WO2010041617A1 - β－アミロイド前駆体蛋白質由来マトリックスメタロプロテアーゼ－２インヒビターペプチドと組織メタロプロテアーゼ阻害物質との融合タンパク質 - Google Patents

β－アミロイド前駆体蛋白質由来マトリックスメタロプロテアーゼ－２インヒビターペプチドと組織メタロプロテアーゼ阻害物質との融合タンパク質 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein of a matrix metalloproteinase-2 inhibitor peptide derived from ⁇ -amyloid precursor protein and a tissue metalloprotease inhibitor, and uses thereof, and more particularly, to a matrix metalloproteinase-2 of ⁇ -amyloid precursor protein molecule
  • the present invention relates to a fusion molecule comprising a selective inhibitory active region and a tissue metalloprotease inhibitor capable of binding to latent matrix metalloprotease-2 and use thereof.
  • Matrix metalloproteases are proteolytic enzymes having high degrading activity for extracellular matrix proteins, and are thought to support cell migration when cancer invades and metastasizes (Non-patent Document 1).
  • MMP-2 promotes angiogenesis in cancer tissues (Non-patent Document 2). Therefore, MMPs are the preferred target molecules for the development of cancer metastasis inhibitors and cancer growth inhibitors.
  • MMP inhibitors based on hydroxamic acid derivatives have been developed mainly by pharmaceutical companies. It was.
  • MMPs inhibitors that have been developed so far inhibit MMPs other than the target MMP in vivo and exhibit unexpected side effects due to their low specificity. For this reason, most pharmaceutical companies are now withdrawing from MMPs inhibitor development. In addition, some MMPs suppress cancer invasion and metastasis. When all MMPs are inhibited by inhibitors with low specificity, the effect of suppressing the target MMP activity is offset. Even the possibility of promoting cancer metastasis has been shown.
  • An object of the present invention is to provide a substance capable of specifically inhibiting MMP-2.
  • APP-IP ISYGNDALMP sequence
  • MMP-2 ⁇ -amyloid precursor protein
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a fusion molecule comprising a matrix metalloproteinase-2 selective inhibitory active region of a ⁇ -amyloid precursor protein molecule and a tissue metalloprotease inhibitor capable of binding to latent matrix metalloproteinase-2.
  • a transformant comprising the vector according to (5).
  • a pharmaceutical composition comprising the fusion molecule according to (1).
  • a cancer metastasis and / or angiogenesis inhibitor comprising the fusion molecule according to (1).
  • a therapeutic and / or prophylactic agent for cardiovascular disease comprising the fusion molecule according to (1).
  • the therapeutic and / or prophylactic agent according to (10), wherein the cardiovascular disease is selected from the group consisting of myocardial infarction, arteriosclerosis and hypertrophic cardiomyopathy.
  • a matrix metalloproteinase-2 inhibitor containing the fusion molecule according to (1) (12) A matrix metalloproteinase-2 inhibitor containing the fusion molecule according to (1). (123) A method for suppressing cancer metastasis and / or angiogenesis, comprising administering the fusion molecule according to (1). (14) A method for treating and / or preventing a circulatory system disease, comprising administering the fusion molecule according to (1). (15) A method for inhibiting matrix metalloproteinase-2, comprising using the fusion molecule according to (1). (16) The fusion molecule according to (1) for use as a medicament. (17) The fusion molecule according to (1) for use in suppressing cancer metastasis and / or angiogenesis.
  • the fusion protein of the present invention is a highly specific MMP-2 inhibitor, so this inhibitor has very few side effects and is an effective cancer metastasis inhibitor and blood vessel. There is a high possibility that it can be used as a newborn inhibitor.
  • the fusion protein of the present invention is an MMP-2 inhibitor with high affinity and high specificity.
  • the present invention relates to a matrix metalloproteinase-2 selective inhibitory active region (APP-IP) of a ⁇ -amyloid precursor protein molecule and a tissue metalloprotease capable of binding to latent matrix metalloproteinase-2 (latent MMP-2) Fusion molecules comprising an inhibitor (TIMP) are provided.
  • APP-IP matrix metalloproteinase-2 selective inhibitory active region
  • latent MMP-2 tissue metalloprotease capable of binding to latent matrix metalloproteinase-2
  • APP-IP is a partial amino acid sequence (ISYGNDALMP sequence) in the ⁇ -amyloid precursor protein (APP) molecule, and MMP-2 has selective inhibitor activity (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. (16, April 18, pp. 14020-14028,282003).
  • This APP-IP inhibits MMP-2 activity in a different inhibition mode than conventional hydroxamic acid MMPs inhibitors and natural inhibitor proteins TIMPs.
  • hydroxamic acid MMPs inhibitors and TIMPs interact in the same N-terminal-C terminal orientation as the substrate peptide, but APP-IP interacts with this N-terminal-C. It interacts so that the terminal orientation is reversed (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 283, No. 15, April 11, pp. 10068-10078, 2008).
  • the organism derived from APP-IP is preferably a human, but is not limited to a human and may be other mammals (mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, horse, sheep, monkey, etc.).
  • Human MMP-2 is biosynthesized intracellularly and then secreted to the outside of the cell. Immediately after secretion, it consists of 631 amino acid residues and is called a “propeptide region” on the N-terminal side in the molecule. Has an intramolecular inhibitor region consisting of amino acid residues. This type of MMP-2 is called "latent type”. Latent MMP-2 has no enzymatic activity due to the presence of the propeptide region. In addition, inhibitors such as TIMPs cannot bind to the catalytic active site of latent MMP-2.
  • the intramolecular inhibitor is peeled off and has enzymatic activity.
  • a type consisting of 551 amino acid residues from which 80 amino acid residues on the N-terminal side of latent MMP-2 have been removed is referred to as active MMP-2.
  • TIMP-2, 3 and 4 tissue metalloprotease inhibitors 2, 3, 4
  • the C-terminal region of TIMP-2, 3 and 4 can bind to the hemopexin-like region of MMP-2.
  • Tissue metalloprotease inhibitor 2 (TIMP-2) is a physiological protein inhibitor against MMPs and has inhibitory activity against almost all MMPs (Murphy, G., and Nagase, H. (2006) Cardiovasc. Res) . 69, 562-573).
  • TIMP-2 promotes activation of latent MMP-2 catalyzed by cell membrane-bound type-1 MMP (MT1-MMP).
  • MT1-MMP cell membrane-bound type-1 MMP
  • the mechanism for promoting activation of latent MMP-2 by TIMP-2 is first concentrated on the cell membrane while latent MMP-2 forms a trimolecular complex with TIMP-2 and MT1-MMP.
  • the N-terminal region which is the inhibitor active site of TIMP-2, binds to the active site of MT1-MMP, and latent MMP- is bound to the C-terminal region which is not the inhibitor active site of TIMP-2.
  • Two hemopexin-like regions are bound.
  • MT1-MMP molecules that are not bound to TIMP-2 on the same cell membrane are activated by limited degradation of latent MMP-2 concentrated on the cell membrane (Strongin, A. Y., Collier, I. , Bannikov, G., Marmer B. L., Grant, G. A., and Goldberg, G. I. (1995) J. Biol. Chem. 270, 5331-5338).
  • TIMP-2 nucleotide sequence (registration number; NM003255.4 database; NCBI) (SEQ ID NO: 3) Amino acid of TIMP-2 (registration number; NP003246.1 database; NCBI) (SEQ ID NO: 4)
  • the amino acid sequence and base sequence of human TIMP-2 are shown in SEQ ID NOs: 4 and 3, respectively.
