例えば1～100個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～5個、さらにより好ましくは1～3個、特に好ましくは1個または2個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドが、Wnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、さらに好ましくはWntシグナル伝達を阻害するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。かかる変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチド、例えば誘発変異を有するポリヌクレオチドであってよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはPCR等を単独でまたは適宜組み合せて用いることができる。
　本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドの範囲には、上記ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも含まれる。
　Wnt受容体と結合し得るIGFBPをコードするポリヌクレオチドの選択は、例えば試験対象のポリヌクレオチドを細胞で発現させて該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を得、Wnt受容体であるFrz8やLRP6を用いて結合反応を行うことにより実施できる。Frz8やLRP6の代わりに、それらのWntとの結合ドメイン、Frz8システインリッチドメイン（Frz8CRD）やLRP6細胞外部分（LRP6N）、等を使用して結合反応を行うこともできる（実施例1参照）。結合反応は、慣用のタンパク質結合アッセイにより実施できる。
　本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害方法は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質の1種類を用いるものであってよく、また、該タンパク質の2種類以上を用いるものであってよい。
　Wntシグナル伝達の阻害は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質とWntシグナル伝達経路を有する細胞（以下、標的細胞と称することがある）とを接触させることにより達成できる。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質と標的細胞との接触は、in vitroでの処理およびin vivoでの処理のいずれでも実施できる。in vitroでの処理は、標的細胞の培養中にIGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質を添加することにより実施できる。in vivoでの処理は、対象にWnt受容体と結合し得るタンパク質を投与することにより実施できる。
　本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害方法は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの1種類を用いるものであってよく、また、該ポリヌクレオチドの2種類以上を用いるものであってよい。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法の範囲には、IGFBP発現ベクターを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法、およびIGFBP発現細胞を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法が含まれる。
　Wntシグナル伝達の阻害は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより達成できる。IGFBPは分泌タンパク質であるため、細胞内で発現されたIGFBPは細胞外に分泌され、そしてWntとWnt受容体との結合を阻害することによりWntシグナル伝達を阻害する。また、IGFBPはパラクリン様式に効果を示すため、IGFBPを分泌するIGFBP発現細胞で標的細胞を処理することによりWntシグナル伝達の阻害を実施できる。IGFBP発現細胞は、好ましくはIGFBP発現ベクターをトランスフェクションされた細胞であり得る。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、IGFBP発現ベクター、およびIGFBP発現細胞による標的細胞の処理は、in vitroでの処理およびin vivoでの処理のいずれであってもよい。in vitroでの処理は、培養標的細胞に上記ポリヌクレオチドやIGFBP発現ベクターを公知の遺伝子工学的手法により導入することにより、また、標的細胞の培養にIGFBP発現細胞を添加することにより実施できる。in vivoでの処理は、対象に上記ポリヌクレオチド、IGFBP発現ベクター、またはIGFBP発現細胞を投与することにより実施できる。in vivoでの処理においてIGFBP発現細胞を投与する場合には、該細胞は単離された細胞または培養細胞であることが好ましく、さらに増殖抑制処理を施されたものであることがより好ましい。細胞の増殖抑制処理は、放射線照射等の公知方法により実施できる。より好ましくは、対象から採取した細胞を、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで形質転換し、その後同一対象に投与することが好ましい。
　本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用に関する。
　本発明はまた、上記Wntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤に関する。さらに本発明は、上記Wntシグナル伝達阻害剤を用いることを手段とするWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法に関する。また本発明は、上記Wntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用に関する。
　Wntは、形態形成を制御するタンパク質であり、発生、幹細胞分化制御および細胞癌化等の様々な現象に関わることが知られている。また、Wntが幹細胞の増殖調節および生存に重要な因子であることが報告されている（非特許文献5および6）。そのため、Wntシグナル伝達の異常は、発生異常による疾患、例えば先天性心不全や、細胞機能の異常に係る疾患、例えば癌疾患を引き起こす。
　古典的Wntシグナル伝達は、心筋細胞の分化に決定的に重要な役割を果たす（非特許文献2および4）。また、古典的Wntシグナル伝達が、ヒヨコおよびカエルの胚で心臓発生を阻害すること、およびWnt拮抗剤、例えばDkk（dickkopf）や、前方内胚葉またはオーガナイザー領域から分泌されるクレセント（crescent）がWntに媒介される阻害シグナルと対抗して前方の側方中胚葉における心臓発生を誘導することが示されている（Naito, A.T. et al.,Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Tzahor, E. & Lassar, A.B., Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis., Genes Dev 15, 255-60 (2001); Schneider, V.A. & Mercola, M., Wnt antagonism initiates cardiogenesis in Xenopus laevis., Genes Dev 15, 304-15 (2001); Marvin, M.J., Di Rocco, G., Gardiner, A., Bush, S.M. & Lassar, A.B., Inhibition of Wnt activityinduces heart formation from posterior mesoderm., Genes Dev 15, 316-27 (2001)）。古典的Wntシグナル伝達はES細胞における心臓発生に時間依存的効果を示すことが示されており、ES細胞分化の初期相における古典的Wntシグナル伝達は心筋発生を促進するのに対し、後期相では心筋細胞への分化を阻害する（Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Ueno, S. et al., Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9685-90 (2007); Liu, Y. et al., Sox17 is essential for the specification of cardiac mesoderm in embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 3859-64 (2007)）。古典的Wntシグナル伝達の同様の時間依存的効果はゼブラフィッシュ胚で示されており（Ueno, S. et al., Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9685-90 (2007)）。