  • TIMP-2 is biosynthesized in the cell, then the signal peptide is cleaved and secreted outside the cell (this becomes an active mature form), so Met is present at the N-terminus immediately after biosynthesis. After the secretion, the 27th Cys is number 1. The numbering of amino acid residues of TIMP-2 is usually based on the mature type.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 contains a signal peptide (positions 1 to 26) at the N-terminus.
  • SEQ ID NO: 3 is the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Tissue metalloprotease inhibitors 3 and 4 are physiological protein inhibitors for MMPs as well as TIMP-2, and have inhibitory activity against almost all MMPs.
  • TIMP-3 also inhibits the activity of metalloproteases belonging to families other than MMPs such as ADAM10, ADAM12, ADAM17 and ADAM-TS1, ADAM-TS4, and ADAM-TS5.
  • TIMP-3 and TIMP-4 can bind to regions other than the catalytically active site of MMP-2 in the same manner as TIMP-2 (Murphy, G., and Nagase, H. (2006) Cardiovasc. Res. 69, 562-573).
  • TIMP-3 nucleotide sequence (registration number; NM_000362.4 database; NCBI) (SEQ ID NO: 10) TIMP-3 amino acid sequence (registration number; NP_000353.1 database; NCBI) (SEQ ID NO: 11) TIMP-4 nucleotide sequence (registration number; NM_003256.2 database: NCBI) (SEQ ID NO: 12) TIMP-4 amino acid sequence (registration number; NP_003247.1 database; NCBI) (SEQ ID NO: 13)
  • the amino acid sequence and base sequence of human TIMP-3 are shown in SEQ ID NOs: 11 and 10, respectively.
  • TIMP-3 Since TIMP-3 is biosynthesized in the cell, the signal peptide is cleaved and secreted outside the cell (this becomes an active mature form), so Met is present at the N-terminus immediately after biosynthesis. After secretion, the 24th Cys is number one. The numbering of amino acid residues in TIMP-3 is usually based on the mature form.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 contains a signal peptide (positions 1 to 23) at the N-terminus.
  • SEQ ID NO: 10 is the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence and base sequence of human TIMP-4 are shown in SEQ ID NOs: 13 and 12, respectively. After TIMP-4 is biosynthesized in the cell, the signal peptide is cleaved and secreted outside the cell (this becomes an active mature form), but Met is present at the N-terminus immediately after biosynthesis. After the secretion, the 30th Cys is number one. The numbering of amino acid residues of TIMP-4 is usually based on the mature type.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 contains a signal peptide (positions 1 to 29) at the N-terminus.
  • SEQ ID NO: 12 is the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • TIMP-2, 3 and 4 are derived.
  • the organism from which TIMP-2, 3 and 4 are derived is preferably human, but is not limited to humans, and other mammals (mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, horse, sheep, monkey, etc.) May be.
  • 1 to 10 preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3 amino acids may be added to the N-terminal and / or C-terminal of APP-IP.
  • Such amino acid addition prevents the signal peptidase from being cleaved within the APP-IP sequence by adding an N-terminal amino acid during biosynthesis of the fusion protein using eukaryotic cells. It has the purpose of preventing the APP-IP moiety from being removed by the action of aminopeptidase.
  • insertion of a glycine residue on the C-terminal side introduces a flexible spacer between the TIMP body that can bind to latent MMP-2 and the APP-IP part, and TIMP that can bind to latent MMP-2.
  • the APP-IP moiety on the N-terminal side of TIMP that can bind to latent MMP-2 efficiently approaches the active site of MMP-2 It is made for the purpose.
  • amino acid or peptide to be added to the N-terminus of APP-IP AGG, AGGG, AAGG, AAGGG and the like are preferable, but not limited thereto.
  • amino acid or peptide added to the C-terminal of APP-IP GG, GGG, GGGG and the like are preferable, but not limited thereto.
  • TIMP that can bind to latent MMP-2 should be added to the C-terminal side of APP-IP.
  • the fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 is complementary to the MMP-2 binding site of TIMP that can bind to latent MMP-2 and the MMP-2 selective inhibition site of APP-IP
  • the present inventor has revealed that it can be an MMP-2 inhibitor with high affinity and high specificity by being utilized in an effective manner (see Examples described later).
  • Catalytic activity of MMP-2 and its inhibitory effect on its activity are in accordance with the past literature (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003) It is possible to measure using a substrate.
  • the amino acid sequence of an example of a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 (a fusion protein of APP-IP and TIMP-2 prepared in the examples described later) is shown in SEQ ID NO: 6. .
  • This amino acid sequence has a TIMP-2 signal sequence (positions 1 to 26) at the N-terminus.
  • the amino acid sequence of AAGG is added to the N-terminus of APP-IP and GGG is added to the C-terminus.
  • the signal sequence positions 1 to 26
  • the mature amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the “fusion molecule of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2” of the present invention includes not only the mature form but also those having a signal sequence.
  • Mutants that retain the function of a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 (for example, in the amino acid sequence of a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2) It consists of an amino acid sequence in which one or several (usually within 50, preferably within 10) amino acids have been deleted, substituted or added, and APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 Proteins having the same biological activity as fusion proteins) are also encompassed by the present invention. Examples of the biological activity of the fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 include MMP-2 inhibitor activity.
  • a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 can be produced by a known method. For example, DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 is obtained, and the resulting DNA is incorporated into an appropriate expression vector, introduced into an appropriate host, and transformed.
  • a fusion protein can be produced by culturing the prepared host and producing it as a recombinant protein (for example, Satoshi Saigo and Yoko Sano, CURRENT PROTOCOLS Compact Edition, Molecular Biology Experiment Protocol, I, II, III, Maruzen Co., Ltd .: See original, Ausubel, FM, etc., Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • a recombinant protein for example, Satoshi Saigo and Yoko Sano, CURRENT PROTOCOLS Compact Edition, Molecular Biology Experiment Protocol, I, II, III, Maruzen Co., Ltd .: See original, Ausubel, FM, etc., Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • the fusion protein of the present invention can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the present invention provides DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2.
  • the isolated DNA encoding the fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 is a nucleotide that encodes the fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2. Any material containing a sequence may be used.
  • DNA encoding the fusion protein comprising the DNA represented by the base sequence of SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (amino acid sequence of the fusion protein of human-derived APP-IP and TIMP-2) (for example, TIMP (for example, TIMP-2) that hybridizes with DNA complementary to the DNA (SEQ ID NO: 5) under stringent conditions and can bind to APP-IP and latent MMP-2 And a DNA encoding a protein having the same biological activity as the fusion protein.
  • the biological activity of the fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 include MMP-2 inhibitor activity.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the DNA encoding the fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is complementary to DNA encoding the fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • Hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of the nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming that the Tm drops by 1 ° C. due to a 1% mismatch, the temperature of the final wash of the hybridization reaction must be lowered.
  • the final washing temperature must be lowered by 5 ° C.
  • the Tm will vary between 0.5 and 1.5 ° C.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x °C SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature.
  • An example of moderately stringent conditions is a wash in 3x SSC at 42 ° C.
  • the salt concentration or temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid.
  • DNA encoding the fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 a DNA represented by the base sequence of SEQ ID NO: 5 can be exemplified.