さらに、いくつかの最近の報告で、古典的Wntシグナル伝達が二次心臓領域（secondary heart field）における心臓前駆細胞の増殖の正の調節装置であることが示唆されている（Lin, L. et al., Beta-catenin directly regulates Islet1 expression in cardiovascular progenitors and is required for multiple aspects ofcardiogenesis., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9313-8 (2007); Ai, D. et al., Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9319-24 (2007); Kwon, C. et al., Canonical Wnt signaling is a positive regulator of mammalian cardiac progenitors., Proc NatlAcad Sci USA 104, 10894-9 (2007); Cohen, E.D. et al., Wnt/beta-catenin signaling promotes expansion of Isl-1-positive cardiac progenitor cells through regulation of FGF signaling., J Clin Invest 117,1794-804 (2007); Qyang, Y. et al., The Renewal and Differentiation of Isl1+ Cardiovascular Progenitors Are Controlled by a Wnt/beta-Catenin Pathway., Cell Stem Cell 1, 165-79 (2007)）。このように、古典的Wntシグナル伝達は発達の多様な段階で心臓発生に相反する効果を示す。すなわち古典的Wntシグナル伝達は（i）原腸形成または中胚葉の特異化の時期に心臓発生を促進し、（ii）心臓中胚葉が前方の側方中胚葉において特異化される時期に心臓発生を阻害し、（iii）二次心臓領域において心臓前駆細胞の増大を促進し、そして（iv）胚性心臓が成長する後期には心臓発生を阻害する。
　したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、心筋細胞の分化誘導による心筋細胞の調製に用いることでき、さらに、心臓発達の誘導に適用できる。実際、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含まれるIGFBPは、心筋細胞の分化を誘導した（実施例1参照）。具体的には、IGFBP-4は、マウス由来細胞株P19CL6細胞および胚性幹細胞（ES細胞）の心筋細胞への分化を誘導した。また、IGFBP-4のノックダウンまたはWnt経路の活性化によりアフリカツメガエル胚での正常な心臓発達が損なわれたが、IGFBP-4のノックダウンによる心臓欠陥は、該ノックダウンに抵抗性のIGFBP-4の発現により回復した。このようなIGFBP-4の心筋細胞誘導活性および心臓発生活性は、IGFBP-4のWntシグナル伝達阻害作用によるものである。心臓発達においてWntシグナル伝達の阻害は、発達の後期、心臓が既に腹部で形成され、成長および再編を開始して胚の血液循環を維持するときに必要である。したがって、IGFBPを、例えばES細胞の心筋細胞への分化に用いるときには、後期相の胚葉体形成後に適用することが好ましい。
　「分化」または「細胞の分化」とは、形態的および機能的に特定の特徴を有さないいわゆる未分化な細胞から、その細胞の分裂により形態的および機能的に特定の特徴を有する細胞が生じることをいう。また、分化の過程において、未分化の細胞には認められなかった特定の遺伝子が発現する。このような遺伝子の発現も「分化」に含まれる。「分化を誘導する」とは、未分化な細胞から形態的および機能的特徴を有する細胞を生じさせることをいう。また、未分化な細胞には認められなかった特定の遺伝子を発現させることも「分化を誘導する」ことに含まれる。
　「心筋細胞の分化」とは、未分化な細胞の分裂により、心筋細胞としての形態的および機能的を有する細胞が生じることをいう。また、心筋細胞に特徴的な遺伝子が発現することも「心筋細胞の分化」に含まれる。心筋細胞は形態的特徴として接着性および伸展性を示す。心筋細胞は機能的特徴として、重層化したとき自発的に拍動を示す。心筋細胞に特徴的な遺伝子として、心臓発現マーカー遺伝子、例えばαミオシン重鎖（αMHC）遺伝子、Nkx2.5遺伝子、GATA-4遺伝子、心臓トロポニンT（cTnT）遺伝子等が挙げられる。「心筋細胞の分化を誘導する」とは、未分化な細胞から、心筋細胞としての形態的および機能的特徴を有する細胞を生じさせることをいう。また、心筋細胞に特徴的な遺伝子を発現させることも「心筋細胞の分化を誘導する」ことに含まれる。
　本発明において、上記Wntシグナル伝達阻害剤の有効量を含有する心筋細胞分化誘導剤、上記Wntシグナル伝達阻害剤を用いることを手段とする心筋細胞分化誘導方法を提供できる。心筋細胞分化誘導は、上記Wntシグナル伝達阻害剤と心筋細胞に分化し得る細胞とを接触させることにより達成できる。心筋細胞に分化し得る細胞として、多能性幹細胞を挙げることができる。「多能性幹細胞」とは、様々な組織または器官を構成する機能的および形態的に特徴を有する細胞に分化することができ、かつ、自己複製能を有する細胞をいう。多能性幹細胞として、組織幹細胞、胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞を例示できる。組織幹細胞とは、成体組織中に存在し、自己複製能を有する未分化の細胞をいう。組織幹細胞として骨髄由来幹細胞や心臓由来幹細胞を例示できる。ES細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞の細胞株のことであり、様々な組織または器官を構成する機能的および形態的に特徴を有する細胞に分化できる細胞をいう。人工多能性幹細胞とは、体細胞、例えば線維芽細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、多能性を持たせた細胞をいう。上記Wntシグナル伝達阻害剤と心筋細胞に分化し得る細胞との接触は、in vitroでの処理およびin vivoでの処理のいずれでも実施できる。in vitroでの処理は、細胞の培養中に上記Wntシグナル伝達阻害剤を添加することにより実施できる。in vivoでの処理は、対象に上記Wntシグナル伝達阻害剤を投与することにより実施できる。
　本発明においてまた、上記心筋細胞分化誘導方法により得られた心筋細胞およびその使用を提供できる。心筋細胞は好ましくは培養心筋細胞である。心筋細胞が誘導されたことは、細胞における心臓発現マーカー遺伝子、例えばαミオシン重鎖（αMHC）遺伝子、Nkx2.5遺伝子、GATA-4遺伝子等の発現により、また心臓トロポニンT（cTnT）タンパク質の発現により確認できる。これら遺伝子の発現の測定は、自体公知の遺伝子検出法により実施できる。遺伝子検出法として具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、またはRT-PCRを例示できる。また、in situ RT-PCRやin situ ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの遺伝子検出法を例示できる。また、該遺伝子によりコードされるタンパク質を、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて検出してもよい。
　本発明に係る心筋細胞分化誘導方法により提供される心筋細胞は、in vitroあるいはin vivoにおける心筋組織の構築あるいは再構築に使用できる。近年、心筋組織の再構築による再生医療が、心不全の治療法として精力的に検討されている。心不全とは、心機能、例えば心臓の収縮力や拡張力が低下し、全身組織に必要な血液循環が不足した病態生理学的状態をいい、心筋症、心筋梗塞、および心臓弁膜症等あらゆる心臓疾患の末期に現れる病態である。このような心臓疾患の多くにおいては、心筋組織の障害や変性が認められる。障害や変性を生じた心筋組織の再構築により、これら疾患の治療、および心不全の防止および／または治療が可能である。心筋組織の再構築は、障害や変性を生じた心筋組織内に心筋細胞を注入することにより、あるいは心筋細胞を培養して得られる心筋細胞シートや心筋細胞シートを積層した重層化心筋細胞を外科的手法で移植することにより実施できる。また、重層化心筋細胞は、生体に移植すると自発的に拍動を示すことが報告されており、移植用心臓として使用可能である。このように、本方法により提供される心筋細胞は、心筋組織の構築あるいは再構築に有用であることから、障害や変性を生じた心臓における心筋の修復を目的とした処置に使用でき、ひいては心筋症、心筋梗塞、および心臓弁膜症等の多様な心臓疾患の治療に使用できる。
　Wntシグナル伝達と疾患との関連についてはその他、その活性化がいくつかの形態の悪性腫瘍に関連していることが報告されている（Logan, C.Y. & Nusse, R., The Wnt signaling pathway in development and disease., Annu Rev Cell Dev Biol 20, 781-810 (2004); Clevers, H., Wnt/beta-catenin signaling in development and disease., Cell 127, 469-80 (2006)）。したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、癌疾患の防止および／または治療に適用できる。一方、IGFBP-4処理によりいくつかのがん細胞株におけるin vitroでの細胞増殖が低減したこと、およびIGFBP-4の過剰発現により前立腺がんのin vivoでの成長が低減したことが示されている（Durai, R. et al., Biology of insulin-like growth factor binding protein-4 and its role in cancer (review)., Int J Oncol 28, 1317-25 (2006)）。また、IGFBP-4の血清レベルの減少は乳がんの危険率に関連している。従来、IGFBP-4の発癌抑制作用は、IGFが細胞増殖作用を引き起こすことが知られていることから、IGFに結合してその細胞増殖作用を阻害することによるものであると考えられていた。しかしながら、IGFBP-4の細胞増殖への阻害効果は、部分的に、古典的Wntシグナル伝達の阻害により媒介されている可能性がある。
　本発明に係る薬剤は、有効成分の他、必要に応じて、一般に用いられる各種医薬用担体をさらに含む医薬組成物として調製し得る。医薬用担体として、例えば、1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含み得る。また、本発明に係るWntシグナル阻害剤は、医薬用担体の他、公知のWntシグナル阻害剤をさらに含む医薬組成物として調製し得る。また、本発明に係る心筋細胞分化誘導剤は、医薬用担体の他、公知の心筋細胞分化誘導剤を含む医薬組成物として調製し得る。
　本発明に係る薬剤や医薬組成物に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数等により適宜決定することができる。例えば、約0.1μg以上、好ましくは、1μg以上、より好ましくは10μg以上、さらに好ましくは100μg以上、さらにより好ましくは1mg以上である。
　本発明に係る薬剤や医薬組成物をin vitroで適用する場合、その用量や適用条件は簡単な繰り返し実験により決定することができる。本発明に係る薬剤や医薬組成物の用量は、例えば、培養細胞に適用する場合、一般的には約1ng/ml乃至約1mg/ml、好ましくは約10ng/ml乃至約100μg/ml、より好ましくは約100ng/ml乃至約10μg/ml、さらに好ましくは約100ng/ml乃至約1μg/mlの範囲の濃度で有効である。
　本発明に係る薬剤や医薬組成物を対象に投与する場合、その用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。本発明に係る薬剤を対象に投与する場合、一般的には適当な用量は、例えば対象の体重1kgあたり約0.01μg乃至約100mg程度、好ましくは約0.1μg乃至約1mg程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は1日1回乃至数回に分けて投与することができる。
　投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。
　剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等の注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。
　経口用固形製剤を調製する場合は、有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
　経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等を挙げることができる。
　注射剤を調製する場合は、有効成分にpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、チオグリコール酸、チオ乳酸等を挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等を挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
　坐剤を調製する場合は、有効成分に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じてツイーン登録商標のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
　軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等を挙げることができる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等を挙げることができる。
　貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
　また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
　本発明に係る薬剤および医薬組成物を遺伝子治療剤として用いる場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調整することもできる。遺伝子治療剤として用いる場合、本医薬組成物は、1日に1回または数回に分けて投与することができ、1日から数週間の間隔で間歇的に投与することもできる。投与の方法は、一般的な遺伝子治療法で用いられている方法に従うことができる。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
［1］材料および方法
（プラスミドおよび試薬）
　マウスIGFBPおよびアフリカツメガエルIGFBP-4（以下、XIGFBP-4と略称することがある）のcDNAクローンはOpen Biosystmes社より購入した。XIGFBP-4において第74番目のヒスチジン（His）がプロリン（Pro）により置換された変異体（XIGFBP-4-H74P）はQuikChange登録商標 Site-Directed Mutagenesisキット（Stratagene社製）により作製した。このような変異体はIGFに結合しない。Hisタグが付加されたヒト野生型IGFBP-4および変異体IGFBP-4-H74P（Qin, X., Strong, D.D., Baylink, D.J. & Mohan, S., Structure-function analysis of the human insulin-like growth factor binding protein-4., J Biol Chem 273, 23509-16 (1998)）はHitTrap HPキット（Amersham社製）を用いて作製し、そして精製した。
　可溶性LRP6欠失変異体およびin situハイブリダイゼーション解析用プローブ（Nkx2.5、cTnI、およびHex）はPCRにより作成した。IGFBP-4、Wnt3A、IGF-I、IGF-II、およびBMP2は、R＆D社より購入した。中和抗体はR＆D社（抗IGFBP-4抗体）、Sigma社（抗IGF-I抗体および抗IGF-II抗体）、およびOncogene社（抗I型IGF受容体抗体）より購入した。免疫沈降、ウエスタンブロッティング、および免疫染色に用いた抗体は、Invitrogen社（抗Myc抗体および抗V5抗体）、Santa Cruz社（抗トロポニンT（cTnT）抗体、抗IGFBP-4抗体、抗イトポイソメラーゼI（TOPO-I）抗体、Sigma社（抗β－アクチン抗体、抗β－カテニン抗体、および抗FLAG（M2）抗体）、およびDevelopmental Studies Hybridoma Bank（抗サルコメア　ミオシン重鎖抗体（MF20））より購入した。
　全長Frz8、Frz8システインリッチドメイン（Frz8CRD）、およびLRP6細胞外部分（LRP6N）については文献に記載されている（He, X. et al., A member of the Frizzled protein family mediating axis induction by Wnt-5A., Science 275, 1652-4 (1997); Tamai, K. et al., LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction., Nature 407, 530-5 (2000)）。全長LRP6、膜結合型LRP6欠失変異体、DKK1（dickkopf-1）については文献に記載されている（Mao, B. et al., LDL-receptor-related protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins., Nature 411, 321-5 (2001)）。アフリカツメガエルWnt8（Xwnt8）の発現ベクターであるpXwnt8およびpCSKA-Xwnt8については文献に記載されている（Christian, J.L., McMahon, J.A., McMahon, A.P. & Moon, R.T., Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1/int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis., Development 111, 1045-55 (1991); Christian, J.L. & Moon, R.T., Interactions between Xwnt-8 and Spemann organizer signaling pathways generate dorsoventral pattern in the embryonic mesoderm of Xenopus., Genes Dev 7, 13-28 (1993)）。β－カテニン発現ベクターであるPCS2-β－カテニンについては文献に記載されている（Yost, C. et al., Theaxis-inducing activity, stability, and subcellular distribution of beta-cateninis regulated in Xenopus embryos by glycogen synthase kinase 3., Genes Dev 10, 1443-54 (1996)）。αミオシン重鎖（αMHC）プロモータにより制御されるグリーン蛍光タンパク質（GFP）の発現ベクターであるαMHC-GFPについては文献に記載されている（Kolossov, E. et al., Identification and characterization of embryonic stem cell-derived pacemaker and atrial cardiomyocytes., FASEB J 19, 577-9 (2005)）。BMP応答性レポーター遺伝子であるBRE-lucについては文献に記載されている（Korchynskyi, O. & ten Dijke, P., Identification and functional characterization of distinct critically important bone morphogenetic protein-specific response elements in the Id1 promoter., J Biol Chem 277, 4883-91 (2002)）。ディシェブルド1（Dishevelled-1;Dvl-1）発現ベクターであるpCGN-Dv1-1については文献に記載されている（Kishida, M. et al., Synergistic activation of the Wnt signaling pathway by Dvl and casein kinase Iepsilon., J Biol Chem 276, 33147-55 (2001)）。