  • An isolated DNA encoding a fusion protein of APP-IP of the present invention and TIMP (for example, TIMP-2) capable of binding to latent MMP-2 can be produced, for example, as follows. .
  • the DNA encoding human TIMP-2 is cleaved at the restriction enzyme sites Eco52 I and Pst ⁇ ⁇ I contained in the base sequence (SEQ ID NO: 3), and then a pair of complementary enzyme sites between the two restriction enzyme sites.
  • Synthetic DNA strand (sense side: 5'-GGCCGACGCCGCCGCAGGAGGAATTAGTTATGGTAATGATGCATTAATGCCAGGAGGAGGCTGCA-3 '(SEQ ID NO: 8) and antisense side: 5'-GCCTCCTCCTGGCATTAATGCATCATTACCATAACTAATTCCTCCTGCGGCGGCGTC-3' (SEQ ID NO: 9) And then inserted into E. coli and cloned.
  • DNA encoding a fusion protein variant of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 is obtained by subjecting the desired region of the fusion protein coding region to point mutagenesis. It can be produced by mutating. The coding region of the mutated fusion protein is amplified by PCR. The obtained PCR product is DNA encoding a mutant of a fusion protein of APP-IP and TIMP (for example, TIMP-2) capable of binding to latent MMP-2.
  • the present invention provides a vector containing DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2.
  • a recombinant vector containing a DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 can be obtained by a known method (for example, Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)) by inserting DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 into an appropriate expression vector.
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pGACAG
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • Bacteriophages such as phages
  • animal viruses such as retroviruses, adenoviruses, and vaccinia viruses
  • insect pathogenic viruses such as baculoviruses
  • a promoter, enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin, etc. may be added to the expression vector.
  • the expression vector may be a fusion protein expression vector.
  • fusion protein expression vectors are commercially available: pGEX series (Amersham Pharmacia Biotech), pET CBD Fusion System 34b-38b (Novagen), pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b (Novagen), pET GST Fusion System 41 and 42 (Novagen).
  • a transformant can be obtained by introducing into a host a recombinant vector containing DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2.
  • the present invention also provides a transformant comprising a recombinant vector containing DNA encoding a fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2.
  • Hosts include bacterial cells (eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus, etc.), insect cells (eg, S2 cells, Sf cells, etc.), animal cells (eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.), plant cells and the like.
  • bacterial cells eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus, etc.
  • insect cells eg, S2 cells, Sf cells, etc.
  • animal cells eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.
  • the transformant can be cultured in a medium, and a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 can be collected from the culture.
  • a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 can be collected from the culture.
  • the fusion protein is secreted into the medium, the medium is recovered, the fusion protein is separated from the medium and purified.
  • the fusion protein is produced in the transformed cell, the cell may be lysed, and the fusion protein may be separated from the lysate and purified.
  • the tag fusion protein is cleaved by treating with FactorXa or enzyme (enterokinase) after separation and purification of the tagged fusion protein A fusion protein can be obtained.
  • Separation and purification of the fusion protein can be performed by known methods.
  • Known separation and purification methods include methods that utilize differences in solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method utilizing difference method utilizing charge difference such as ion exchange chromatography, method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, method utilizing hydrophobic difference such as reverse phase high performance liquid chromatography
  • a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 is used for cancer metastasis and / or angiogenesis inhibitors, cardiovascular diseases (eg, myocardial infarction, arteriosclerosis, hypertrophic cardiomyopathy, etc.) It can be used as a medicine such as a therapeutic and / or prophylactic agent.
  • a fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2 can be used in vivo or in vitro as a matrix metalloproteinase-2 inhibitor for pharmaceutical or reagent use.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition comprising a fusion protein of APP-IP and TIMP capable of binding to latent MMP-2, a cancer metastasis and / or angiogenesis inhibitor, a therapeutic and / or prophylactic agent for cardiovascular disease, Also provided are matrix metalloprotease-2 inhibitors.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase-2
  • MMP-2 may be involved not only in cancer invasion / metastasis and angiogenesis in cancer tissues, but also in cardiovascular diseases such as acute myocardial infarction. Therefore, a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 can be applied as a therapeutic agent for these diseases involving MMP-2.
  • APP-IP and TIMP-binding protein capable of binding to latent MMP-2 are used to treat cancer metastasis and / or angiogenesis inhibitors, cardiovascular diseases (eg, myocardial infarction, arteriosclerosis, hypertrophic cardiomyopathy, etc.)
  • cardiovascular diseases eg, myocardial infarction, arteriosclerosis, hypertrophic cardiomyopathy, etc.
  • a fusion protein of APP-IP and TIMP that can bind to latent MMP-2 alone, or a pharmacologically acceptable carrier, diluent or supplement.
  • the dosage form it can be administered orally or parenterally to mammals (eg, humans, rabbits, dogs, cats, rats, mice) as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., but, for example, when used as a cancer metastasis and / or angiogenesis inhibitor, it can bind to APP-IP and latent MMP-2.
  • other parenteral administration for example, nasal administration
  • oral administration an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition can be produced by a conventional method, and may contain a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate.
  • compositions for parenteral administration include injections and suppositories, and injections include dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, and intravenous injections. It is good to be.
  • injections are prepared by a conventional method, that is, by dissolving, suspending or emulsifying the fusion protein of the present invention in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • Aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, Polyethylene glycol), nonionic surfactants (for example, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct-of-hydrogenated-castor-oil)) and the like may be used in combination.
  • suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, Polyethylene glycol), nonionic surfactants (for example, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct-of-hydrogenated-castor-oil)) and the like may be used in combination.
  • suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, Polyethylene glycol), nonionic surfactants
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition may be prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 0.01 to 1 mg of APP-IP and latent MMP for each dosage unit form It preferably contains a fusion protein with TIMP that can bind to -2.
  • the content of the active ingredient in the preparation of the dosage unit varies depending on the kind of the preparation, but is usually 1 to 100% by weight, preferably 50 to 100% by weight.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition may contain other active ingredients as long as an undesirable interaction is not caused by the combination of APP-IP and a fusion protein of TIMP that can bind to latent MMP-2.
  • Example 1 Method for producing APP-IP-TIMP-2 fusion protein: DNA encoding human TIMP-2 is cleaved at restriction enzyme sites Eco52 I and Pst I contained in the base sequence (SEQ ID NO: 3), A pair of complementary synthetic DNA strands (sense side: 5'-GGCCGACGCCGCCGCAGGAGGAATTAGTTATGGTAATGATGCATTAATGCCAGGAGGAGGCTGCA-3 '(sequence number 8) and antisense side: 5'-GCCTCCTCCTGGCATTAATGCATCATTACCCTATAACTAATTCCTCCTGCGGCGGCGTC-3' sequence between two restriction enzyme sites The DNA that was double-stranded by annealing was inserted using DNA ligase to prepare DNA encoding the APP-IP-TIMP-2 fusion protein.
  • the DNA encoding this protein is used in the animal cell expression vector pcDNA3.1 / Zeo (-) (Invitrogen) or E. coli expression vector pFLAG-CTC (Sigma), respectively. And inserted.
  • APP-IP-TIMP-2 fusion protein was obtained by transforming E. coli DH5 ⁇ strain transformed with the above vector (APP-IP-TIMP-2-pFLAG-CTC) at 37 ° C in the presence of 1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopylanoside. By culturing in C for 5 hours, the cells were expressed as inclusion bodies in the cells. The cells were crushed by ultrasonic treatment, and the inclusion bodies were collected by centrifugation.