（細胞培養実験）
　P19CL6細胞およびES細胞の心筋細胞への分化の誘導および培養は、本質的には従前の報告に記載された方法と同様の方法で実施した（Monzen, K. et al., Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4., Mol Cell Biol 19, 7096-105 (1999); Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006)）。
　αMHC-GFPを安定的にトランスフェクションされたP19CL6細胞またはES細胞は、P19CL6細胞またはht7 ES細胞にαMHC-GFPをトランスフェクションし、その後G418を用いて選択することにより作成した。
　ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびRT-PCRは、従前の報告に記載された方法と同様の方法で実施した（Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006)）。レポーター遺伝子アッセイは少なくとも3回繰り返し行った。
　PCRプライマーおよびPCR条件は表1に一覧表示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　短鎖干渉RNA（small interfering RNA、siRNA）コンストラクトによるIGFBPのノックダウンは、siRNAをpSIREN-RetroQベクター（Clontech社製）を用いて細胞内で発現させることにより実施した。具体的には、二重鎖オリゴヌクレオチドと結合させたpSIREN-RetroQベクターをP19CL6細胞またはES細胞にトランスフェクションし、そしてピューロマイシン抵抗性クローンを単離し、そして増殖させた。
　二重鎖オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列を表2に一覧表示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　β－カテニン安定化アッセイは、L細胞の核抽出物を用いて実施した。L細胞の核抽出物は、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction試薬（Pierce社製）を用いて調製した。データは平均値±標準偏差で示した。
（免疫沈降（IP）／ウエスタン解析および結合アッセイ）
　IP／ウエスタン解析は、全長IGFBPまたはその様々な欠失変異体、LRP6、Frz8CRD、およびDKK1をそれぞれ含む各馴化培地（conditioned medium）を293細胞を用いて作製し、これらを用いて実施した。結合反応は4℃にて一晩実施した。免疫沈降はProtein G Sepharose 4 Fast Flow（Amersham社製）を用いて実施した。IGFBP-4およびWnt3Aの125I標識は、IODO-BEADS登録商標ヨード化試薬（Pierce社製）を用いて実施した。液相結合アッセイは、基本的には従前報告された方法と同様の方法で実施した（Semenov, M.V. et al., Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6., Curr Biol 11, 951-61 (2001)）。簡潔にいえば、Mycタグを付加したLRP6N（LRP6N-Myc）またはMycタグを付加したFrz8CRD（Frz8CRD-Myc）を様々な濃度の125I標識IGFBP-4と混合し、そして4℃にて一晩インキュベーションした。LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを免疫沈降させ、そしてProtein G Sepharose ビーズを徹底的に洗浄した後、結合したIGFBP-4の放射活性を測定した。競合結合アッセイのために、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを含む馴化培地を125I標識Wnt3Aおよび非標識IGFBP-4と混合し、そして4℃にて一晩インキュベーションした。次いで、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを免疫沈降させ、そして結合したWnt3Aの放射活性を測定した。
（アフリカツメガエル実験およびマウスin situハイブリダイゼーション解析）
　アフリカツメガエルにおけるアキシスデュプリケーションアッセイ、アニマルキャップアッセイ、およびin situハイブリダイゼーション解析は、基本的には従前報告された方法と同様の方法で実施した（Kobayashi, H. et al., Novel Daple-like protein positively regulates both the Wnt/beta-catenin pathway and the Wnt/JNK pathway in Xenopus., Mech Dev 122, 1138-53 (2005)）。XIGFBP-4について、2つの別個のcDNA、おそらく偽四倍体ゲノム（pseudotetraploid genome）に起因するものを、5'RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法により同定した。これら2つのIGFBP-4転写物の両方を標的とする2つの別個のMOを設計した（Gene Tools社）。MO1は、翻訳開始コドン上流に隣接する2番目のヌクレオチドから翻訳領域の23番目のヌクレオチドまでの25ヌクレオチドからなる配列を標的とし、MO2は、非翻訳領域の25ヌクレオチドからなる配列を標的とする。MO感受性XIGFBP-4 cDNAは、41bpの5'非翻訳領域を含むものであり、PCRにより作成した。MO抵抗性XIGFBP-4 cDNA（野生型およびH74P変異体）は、MO1標的配列に5つのサイレント変異を導入し、そして5'非翻訳領域を削除することにより作成した。MOの特異性を決定するため、MO感受性またはMO抵抗性のXIGFBP-4-Myc mRNAをMOと共にまたはMOなしでアフリカツメガエル胚に注入し、そしてタンパク質およびmRNA発現を分析した。PCRプライマーおよびPCR条件は上記表1に一覧表示する。MOおよびプラスミドDNAは8細胞段階において、心臓および肝臓原基へと運命付けられた2つの背側植物割球の背側領域に注入した。mRNAの電気穿孔法による導入は、本質的には従前報告された方法と同様の方法で実施した（Sasagawa, S., Takabatake, T., Takabatake, Y., Muramatsu, T. & Takeshima, K., Improved mRNA electroporation method for Xenopus neurula embryos., Genesis 33, 81-5 (2002)）。mRNA（5nl溶液中5ng）の心臓原基近辺への注入および電気パルスの適用は段階29に実施した。マウスIGFBP-4のホールマウントin situハイブリダイゼーション解析は、従前報告された方法と同様の方法で実施した（Hosoda, T. et al., A novel myocyte-specific gene Midori promotes the differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes., J Biol Chem 276, 35978-89 (2001)）。
［2］形態形成や細胞増殖を調節する新たな液性因子の探索
　形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する新たな液性因子の探索を、心筋細胞に分化するマウス由来の細胞株P19CL6細胞を用いて実施した。P19CL6細胞は1％　DMSO存在下で高い効率をもって心筋細胞へ分化することが知られている（Monzen, K. et al., Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4., Mol Cell Biol 19, 7096-105 (1999)）。
　具体的には、P19CL6細胞（2000細胞／35mm　シャーレ）を様々な種類の細胞により馴化された培養培地でDMSO非存在下に培養し、各馴化培地の心臓発生活性を選別した。心筋細胞の分化の程度は、サルコメアのミオシン重鎖を認識するモノクローナル抗体（MF20、Developmental Studies Hybridoma Bank）を用いた免疫染色により評価した。MF20陽性領域の増加はP19CL6細胞の心筋細胞への分化を示す。また、培養されたP19CL6細胞における心臓マーカー（αミオシン重鎖（αMHC）、Nkx2.5、およびGATA-4）遺伝子の発現、並びに心臓のcTnTタンパク質の検出を行った。心臓マーカー遺伝子の発現の検出は、各遺伝子に対するプライマーを用いてRT-PCRにより実施した。コントロールとして、β－アクチン遺伝子の発現の検出を行った。用いたプライマーおよびPCR条件は上記表1に示す。cTnTタンパク質の検出は、抗cTnT抗体（Santa Cruz社製）を用いたウエスタンブロッティングにより実施した。コントロールとしてアクチンの検出を抗β－アクチン抗体（Sigma社製）を用いて行った。
　試験した数種類の細胞のうち、マウス骨髄間葉系細胞株OP9により馴化された培養培地がP19CL6細胞の心筋細胞への分化をDMSO処理なしに誘導した（図1-a、左および中央パネル）。MF20陽性領域は、αMHC、Nkx2.5、およびGATA-4等の心臓のマーカー遺伝子の誘導およびcTnTタンパク質レベルの増加に伴って増加した（図1-a、右パネル）。それに反し、COS7細胞、マウス胚線維芽細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞、END2細胞（臓側内胚葉様細胞）、新生仔ラット心筋細胞、および新生仔ラット心臓線維芽細胞により馴化された培養培地はDMSO非存在下でのP19CL6細胞の心筋細胞への分化を誘導しなかった（図1-aおよびデータ未記載）。
　これら観察結果から、OP9細胞は心臓発生因子（cardiogenic factor）を分泌すると考えた。OP9細胞に由来する心臓発生因子を特定するために、OP9細胞cDNAライブラリからシグナルシークエンストラップ法により単離したcDNAクローン（Ueno, H. et al., A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells., Nat Immunol 4, 457-63 (2003)）について、一過性発現によりそれらの心臓発生活性を試験した。可能である場合には、組換えタンパク質も用いて結果を確認した。
　試験した候補因子の中で、IGFBP-4処理はP19CL6細胞の心筋細胞への分化を誘導することがMF20陽性領域の増大および心臓のマーカーの誘導により明らかになった（図1-b）。また、P19CL6細胞を抗IGFBP-4中和抗体（R＆D社製）で前処理したOP9馴化培地で培養したところ、抗IGFBP-4中和抗体の適用はOP9馴化培地により誘導される心筋細胞への分化の効率を低減させた（図1-c）。
　上記結果はIGFBP-4がOP9細胞から分泌される心臓発生因子であることを強く示唆する。
［3］IGFBP-4が心筋発生を誘導するメカニズムの検討
　IGFBPはIGFに結合してその作用を調節する分子とみなされているため、IGFBP-4による心臓発生促進効果がIGFの作用の増強および阻害のいずれによるかを検討した。まずP19CL6細胞を抗IGF-I中和抗体（Sigma社製）および抗IGF-II中和抗体（Sigma社製）の組み合わせ、またはIGFタイプI受容体に対する中和抗体（Oncogene社製）で処理した。これら抗体による処理が心筋細胞の分化を誘導するおよび／またはIGFBP-4の心臓発生効果を増大させる場合は、IGFBP-4がIGFシグナル伝達を阻害することにより心筋細胞の分化を誘導すると判定した。他方、これら抗体による処理がIGFBP-4による心臓発生を低減させる場合は、IGFBP-4がIGFシグナル伝達を増強することにより心筋細胞の分化を誘導すると判定した。また、IGFBP-4の代わりに、IGFに結合しないIGFBP-4変異体（IGFBP-4-H74P）を用いて、P19CL6細胞の心筋細胞への分化を試験した。
　抗IGF-I中和抗体および抗IGF-II中和抗体の組み合わせ、またはIGFタイプI受容体に対する中和抗体による処理は、IGFBP-4が誘導する心筋細胞の分化の効率に影響しなかった（図1-dおよびデータ未記載）。また、P19CL6細胞をIGF-I（R＆D社製）およびIGF-II（R＆D社製）で処理しても心筋細胞の分化は誘導されなかった（データ未記載）。さらにまた、IGFBP-4-H74Pによる処理はP19CL6細胞の心筋細胞への分化を、野生型IGFBP-4よりさらにいっそう効率的に誘導した（図1-e）。これはおそらく内因性IGFにより野生型IGFBP-4が消失するが、変異体IGFBP-4-H74Pは消失しないことによる。この結果と一致して、外因性IGFは野生型IGFBP-4が誘導する心臓発生を低減させたがIGFBP-4-H74Pが誘導する心臓発生は低減させなかった（図1-f）。
　これら観察結果を総合すると、IGFBP-4がIGF非依存的様式で心筋細胞の分化を誘導すると考えることができる。
　心筋細胞の分化には古典的Wntシグナル伝達が決定的に重要な役割を果たしていることが示されている（非特許文献2および4）。
　そこで、IGFBP-4が古典的Wntシグナル伝達を調節する可能性を検討した。検討は、β－カテニン依存的転写因子Tcfの転写活性を測定し得るレポーター遺伝子TOPLFASH（Upstate社製）およびそのネガティブコントロールであるFOPLFASH（Upstate社製）を用いて行った。まず、P19CL6細胞にレポーター遺伝子であるTOPLFASHまたはFOPLFASH、およびLRP6またはFrz8の発現ベクターをトランスフェクションし、Wnt3AとIGFBP-4で処理した。TOPLFASH活性はルシフェラーゼ活性の測定により評価した。また、コントロールとして、BMP2により惹起され、Smadを介して標的遺伝子の転写が行われるシグナル伝達経路へのIGFBP-4の効果を、BMP応答性レポーター遺伝子BRE-lucを用いて検討した。P19CL6細胞において、Wnt3A処理はTOPLFASH活性を増強した（図2-a）。また、Wnt3AによるTOPLFASH活性の増強は、LRP6またはFrz8の発現ベクターのトランスフェクションによりさらに増強された（図2-a）。一方、Wnt3AによるこれらTOPLFASH活性の増強は、IGFBP-4により低減された（図2-a）。ネガティブコントロールであるFOPLFASHを用いたときには、Wnt3A処理、LRP6またはFrz8の発現ベクターのトランスフェクション、およびIGFBP-4処理によるTOPLFASH活性の変化はなかった（図5-a）。また、IGFBP-4は、BMP2によるBMP応答性BRE-lucの濃度依存性活性化には影響しなかった（図5-b）。
　これら結果から、IGFBP-4は、Wnt3A処理によるβ－カテニン依存性転写活性を阻害することが明らかになった。すなわち、IGFBP-4が古典的Wnt経路の特異的阻害剤であることが示唆された。
　次に、IGFBP-4によるin vivoにおける古典的Wnt経路の阻害を、アフリカツメガエル胚におけるアキシスデュプリケーションアッセイにより検討した。アフリカツメガエル胚へのXwnt8 mRNAの注入により二次軸の形成が生じたが、Xwnt8 mRNAによる二次軸の形成はXIGFBP-4 mRNAの胚への注入により効果的に妨げられた（図2-b）。同様に、LRP6 mRNAの胚への注入により二次軸の形成が生じ、LRP6 mRNAによる二次軸の形成はXIGFBP-4 mRNAの胚への注入により効果的に妨げられた（図2-c）。XIGFBP-4 mRNAのみの注入は軸形成にほとんど影響しなかった（図2-bおよび図2-c）。
　これら結果は、IGFBP-4が古典的Wntシグナル伝達をin vivoでもin vitroでも阻害することを示す。
　IGFBP-4によるWnt阻害のメカニズムを解明するために、アフリカツメガエルキャップアッセイおよびTOPLFASHレポーター遺伝子アッセイを実施した。まず、LRP6 mRNA、β－カテニン mRNA、β－ガラクトシダーゼ mRNA、IGFBP-4 mRNAを図5-cに示した組み合わせで、アフリカツメガエルの2細胞期胚の動物極に注入した後、段階85の胚からアニマルキャップを切り出し、5ng/ml　アクチビンおよび0.1％　牛血清アルブミンを含むスタインバーグ溶液中で胚が段階17に達するまで培養した。次いで、得られた胚のWnt標的遺伝子、siamoisおよびXnr-3の発現を測定した。コントロールとして、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）遺伝子の発現を測定した。TOPLFASHレポーター遺伝子アッセイは、上記同様に実施した。まず、P19CL6細胞にLRP6発現ベクター、β－カテニン発現ベクター、またはDvl-1発現ベクターおよびTOPLFASHをトランスフェクションし、Wnt3AとIGFBP-4で処理した。また、TOPLFASHのみをトランスフェクションしたP19CL6細胞を、Wntシグナルを活性化する塩化リチウムおよびIGFBP-4で処理した。
　アニマルキャップアッセイでは、IGFBP-4は、LRP6により誘導されるWnt標的遺伝子発現を阻害したが、β－カテニンが誘導するWnt標的遺伝子発現を阻害しなかった（図5-c）。同様に、IGFBP-4はWnt3AまたはLRP6が誘導するTOPLFASH活性を低減した（図5-d）が、Wntシグナル伝達因子であるDvl-1やβ－カテニンが誘導するTOPLFASH活性、並びにWntシグナルを活性化する塩化リチウムが誘導するTOPLFASH活性には影響しなかった（図5-dおよび図5-e）。
　これら結果はIGFBP-4が古典的Wntシグナル伝達を細胞表面受容体の段階で阻害することを示唆する。
　次に、IGFBP-4がWntシグナル伝達をWnt受容体であるLRP5／6またはFrizzledとの直接的な物理的相互作用により競合するかどうかを試験した。まず、LRP6N-Myc、Frz8CRD-Myc、またはV5タグを付加したIGFBP4（IGFBP-4-V5）を含む馴化培地を293細胞を用いて調製した。そして、IGFBP-4-V5と、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycとの結合反応を4℃にて一晩実施した。結合解析は、抗Myc抗体による免疫沈降後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット、並びに、抗V5抗体による免疫沈降後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロットにより行った。さらに、125I標識IGFBP-4を用いた液相結合アッセイ（liquid-phase binding assay:LBR）を、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを含む馴化培地について実施した。同様の液相結合アッセイを、125I標識Wnt3Aを用いて実施し、Wnt3AとLRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycとの結合に対するIGFBP-4の効果を検討した。
　上記試験の結果、IGFBP-4がLRP6N（図2-d）およびFrz8CRD（図2-e）と相互作用することが明らかになった。また、液相結合アッセイにより、IGFBP-4とLRP6Nとの間、あるいはIGFBP-4とFrz8CRDとの間の相互作用は特異的かつ飽和し得るものであることが実証された（図2-fおよび図2-g）。スカッチャードプロット解析により、LRP6Nに対する異なった結合親和性を有する2つの結合部位が（図2-f、差込図）、Frz8CRDに対しては1つの結合部位が存在することが明らかになった（図2-g、差込図）。また、LRP6N（図2-h）およびFrz8CRD（図2-i）に対するWnt3Aの結合をIGFBP-4が阻害することが実証され、そしてラインウェーバー・バーグ　プロットによりIGFBP-4はWnt3AのFrz8CDRへの結合の拮抗阻害剤であることが明らかになった（図6-a）。