  • APP-IP-TIMP-2 fusion protein recovered as inclusion bodies is dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 6 M guanidine hydrochloride, 20 mM dithiothreitol, 5 mM EDTA, and insolubles are removed by centrifugation. , Rapidly diffuse in 100 volumes of refolding buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M arginine, 5 mM reduced glutathione, 1 mM oxidized glutathione, 5 mM EDTA), then 4 ° C Incubate for 48 hours to form conformations and intramolecular disulfide bonds. After arginine was removed from this sample by dialysis, APP-IP-TIMP-2 fusion protein in which an intramolecular disulfide bond was formed was isolated and purified using reverse phase HPLC.
  • MMP-2, MMP-7, MMP-9 and MT1-MMP catalytic domain synthetic peptide substrate inhibitory effect of APP-IP-TIMP-2 fusion protein on the hydrolytic activity of MMP-2 was strongly inhibited by the fusion protein, and its IC 50 value (the concentration of inhibitor required to inhibit activity by 50%) was about 0.4 nM.
  • the activity of MMP-2 was almost completely inhibited in the presence of 2 nM APP-IP-TIMP-2.
  • the activity of the MT1-MMP catalytic domain is maintained at about 75% in the presence of 400 nM APP-IP-TIMP-2, and the inhibitory effect of APP-IP-TIMP-2 on MT1-MMP is MMP-2 It was found to be 1/1000 or less compared to the inhibitory effect on On the other hand, from past literature (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp.
  • TIMP-2 has high inhibitory activity against both MMP-2 and MMP-9, and it has been reported that the respective inhibition constants are 7.2 nM and 43 nM (Olson, MW, Gervasi, DC , Mobashery, S., and Fridman, R. (1997) J. Biol. Chem.
  • APP-IP-TIMP-2 did not inhibit MMP-9 at a concentration of 400 nM
  • APP-IP-TIMP-2 did not inhibit MMP-9 at a concentration of 400 nM
  • the addition of APP-IP to the N-terminus of TIMP-2 completely abolished the MMPs inhibitor activity inherent to TIMP-2.
  • This result shows that it is important for the inhibitory activity that the ⁇ -amino group of N-terminal Cys1 of TIMP-2 is coordinated to the zinc ion at the active center of MMP (Fernandez-Catalan, C., Bode, W. , Huber, R., Turk, D., Calvete, JJ, Lichte, A., Tschesche, H., and Maskos, K. (1998) EMBO J.
  • MMPs are the preferred target molecules for developing cancer metastasis inhibitors and cancer growth inhibitors.
  • MMP inhibitors based on hydroxamic acid derivatives have been developed mainly by pharmaceutical companies.
  • MMPs inhibitors that have been developed in the past have been found to inhibit MMPs other than the target MMP in vivo and exhibit unexpected side effects due to their low specificity.
  • some MMPs suppress cancer invasion and metastasis.
  • the effect of suppressing the target MMP activity is offset. Even the possibility of promoting cancer metastasis has been shown (Overall, C. M., and Kleifeld, O. (2006) Nat. Rev. Cancer 6, 227-239).
  • APP-IP-TIMP-2 which is highly specific for MMP-2, is highly likely to be a cancer metastasis inhibitor or cancer growth inhibitor with very few side effects.
  • analysis results using knockout mice have reported that MMP-2 deficient mice do not show any apparent damage (Itoh, T., Ikeda, T., Gomi, H., Nakao, S., Suzuki, T., and Itohara, S. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22389-22392)
  • angiogenesis in cancer tissues is markedly suppressed in MMP-2 deficient mice There is a report (Ito, Ttoet al. (1998) Cancer Res. 58, 1048-1051).
  • MMP-2 deficient mice have suppressed cardiac rupture after acute myocardial infarction (Matsumura, S., Iwanaga, S., Mochizuki, S., Okamoto, H., Ogawa, S., and Okada , Y. (2005) J Clin Invest. 115,. 599-609.) And suppression of the development of cardiac hypertrophy induced by blood pressure (Matsusaka, H., Ide, T., Matsushima, S ., Ikeuchi, M.,.
  • APP-IP-TIMP-2 fusion protein circulates It can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for systemic diseases.
  • the fusion protein of the present invention can be used as an MMP-2 inhibitor with high affinity and high specificity.
  • MMP-2 has been suggested to be involved not only in cancer invasion / metastasis and angiogenesis in cancer tissues, but also in cardiovascular diseases such as acute myocardial infarction. Therefore, the fusion protein of the present invention can also be applied as a therapeutic agent for these diseases involving MMP-2.
  • this fusion protein can be applied as a reagent for basic research such as analysis of physiological functions of MMP-2.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of DNA encoding human APP-IP (region containing residues 586-595 of APP 770 ).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human APP-IP (region containing residues 586-595 of APP 770 ).
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human TIMP-2. This sequence is the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (the amino acid sequence of human TIMP-2 having a signal peptide (positions 1 to 26) at the N-terminus).
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of human TIMP-2. This sequence has a signal peptide (positions 1 to 26) at the N-terminus.
  • SEQ ID NO: 5 is a fusion protein of human APP-IP (region containing residues 586-595 of APP 770 ) and human TIMP-2 (prepared in the example. Signal peptide (positions 1 to 26) at the N-terminus) And the amino acid sequence of AAGG is added to the N-terminus of APP-IP and the amino acid sequence of GGG is added to the C-terminus).
  • SEQ ID NO: 6 is a fusion protein of human APP-IP (region containing residues 586-595 of APP 770 ) and human TIMP-2 (prepared in the example. Signal peptide at positions 1 to 26) And the amino acid sequence of AAGG is added to the N-terminus of APP-IP and GGG is added to the C-terminus).
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of a fusion protein of human APP-IP (a region containing APP 770 residues 586-595) and human TIMP-2 (the signal peptide is cleaved).
  • ⁇ SEQ ID NO: 8> The base sequence of the synthetic DNA strand (sense side) used in the examples is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 9> The base sequence of the synthetic DNA strand (antisense side) used in the examples is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 10> SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human TIMP-3. This sequence is the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (the amino acid sequence of human TIMP-3 having a signal peptide (positions 1 to 23) at the N-terminus).
  • SEQ ID NO: 11> shows the amino acid sequence of human TIMP-3.
  • SEQ ID NO: 12 shows the nucleotide sequence of DNA encoding human TIMP-4.
  • This sequence is the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (the amino acid sequence of human TIMP-4 having a signal peptide (positions 1 to 29) at the N-terminus).
  • SEQ ID NO: 13> SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of human TIMP-4. This sequence has a signal peptide (positions 1 to 29) at the N-terminus.

Abstract

　MMP-2を特異的に阻害することができる物質を提供する。β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼに結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子。前記融合分子を含有する、医薬組成物、癌転移及び/又は血管新生抑制剤及び循環器系疾患の治療及び/又は予防薬、並びにマトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤。

Description

β－アミロイド前駆体蛋白質由来マトリックスメタロプロテアーゼ－２インヒビターペプチドと組織メタロプロテアーゼ阻害物質との融合タンパク質
　本発明は、β－アミロイド前駆体蛋白質由来マトリックスメタロプロテアーゼ－２インヒビターペプチドと組織メタロプロテアーゼ阻害物質との融合タンパク質及びその用途、より詳細には、β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ－２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子及びその用途に関する。
　マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）は細胞外マトリックスタンパク質に対し高い分解活性を持つタンパク質分解酵素であり、癌が浸潤・転移する際、細胞の移動を支えると考えられている（非特許文献１）。一方、ノックアウトマウスを用いた解析結果から、MMP-2が癌組織内での血管新生を促進することが示唆されている（非特許文献２）。したがって、MMPsは癌転移抑制剤や癌増殖抑制剤開発の上での恰好の標的分子であり、現在までにヒドロキサム酸誘導体をベースとした多くのMMPs阻害剤が製薬企業を中心に開発されて来た。
　従来開発されて来たMMPs阻害剤はその特異性の低さから、生体内で標的MMP以外のMMPsも阻害し、予想外の副作用を示すことが分かってきた。このため、現在、殆どの製薬企業がMMPs阻害剤開発から撤退している。加えて、MMPsの中には、癌の浸潤、転移を抑制するものがあり、特異性の低い阻害剤によって全てのMMPsが阻害されると、標的となるMMP活性抑制の効果が相殺された上、癌転移を助長する可能性さえ示されている。
Werb,Z. (1997) Cell 91, 439-442 Ito,T et al. (1998) Cancer Res. 58, 1048-1051
　本発明は、MMP-2を特異的に阻害することができる物質を提供することを目的とする。
　本発明者は、β-アミロイド前駆体蛋白質（APP）分子内の部分アミノ酸配列であるISYGNDALMP配列（APP-IP）にMMP-2に選択的なインヒビター活性があることを見出した(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003)。このAPP-IPは従来のヒドロキサム酸系MMPs阻害剤や天然のインヒビタータンパク質であるTIMPsとは異なる阻害様式でMMP-2活性を阻害する。APP-IPと、潜在型MMP-2に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質(図２)は、潜在型MMP-2に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質（例えば、TIMP-2）がもつMMP-2結合部位とAPP-IPのMMP-2選択的阻害部位が相補的に生かされることにより、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターとなることが明らかになった。本発明はこれらに知見に基づいて完成されたものである。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ－２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子。
（２）β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域のN末端及び/又はC末端に１～１０個のアミノ酸が付加されている（１）記載の融合分子。
（３）潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ－２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質が、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２、３及び４からなる群より選択される（１）又は（２）記載の融合分子。
（４）（１）記載の融合分子をコードするＤＮＡ。
（５）（４）記載のＤＮＡを含有するベクター。
（６）（５）記載のベクターを含む形質転換体。
（７）（６）記載の形質転換体を培養することを含む、融合分子の製造方法。
（８）（１）記載の融合分子を含有する医薬組成物。
（９）（１）記載の融合分子を含有する癌転移及び/又は血管新生抑制剤。
（１０）（１）記載の融合分子を含有する循環器系疾患の治療及び/又は予防薬。
（１１）循環器系疾患が、心筋梗塞、動脈硬化及び肥大型心筋症からなる群より選択される（１０）記載の治療及び/又は予防薬。
（１２）（１）記載の融合分子を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤。
（１３）（１）記載の融合分子を投与することを含む、癌転移及び/又は血管新生の抑制方法。
（１４）（１）記載の融合分子を投与することを含む、循環器系疾患の治療及び/又は予防方法。
（１５）（１）記載の融合分子を使用することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ－２の阻害方法。
（１６）医薬として使用するための、（１）記載の融合分子。
（１７）癌転移及び/又は血管新生の抑制に使用するための、（１）記載の融合分子。
（１８）癌転移及び/又は血管新生抑制剤を製造するための、（１）記載の融合分子の使用。
（１９）循環器系疾患の治療及び/又は予防に使用するための、（１）記載の融合分子。
（２０）循環器系疾患の治療及び/又は予防薬を製造するための、（１）記載の融合分子の使用。
（２１）マトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤として使用するための、（１）記載の融合分子。
（２２）マトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤を製造するための、（１）記載の融合分子の使用。
　従来の低特異性MMPs阻害剤とは異なり、本発明の融合タンパク質は極めて特異性の高いMMP-2インヒビターであることから、このインヒビターは副作用が極めて少なく、かつ、有効な癌転移抑制剤および血管新生抑制剤として利用できる可能性が高い。
　本発明の融合タンパク質は、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターである。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2008‐262415の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
APP-IP-TIMP-2融合タンパク質のMP-2とMMP-9に対する阻害活性を示すグラフである。 APP-IP-TIMP-2融合タンパク質設計の模式図である。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　本発明は、β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域(APP-IP)と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ－２(潜在型MMP-2)に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)とを含む融合分子を提供する。
　APP-IPは、β-アミロイド前駆体蛋白質（APP）分子内の部分アミノ酸配列(ISYGNDALMP配列)であり、MMP-2に選択的なインヒビター活性がある(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003)。このAPP-IPは従来のヒドロキサム酸系MMPs阻害剤や天然のインヒビタータンパク質であるTIMPsとは異なる阻害様式でMMP-2活性を阻害する。すなわち、MMP-2の基質認識部位と相互作用する際に、ヒドロキサム酸系MMPs阻害剤やTIMPsは基質ペプチドと同様のN末端-C末端配向で相互作用するがAPP-IPはこのN末端-C末端配向が逆向きになるように相互作用する（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 283, No. 15, April 11, pp. 10068-10078, 2008）。
　APP-IPの由来生物は、ヒトが好ましいが、ヒトに限らず、他の哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）であってもよい。
　ヒトMMP-2は細胞内で生合成された後、細胞外に分泌されるが、分泌直後は６３１アミノ酸残基からなっており、その分子内のN末端側に”プロペプチド領域”と呼ばれる８０アミノ酸残基からなる分子内インヒビター領域を持っている。MMP-2のこの型を”潜在型”とよぶ。潜在型MMP-2は、プロペプチド領域があるために酵素活性を持たない。また、TIMPsなどのインヒビターが潜在型MMP-2の触媒活性部位に結合することはできない。一方、潜在型MMP-2が他のプロテアーゼの働きなどでそのプロペプチド領域が切断、除去されると、分子内インヒビターが剥がれ、酵素活性を持つようになる。潜在型MMP-2のN末端側８０アミノ酸残基が除去された５５１アミノ酸残基からなる型を活性型MMP-2とよぶ。
　潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとしては、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２、３、４(TIMP-2, 3及び4)などを例示することができる。TIMP-2, 3及び4のC末端側領域は、MMP-2のヘモペキシン様領域と結合できる。