　さらに、結合解析をLRP6およびIGFBP-4の数々の欠失変異体（図6-b）を用いて行ったところ、IGFBP-4はLRP6の多種多様なドメインと相互作用すること、およびIGFBP-4のカルボキシ末端サイログロブリンドメインがIGFBP-4のLRP6またはFrz8CRDとの結合に重要であることが明らかになった（図6-c～図6-f）。
　上記結果から、IGFBP-4がWnt／β－カテニン経路をFrizzledおよびLRP5／6との直接的相互作用を介して競合阻害することが判明した。
　古典的Wntシグナル伝達の阻害は、ES細胞、並びにヒヨコ、アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュの胚における心筋細胞の分化を促進することが報告されている（Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Tzahor, E. & Lassar, A.B., Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis., Genes Dev 15, 255-60 (2001); Schneider, V.A. & Mercola, M., Wnt antagonism initiates cardiogenesis in Xenopus laevis., Genes Dev15, 304-15 (2001); Marvin, M.J., Di Rocco, G., Gardiner, A., Bush, S.M. & Lassar, A.B., Inhibition of Wnt activity induces heart formation from posterior mesoderm., Genes Dev 15, 316-27 (2001); Ueno, S. et al., Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9685-90 (2007)）。したがって上記結果および従前の報告から、IGFBP-4は、古典的Wntシグナル伝達を阻害することにより、心臓発生を促進すると考えることができる。
［4］心筋細胞への分化における内因性IGFBP-4の役割の解明
　P19CL6細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBPファミリーメンバーの発現を検討した。P19CL6細胞の心筋細胞への分化はDMSO添加により誘導し、DMSO添加後、第0日、第2日、第4日、第6日および第8日にIGFBP発現をRT-PCRにより測定した。
　IGFBP-4の発現は、P19CL6細胞の心筋細胞への分化の間中、増強されたことが明らかになった（図3-a）。IGFBP-3およびIGFBP-5もまた、分化の初期および後期にそれぞれ増強された。IGFBP-2の発現は変化せず、そしてIGFBP-1またはIGFBP-6の発現は検出されなかった。
　次に、P19CL6細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBP-4のノックダウンの効果を検討した。IGFBP-4のノックダウンは、IGFBP-4に対する2種類の2つの別個のsiRNAコンストラクトを用いて行った。P19CL6細胞の心筋細胞への分化はDMSO添加により誘導し、心筋細胞への分化は、心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）の発現およびcTnTタンパク質の発現により評価した。また、IGFBP-3およびIGFBP-5のsiRNAによるノックダウンの効果も同様に検討した。
　いずれのIGFBP-4 siRNAも、DMSOで誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を阻害した（図3-b）。それに反して、IGFBP-3 siRNAまたはIGFBP-5 siRNAは、DMSOで誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を阻害しなかった（図3-b、右パネル）。
　また、抗IGFBP-4中和抗体による処理も、DMSOで誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を阻害した（図3-c）。
　これら結果から、内因性IGFBP-4の分泌が、P19CL6細胞の心筋細胞への分化に必要であることが明らかになった。内因性IGFBP-4の分泌とP19CL6細胞の心筋細胞への分化との関連性をさらに解明するために、αMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションしたP19CL6細胞の心筋細胞への分化をDMSOにより誘導し、IGFBP-4の免疫染色を実施した。DMSOにより心筋細胞へ分化誘導されたP19CL6細胞はIGFBP-4陽性細胞に取り囲まれていることが、IGFBP-4の免疫染色により明らかになった（図3-d）。この結果は、IGFBP-4が心筋細胞分化に対して主にパラクリン効果を示すことを示唆する。さらに、ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を同様に検討した。その結果、P19CL6細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果の検討結果と本質的に同様の結果が得られた（図7-a～図7-g）。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された（図7-a～図7-c）。また、ES細胞の心筋細胞への分化はIGFBP-4のsiRNAによるノックダウンや、抗IGFBP-4抗体処理により低減した（図7-e～図7-f）。また、マウス胚（E95）におけるIGFBP-4のin situハイブリダイゼーション解析において、マウスIGFBP-4が、心臓の近隣の組織、例えばE95における咽頭弓や肝芽に強く発現していることが判明した（図7-h）。これら結果はIGFBP-4が筋細胞分化に対して主にパラクリン効果を示すことを強く支持する。心臓中胚葉が線維芽細胞増殖因子（FGF）を分泌して腹部中胚葉における肝臓前駆細胞を誘導することを示す従前の報告（Jung, J., Zheng, M., Goldfarb, M. & Zaret, K.S., Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors., Science 284, 1998-2003 (1999)）と合わせて、これら観察結果は心臓と肝臓の間に互いに発達を連携的に促進する相互シグナル伝達が存在することを示唆する。
　次に、心筋細胞への分化における内因性IGFBP-4の効果が、古典的Wnt経路の阻害を介するかどうか検討した。具体的には、コントロールP19CL6細胞およびIGFBP-4をsiRNAによりノックダウンしたP19CL6細胞に、GFPまたはLRP6Nの発現ベクターをトランスフェクションし、そしてDMSO処理により心筋細胞への分化を誘導した。LRP6Nは野生型LRP6に対してドミナントネガティブ作用を有し、その過剰発現はWntシグナル伝達を阻害する。LRP6Nの発現は、P19CL6細胞の心筋細胞への分化を増強し、そしてIGFBP-4ノックダウンより低減されたP19CL6細胞の心筋細胞への分化を回復した（図3-e）。
　上記観察結果は、内因性IGFBP-4がP19CL6細胞およびES細胞の心筋細胞への分化に必要であること、そしてIGFBP-4の心臓発生効果はWnt／β－カテニンシグナル伝達の阻害効果を介することを示唆する。
［5］in vivoでの心臓の発達における内因性IGFBP-4の役割の解明
　内因性IGFBP-4のin vivoでの心臓の発達における役割を、アフリカツメガエル胚を用いて試験した。まず、アフリカツメガエル胚におけるNkx2.5（初期心臓マーカー）、cTnI（成熟心臓マーカー）、Hex（肝臓マーカー）、およびXIGFBP-4 mRNAの、段階34、38および42における発現をin situハイブリダイゼーション解析した。その結果、XIGFBP-4の強い発現が段階38において心臓に隣接する前方肝臓で検出された（図4-a）。
　次に、XIGFBP-4を、2つの別個のモルフォリノ（MO）コンストラクト（図8-aおよび表2）によりノックダウンした心臓発生における効果を検討した。これら2つのMOは、2つのXIGFBP-4（XIGFBP-4およびXIGFBP-4d）に対して設計し合成したものである（図8-a）。その結果、XIGFBP-4の2つの別個のモルフォリノ（MO）コンストラクトによるノックダウンは心臓欠陥を引き起こし、70％以上の胚で心臓が小型であるか、または認められなかった（図4-b）。一方、XIGFBP-4 cDNA、IGF結合に欠陥のあるXIGFBP-4変異体（XIGFBP-4-H74P）、またはドミナントネガティブLRP6であるLRP6Nの共発現により、MOにより誘導される心臓欠陥が回復した（図4-b）。また、用いたMOがXIGFBP-4特異的であることは、MO感受性mRNAから翻訳されたXIGFBP-4-Mycタンパク質の発現はMO1またはMO2の共注入により低減されたが、MO抵抗性mRNAからのタンパク質発現は影響を受けなかったこと（図8-b）、およびMOにより誘導される心臓欠陥がMO抵抗性XIGFBP-4 cDNA（図8-a）の共注入によって回復したこと（図8-c）から明らかである。
　重要なことは、IGF結合に欠陥のあるXIGFBP-4-H74PまたはドミナントネガティブLRP6の共発現がXIGFBPノックダウンにより誘導される心臓欠陥を回復させた（図4-b）が、一方、Xwnt8の心臓形成領域における過剰発現はXIGFBP-4ノックダウンにより誘導される心臓欠陥と同様の心臓欠陥を生じた（図8-d～図8-f）ことであり、これはIGFBP-4の心臓発生効果がIGF非依存性であるがWnt／β－カテニン経路の阻害を介するという見解を支持する。
　XIGFBP-4ノックダウンにより誘導される心臓欠陥の時間的特徴をまた、心臓トロポニンI（cTnI）in situハイブリダイゼーションにより試験した（図4-c）。段階34において、心臓の形態はコントロール胚とMO注入胚とで同様であった。しかしながら、段階38において、XIGFBP-4が前方肝臓で発現され始めると、cTnIの発現がMO注入胚において著しく減少し、そして段階42ではcTnIの発現が低減し心臓様構造は認められなかった。