　組織メタロプロテアーゼ阻害物質２(TIMP-2)は、MMPsに対する生理的タンパク質インヒビターであり、ほぼ全てのMMPsに対し、阻害活性を持つ（Murphy, G., and Nagase, H. (2006) Cardiovasc. Res. 69, 562-573）。一方、TIMP-2は細胞膜結合型-1MMP (MT1-MMP)が触媒する潜在型MMP-2の活性化を促進する。TIMP-2による潜在型MMP-2の活性化促進の機序は、まず、潜在型MMP-2がTIMP-2およびMT1-MMPとともに３分子複合体を形成しつつ、細胞膜上に濃縮される。この３分子複合体の中では、MT1-MMPの活性部位にTIMP-2のインヒビター活性部位であるN末端領域が結合し、さらにTIMP-2のインヒビター活性部位ではないC末端領域に潜在型MMP-2のヘモペキシン様領域が結合している。次に、細胞膜上に濃縮された潜在型MMP-2を同じ細胞膜上のTIMP-2が結合していないMT1-MMP分子が限定分解により活性化する（Strongin, A. Y., Collier, I., Bannikov, G., Marmer B. L., Grant, G. A., and Goldberg, G. I. (1995) J. Biol. Chem. 270, 5331-5338）。
TIMP-2塩基配列（登録番号; NM003255.4　データベース; NCBI）(配列番号３)
TIMP-2のアミノ酸（登録番号; NP003246.1　データベース; NCBI）(配列番号４)
　ヒトTIMP-2のアミノ酸配列と塩基配列をそれぞれ配列番号４及び３に示す。TIMP-2は細胞内で生合成された後、シグナルペプチドが切断されて、細胞外に分泌される（これが活性を持つ成熟型となる）ので、生合成直後はMetがN末端に存在するが、分泌後は２７番目のCysが１番となる。TIMP-2のアミノ酸残基のナンバリングは成熟型を基とするのが通常となっている。配列番号４のアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチド（１～２６番目）を含む。配列番号３は、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
　組織メタロプロテアーゼ阻害物質３および４(TIMP-３およびTIMP-４)もTIMP-2と同様、MMPsに対する生理的タンパク質インヒビターであり、ほぼ全てのMMPsに対し、阻害活性を持つ。加えて、TIMP-3はADAM10、ADAM12、ADAM17およびADAM-TS1、ADAM-TS4、 ADAM-TS5など、MMPs以外のファミリーに属するメタロプロテアーゼの活性も阻害する。また、TIMP-３およびTIMP-４はTIMP-2と同様にMMP-2の触媒活性部位以外の領域に結合することができる（Murphy, G., and Nagase, H. (2006) Cardiovasc. Res. 69, 562-573）。
TIMP-3塩基配列（登録番号; NM_000362.4　データベース;NCBI）(配列番号１０)
TIMP-3アミノ酸配列（登録番号; NP_000353.1　データベース; NCBI）(配列番号１１)
TIMP-4 塩基配列（登録番号;NM_003256.2　データベース：NCBI）(配列番号１２)
TIMP-4アミノ酸配列（登録番号; NP_003247.1　データベース; NCBI）(配列番号１３)
　ヒトTIMP-3のアミノ酸配列と塩基配列をそれぞれ配列番号１１及び１０に示す。TIMP-3は細胞内で生合成された後、シグナルペプチドが切断されて、細胞外に分泌される（これが活性を持つ成熟型となる）ので、生合成直後はMetがN末端に存在するが、分泌後は２４番目のCysが１番となる。TIMP-3のアミノ酸残基のナンバリングは成熟型を基とするのが通常となっている。配列番号１１のアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチド（１～２３番目）を含む。配列番号１０は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
　ヒトTIMP-4のアミノ酸配列と塩基配列をそれぞれ配列番号１３及び１２に示す。TIMP-4は細胞内で生合成された後、シグナルペプチドが切断されて、細胞外に分泌される（これが活性を持つ成熟型となる）ので、生合成直後はMetがN末端に存在するが、分泌後は３０番目のCysが１番となる。TIMP-4のアミノ酸残基のナンバリングは成熟型を基とするのが通常となっている。配列番号１３のアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチド（１～２９番目）を含む。配列番号１２は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
　TIMP-2, 3及び4の由来生物は、ヒトが好ましいが、ヒトに限らず、他の哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）であってもよい。
　APP-IPのN末端及び/又はC末端には、１～１０個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が付加されていてもよい。このようなアミノ酸の付加は、真核細胞を用いて本融合タンパク質を生合成させる際、N末端側のアミノ酸の付加によりシグナルペプチダーゼがAPP-IP配列内で切断する事を防ぐほか、生体内でアミノペプチダーゼの作用によりAPP-IP部分が削られる事を防ぐ目的を持つ。一方、C末端側のグリシン残基の挿入は潜在型MMP-2に結合可能なTIMP本体とAPP-IP部分の間に柔軟性の高いスペーサーを導入し、潜在型MMP-2に結合可能なTIMPのC末端領域とMMP-2のヘモペキシン様領域との結合に伴って、潜在型MMP-2に結合可能なTIMPのN末端側にあるAPP-IP部分が効率よくMMP-2の活性部位に近づけることを目的としてなされる。
　APP-IPのN末端に付加するアミノ酸又はペプチドとしては、AGG、AGGG、AAGG、AAGGGなどが好ましいが、これらに限定されることはない。APP-IPのC末端に付加するアミノ酸又はペプチドとしては、GG、GGG、GGGGなどが好ましいが、これらに限定されることはない。
　潜在型MMP-2に結合可能なTIMPは、APP-IPのC末端側に付加するとよい。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は潜在型MMP-2に結合可能なTIMPがもつMMP-2結合部位とAPP-IPのMMP-2選択的阻害部位が相補的に生かされることにより、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターとなることを本発明者は明らかにした（後述の実施例参照）。MMP-2の触媒活性およびその活性に及ぼす阻害効果は過去の文献 (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003) に従い、蛍光消光系合成ペプチド基質を用いて、測定する事が可能である。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質の一例（後述の実施例で作製した、APP-IPとTIMP-2との融合タンパク質）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。このアミノ酸配列は、N末端にTIMP-2のシグナル配列(１～２６番目)を有する。また、APP-IPのN末端にAAGG、C末端にGGGのアミノ酸配列が付加されている。配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質が細胞内で生合成された後、シグナル配列(１～２６番目)が切断されて、細胞外に分泌される（これが、成熟型となる）。成熟型のアミノ酸配列を配列番号７に示す。本発明の「APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合分子」は、成熟型のみならず、シグナル配列が存在するものも含む。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質の機能を保持する変異体（例えば、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個（通常、50個以内、好ましくは10個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質と同様の生物学的活性を有するタンパク質）も本発明に包含される。APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質の生物学的活性とは、例えば、MMP-2インヒビター活性を挙げることができる。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP質との融合タンパク質は、公知の方法によって製造することができる。例えば、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、組換え蛋白質として生産させることにより、融合タンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと）。
　あるいはまた、本発明の融合タンパク質を公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
　さらに、本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡは、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。例えば、配列番号５の塩基配列で表されるＤＮＡ、配列番号６のアミノ酸配列（ヒト由来のAPP-IPとTIMP-2との融合タンパク質のアミノ酸配列）からなる融合タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号５の塩基配列で表されるＤＮＡ）に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質と同様の生物学的活性を有するタンパク質をコードするDNAなどを例示することができる。APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質の生物学的活性とは、例えば、MMP-2インヒビター活性を挙げることができる。
　配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするDNAに相補的なDNAの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5～1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.)  at Unit 2.10を参照されたい。
　配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするDNAとしては、配列番号５の塩基配列で表されるDNAを例示することができる。
　本発明のAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。ヒトTIMP-2をコードするDNAを、その塩基配列（配列番号３）の中に含まれる制限酵素部位Eco52 IおよびPst Iで切断した後、この２つの制限酵素部位の間に一対の相補的な合成ＤＮＡ鎖（センス側：5'-GGCCGACGCCGCCGCAGGAGGAATTAGTTATGGTAATGATGCATTAATGCCAGGAGGAGGCTGCA-3'（配列番号８）　およびアンチセンス側：5'-GCCTCCTCCTGGCATTAATGCATCATTACCATAACTAATTCCTCCTGCGGCGGCGTC-3'（配列番号９））をアニーリングにより２本鎖化したものをDNAリガーゼを用いて挿入し、これをE.coliに導入してクローン化することで作製することができる。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質の変異体をコードするＤＮＡは、融合タンパク質のコード領域の所望の部位を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させた融合タンパク質のコード領域をPCRによって増幅する。得られたPCR産物がAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質の変異体をコードするＤＮＡである。
　本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを提供する。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３， pGACAG）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
　発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
　また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを含む形質転換体も提供する。
　宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
　組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
　形質転換体を培地で培養し、培養物からAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を採取することができる。融合タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地から融合タンパク質を分離し、精製すればよい。融合タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物から融合タンパク質を分離し、精製すればよい。
　融合タンパク質がタグとの融合タンパク質の形態で発現される場合には、タグ付き融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、タグを切断し、目的とする融合タンパク質を得ることができる。
　融合タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は、癌転移及び/又は血管新生抑制剤、循環器系疾患（例えば、心筋梗塞、動脈硬化、肥大型心筋症など）の治療及び/又は予防薬などの医薬として利用可能である。また、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤として医薬又は試薬用途にin vivo又はin vitroで利用可能である。本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を含む医薬組成物、癌転移及び/又は血管新生抑制剤、循環器系疾患の治療及び/又は予防薬、並びにマトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤も提供する。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼ－２(MMP-2)に対する特異的阻害剤であるので、MMP-2の生理機能解析などの基礎研究用試薬として利用することが可能である。
　また、MMP-2は癌の浸潤・転移や癌組織における血管新生はもとより、急性心筋梗塞などの心臓血管系の疾患にも関わる可能性が示唆されている。したがって、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質はMMP-2が関わるこれらの疾患に対する治療薬としても応用できる。
　APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を癌転移及び/又は血管新生抑制剤、循環器系疾患（例えば、心筋梗塞、動脈硬化、肥大型心筋症など）の治療及び/又は予防薬などとして利用する場合には、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌転移及び/又は血管新生抑制剤として使用する場合には、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を１回量として0.001～10 mg/kg体重、好ましくは、0.01～1 mg/kg体重を、１週間に7回程度の頻度で、好ましくは1日に１回程度の頻度で、皮下注射（好ましくは、連続または隔日投与）するとよい。他の用途、他の非経口投与(例えば、経鼻投与)および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわち本発明の融合タンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO－50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
　上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられ、それぞれの投薬単位剤形当り通常0.01～1 mgのAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質が含有されていることが好ましい。投薬単位の製剤中における有効成分の含量は、製剤の種類により異なるが、通常1～100 重量％であり、好ましくは50～100 重量％である。
　上記の医薬組成物は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の有効成分を含有してもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　APP-IP-TIMP-2融合タンパク質の製造方法：ヒトTIMP-2をコードするDNAを、その塩基配列（配列番号３）の中に含まれる制限酵素部位Eco52 IおよびPst Iで切断した後、この２つの制限酵素部位の間に一対の相補的な合成ＤＮＡ鎖（センス側：5'-GGCCGACGCCGCCGCAGGAGGAATTAGTTATGGTAATGATGCATTAATGCCAGGAGGAGGCTGCA-3'（配列番号８）およびアンチセンス側：5'-GCCTCCTCCTGGCATTAATGCATCATTACCATAACTAATTCCTCCTGCGGCGGCGTC-3'（配列番号９））をアニーリングにより２本鎖化したものをDNAリガーゼを用いて挿入し、APP-IP-TIMP-2融合タンパク質をコードするDNAを作製した。このタンパク質をコードするDNAを動物細胞発現用ベクターであるpcDNA3.1/Zeo(-)(Invitrogen社)あるいはE. coli発現用ベクターであるpFLAG-CTC(Sigma社)にそれぞれのマルチクローニング部位を利用して挿入した。 APP-IP-TIMP-2融合タンパク質は上記ベクター(APP-IP-TIMP-2-pFLAG-CTC)で形質転換したE. coli　DH5α株を1mMのisopropyl-β-D-thiogalactopylanosideの存在下、37°Cで５時間培養することにより、菌体内に封入体として発現させた。この菌体を超音波処理で破砕し、遠心分離により封入体を回収した。封入体として回収したAPP-IP-TIMP-2融合タンパク質を6Mグアニジン塩酸塩、20 mM dithiothreitol、5 mM　EDTAを含む50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で溶解し、不溶物を遠心で取り除いた後、100倍容量のリフォールディング緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 M アルギニン、5 mM 還元型グルタチオン、1mM 酸化型グルタチオン、5 mM EDTA）中に迅速拡散させた後、4°Cで４８時間インキュベートすることにより、立体構造および分子内ジスルフィド結合を形成させた。この試料から透析によりアルギニンを除去した後、逆相HPLCを用いて分子内ジスルフィド結合が形成されたAPP-IP-TIMP-2融合タンパク質を単離・精製した。
　MMP-2、MMP-9、MMP-7およびMT1-MMP触媒ドメインに対する阻害活性の測定方法：MMP-2、MMP-7、MMP-9およびMT1-MMP触媒ドメインの触媒活性、およびそれらの活性に及ぼす阻害効果は過去の文献 (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003) に従い、蛍光消光系合成ペプチド基質を用いて測定した。
結果と考察
　MMP-2、MMP-7、MMP-9およびMT1-MMP触媒ドメインの合成ペプチド基質水解活性に及ぼすAPP-IP-TIMP-2融合タンパク質の阻害効果を調べた結果、MMP-2の活性が本融合タンパク質により強く阻害され、そのIC50値（活性を50 % 阻害するために要するインヒビターの濃度）は約0.4 nMであった。また、2 nMのAPP-IP-TIMP-2の存在下ではMMP-2の活性はほぼ完全に阻害された。これに対し、MMP-7およびMMP-9の活性は400 nM のAPP-IP-TIMP-2の存在下においてもほぼ100 %に保たれ、全く阻害されない事が判明した（図１）。また、MT1-MMP触媒ドメインの活性は400 nM APP-IP-TIMP-2の存在下、約75 %が保たれており、APP-IP-TIMP-2のMT1-MMPに対する阻害効果はMMP-2に対する阻害効果と比較して、1/1000以下であることが判明した。一方、過去の文献(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003)からMMP-2、MMP-7、MMP-9およびMT1-MMP触媒ドメインの合成ペプチド基質水解活性に及ぼすAPP-IPの阻害活性はそれぞれのIC50値が30 nM、 15 μM、20 μMおよび2 μMであることから、APP-IP-TIMP-2はAPP-IPに比べ、約75倍高いMMP-2阻害活性を持つのに対し、他のMMPsに対してはAPP-IP-TIMP-2とAPP-IPはほぼ同じ阻害効果を持つことが判明した。これは、APP-IP-TIMP-2融合タンパク質とMMP-2間の相互作用ではTIMP-2部分のC末端領域とMMP-2のヘモペキシン様領域との結合に補助される事により、APP-IP部分とMMP-2の触媒活性部位との相互作用が顕著に促進されたことを示唆している。