　このように、XIGFBP-4の非存在下では、心臓は初期には形成されるが、それに続く心臓の成長は異常をきたす。このことはIGFBP-4が胚性心筋細胞の増殖および／または生存を維持することにより心臓発生を促進することを示唆する。
　IGFBPは、6つのメンバー、すなわちIGFBP-1からIGFBP-6で構成される。これらIGFBPファミリーメンバーによるWntシグナル伝達阻害作用をレポーター遺伝子アッセイおよびβ－カテニン安定化アッセイにより検討した。また、各IGFBPファミリーメンバーとLRP6またはFrz8との相互作用をIP／ウェスタン解析により検討した。レポーター遺伝子アッセイ、β－カテニン安定化アッセイ、およびIP／ウェスタン解析は、実施例1に記載した方法と同様の方法で実施した。
　IGFBP-4はIGFBPファミリーメンバーの中で最も強く、Wnt3Aによるβ－カテニン発現を阻害した。IGFBP-1、IGFBP-2、およびIGFBP-6もまた中程度のWnt阻害活性を示すが、一方、IGFBP-3およびIGFBP-5はこのような活性を示さないことが明らかになった（図9-a～図9-c）。この結果と一致して、IP／ウエスタン解析により、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4、およびIGFBP-6がLRP6またはFrz8CRDと相互作用するが、IGFBP-3およびIGFBP-5はLRP6またはFrz8CRDと相互作用しないことが明らかになった（図9-dおよび図9-e）。
　これら結果から、IGFBP-4のみならず、IGFBP-1、IGFBP-2、およびIGFBP-6もまたWnt受容体であるLRP6またはFrz8と結合し、それによりWntシグナル伝達を阻害することが判明した。
配列番号1：IGFBP-4（配列番号2）をコードする遺伝子。
配列番号3：IGFBP-1（配列番号4）をコードする遺伝子。
配列番号5：IGFBP-2（配列番号6）をコードする遺伝子。
配列番号7：IGFBP-6（配列番号8）をコードする遺伝子。
配列番号9：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号10：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号11：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号12：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号13：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号14：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号15：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号16：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号17：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号18：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号19：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号20：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号21：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号22：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号23：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号24：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号25：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号26：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号27：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号28：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号29：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号30：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号31：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号32：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号33：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号34：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号35：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号36：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号37：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号38：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号39：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号40：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号41：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号42：モルフォリノ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号43：モルフォリノ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号44：アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子の部分配列。
配列番号45：アフリカツメガエルIGFBP-4変異体遺伝子の部分配列。
配列番号46：アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子内のモルフォリノ標的配列。
配列番号47：アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子内のモルフォリノ標的配列。
配列番号48：モルフォリノ抵抗性のアフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子の部分配列。

Claims (31)

  1. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類を含有するWntシグナル伝達阻害剤。
  2. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、下記タンパク質群より選ばれるタンパク質の少なくとも1種類であり、その少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤：
    （1）配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
    （2）前記（1）のタンパク質と70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
    （3）前記（1）のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。
  3. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項1または請求項2に記載のWntシグナル伝達阻害剤。
  4. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項1または請求項2に記載のWntシグナル伝達阻害剤。
  5. Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である請求項1から4のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤。
  6. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類を含有するWntシグナル伝達阻害剤。
  7. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、下記ポリヌクレオチド群より選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも1種類であり、その少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤：
    （1）配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
    （2）前記（1）のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （3）前記（1）のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
    （4）前記（1）から（3）のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
  8. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである請求項6または請求項7に記載のWntシグナル伝達阻害剤。
  9. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである請求項6または請求項7に記載のWntシグナル伝達阻害剤。
  10. Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である請求項6から9のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤。
  11. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法。
  12. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、下記タンパク質群より選ばれるタンパク質の少なくとも1種類である請求項11に記載のWntシグナル伝達阻害方法：
    （1）配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
    （2）前記（1）のタンパク質と70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
    （3）前記（1）のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。
  13. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項11に記載のWntシグナル伝達阻害方法。
  14. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項11に記載のWntシグナル伝達阻害方法。
  15. Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である請求項11から14のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害方法。
  16. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法。
  17. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、下記ポリヌクレオチド群より選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも1種類である請求項16に記載のWntシグナル伝達阻害方法：
    （1）配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
    （2）前記（1）のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （3）前記（1）のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
    （4）前記（1）から（3）のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
  18. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである請求項16に記載のWntシグナル伝達阻害方法。
  19. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである請求項16に記載のWntシグナル伝達阻害方法。
  20. Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である請求項16から19のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害方法。
  21. インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用。
  22. 請求項1から10のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤。
  23. 請求項1から10のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤の有効量を対象に投与することを手段とするWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法。
  24. 請求項1から10のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用。
  25. 請求項1から10のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有する心筋細胞分化誘導剤。
  26. 請求項1から10のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤の有効量を心筋細胞に分化し得る細胞と接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法。
  27. 心筋細胞に分化し得る細胞が多能性幹細胞である請求項26に記載の心筋細胞分化誘導方法。
  28. 心筋細胞に分化し得る細胞が胚性幹細胞である請求項26に記載の心筋細胞分化誘導方法。
  29. 請求項1から10のいずれか1項に記載のWntシグナル伝達阻害剤の有効量を対象に投与することを手段とする心筋細胞分化誘導方法。
  30. 請求項26から28のいずれか1項に記載の心筋細胞誘導方法により得られた心筋細胞。
  31. 請求項26から28のいずれか1項に記載の心筋細胞誘導方法により得られた心筋細胞の使用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110243899A1 (en) 2008-04-25 2011-10-06 National University Corporation Chiba University Wnt Signaling Inhibitor Comprising Insulin-Like Growth Factor-Binding Protein

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007070964A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Es Cell International Pte Ltd Direct differentiation of cardiomyocytes from human embryonic stem cells

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6004775A (en) * 1990-08-03 1999-12-21 The Salk Institute For Biological Studies DNA encoding IGFBP-4
US6395890B1 (en) * 1998-02-20 2002-05-28 Zymogenetics, Inc. Nucleic acids encoding connective tissue growth factor homologs
WO1999055359A1 (en) * 1998-04-29 1999-11-04 Allergan Sales, Inc. Compositions and methods for extending the action of clostridial neurotoxin
EP1485117A4 (en) * 2002-01-22 2006-03-22 Univ New York METHOD FOR THERAPEUTIC TREATMENT OF BENIGN PROSTATE HYPERTROPHY (BPH)
WO2005049648A2 (en) * 2003-07-09 2005-06-02 The University Of Iowa Research Foundation Chimeric or fusion constructs of insulin-like growth factor binding proteins as chemotherapeutic agents
CN101426902B (zh) * 2006-04-28 2013-03-27 第一三共株式会社 将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法
WO2008137641A2 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells
US20110243899A1 (en) 2008-04-25 2011-10-06 National University Corporation Chiba University Wnt Signaling Inhibitor Comprising Insulin-Like Growth Factor-Binding Protein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007070964A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Es Cell International Pte Ltd Direct differentiation of cardiomyocytes from human embryonic stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONY W. WOOD, MOLECULAR ENDOCRINOLOGY, vol. 19, no. 4, 2005, pages 1024 - 1034 *
WEIDONG ZHU, NATURE, vol. 454, 17 July 2008 (2008-07-17), pages 345 - 350 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3498824A1 (en) 2013-04-26 2019-06-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells

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