また、TIMP-2はMMP-2とMMP-9の双方に対して高い阻害活性を持ち、それぞれの阻害定数が7.2 nMおよび 43 nMであることが報告されている（Olson, M. W., Gervasi, D. C., Mobashery, S., and Fridman, R. (1997) J. Biol. Chem. 272, 29975-29983）ことから、APP-IP-TIMP-2が400 nMの濃度でMMP-9を阻害しなかった事実は、 APP-IPをTIMP-2のN末端に付加した事により、TIMP-2が本来持っているMMPsインヒビター活性が完全に消失したことを示唆している。この結果は、TIMP-2のN末端Cys１のα-アミノ基がMMPの活性中心の亜鉛イオンに配位することがその阻害活性に重要であること（Fernandez-Catalan, C., Bode, W., Huber, R., Turk, D., Calvete, J. J., Lichte, A., Tschesche, H., and Maskos, K. (1998) EMBO J. 17, 5238-5248）、このα-アミノ基を化学修飾したり（Higashi, S., and Miyazaki, K. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10497-10504）、TIMP-2のN末端にアラニンを１残基付加する（Wingfield, P. T., Sax, J. K., Stahl, S. J., Kaufman, J., Palmer, I., Chung, V., Corcoran, M. L., Kleiner, D. E., and Stetler-Stevenson, W. G. (1999) J. Biol. Chem. 274,21362-21368）と、TIMP-2のMMPs阻害活性が消失するという過去の報告とも良く一致する。以上の結果から、TIMP-2のN末端にAPP-IPを付加すると、特異性の低いTIMP-2のMMPs阻害活性が失われるとともに、APP-IPとMMP-2触媒部位との相互作用が促進され、結果としてMMP-2に対し，高い親和性と特異性をもつ阻害剤ができることが判明した。
　MMPsは癌転移抑制剤や癌増殖抑制剤開発の上での恰好の標的分子であり、現在までにヒドロキサム酸誘導体をベースとした多くのMMPs阻害剤が製薬企業を中心に開発されて来た。しかしながら、従来開発されて来たMMPs阻害剤はその特異性の低さから、生体内で標的MMP以外のMMPsも阻害し、予想外の副作用を示すことが分かってきた。加えて、MMPsの中には、癌の浸潤、転移を抑制するものがあり、特異性の低い阻害剤によって全てのMMPsが阻害されると、標的となるMMP活性抑制の効果が相殺された上、癌転移を助長する可能性さえ示されている（Overall, C. M., and Kleifeld, O. (2006) Nat. Rev. Cancer 6, 227-239）。こうした事実を踏まえると、MMP-2に対して特異性の高いAPP-IP-TIMP-2は副作用の極めて少ない癌転移抑制剤や癌増殖抑制剤となり得る可能性が高い。また、ノックアウトマウスを用いた解析結果から、MMP-2を欠損させたマウスには明らかな障害が見られないことが報告されている（Itoh, T., Ikeda, T., Gomi, H., Nakao, S., Suzuki, T., and Itohara, S. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22389-22392）一方で、MMP-2欠損マウスでは癌組織内での血管新生が顕著に抑制されるとうい報告がある（Ito,T et al. (1998) Cancer Res. 58, 1048-1051）。これらの報告からもMMP-2を標的とした治療に副作用が少なく、癌組織内での血管新生抑制効果やそれに伴う癌の増殖抑制効果は大きいことが期待できる。さらに、MMP-2が欠損したマウスでは急性心筋梗塞後に起こる心破裂が抑制されること（Matsumura, S., Iwanaga, S., Mochizuki, S., Okamoto, H., Ogawa, S., and Okada, Y.(2005) J Clin Invest. 115, 599-609.）や血圧負荷により誘導される心肥大症の発症が抑制されることなどから（Matsusaka, H., Ide, T., Matsushima, S., Ikeuchi, M., Kubota, T., Sunagawa, K., Kinugawa, S., and Tsutsui, H. (2006) Hypertension. 47, 711-717）、APP-IP-TIMP-2融合タンパク質は循環器系疾患の治療及び/又は予防薬としても利用可能と考えられる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明の融合タンパク質は、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターとして利用できる。MMP-2は癌の浸潤・転移や癌組織における血管新生はもとより、急性心筋梗塞などの心臓血管系の疾患にも関わる可能性が示唆されている。したがって、本発明の融合タンパク質はMMP-2が関わるこれらの疾患に対する治療薬としても応用できる。また、これまで個々のMMPに対する特異的阻害剤は開発されていないことから、この融合タンパク質をMMP-2の生理機能解析などの基礎研究用試薬として応用することもできる。
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトTIMP-2をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。この配列は、配列番号４のアミノ酸配列（N末端にシグナルペプチド（１～２６番目）が存在するヒトTIMP-2のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトTIMP-2のアミノ酸配列を示す。この配列は、N末端にシグナルペプチド（１～２６番目）が存在する。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)とヒトTIMP-2との融合タンパク質（実施例で作製したもの。N末端にシグナルペプチド（１～２６番目）が存在し、かつAPP-IPのN末端にAAGG、C末端にGGGのアミノ酸配列が付加されている）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)とヒトTIMP-2との融合タンパク質（実施例で作製したもの。N末端にシグナルペプチド（１～２６番目）が存在し、かつAPP-IPのN末端にAAGG、C末端にGGGのアミノ酸配列が付加されている）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、成熟型（シグナルペプチドが切断されている）のヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)とヒトTIMP-2との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号８＞
実施例で用いた合成ＤＮＡ鎖（センス側）の塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
実施例で用いた合成ＤＮＡ鎖（アンチセンス側）の塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ヒトTIMP-3をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。この配列は、配列番号１１のアミノ酸配列（N末端にシグナルペプチド（１～２３番目）が存在するヒトTIMP-3のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、ヒトTIMP-3のアミノ酸配列を示す。この配列は、N末端にシグナルペプチド（１～２３番目）が存在する。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、ヒトTIMP-4をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。この配列は、配列番号１３のアミノ酸配列（N末端にシグナルペプチド（１～２９番目）が存在するヒトTIMP-4のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、ヒトTIMP-4のアミノ酸配列を示す。この配列は、N末端にシグナルペプチド（１～２９番目）が存在する。

Claims (22)

  1. β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ－２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子。
  2. β－アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ－２選択的阻害活性領域のN末端及び/又はC末端に１～１０個のアミノ酸が付加されている請求項１記載の融合分子。
  3. 潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ－２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質が、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２、３及び４からなる群より選択される請求項１又は２記載の融合分子。
  4. 請求項１記載の融合分子をコードするＤＮＡ。
  5. 請求項４記載のＤＮＡを含有するベクター。
  6. 請求項５記載のベクターを含む形質転換体。
  7. 請求項６記載の形質転換体を培養することを含む、融合分子の製造方法。
  8. 請求項１記載の融合分子を含有する医薬組成物。
  9. 請求項１記載の融合分子を含有する癌転移及び/又は血管新生抑制剤。
  10. 請求項１記載の融合分子を含有する循環器系疾患の治療及び/又は予防薬。
  11. 循環器系疾患が、心筋梗塞、動脈硬化及び肥大型心筋症からなる群より選択される請求項１０記載の治療及び/又は予防薬。
  12. 請求項１記載の融合分子を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤。
  13. 請求項１記載の融合分子を投与することを含む、癌転移及び/又は血管新生の抑制方法。
  14. 請求項１記載の融合分子を投与することを含む、循環器系疾患の治療及び/又は予防方法。
  15. 請求項１記載の融合分子を使用することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ－２の阻害方法。
  16. 医薬として使用するための、請求項１記載の融合分子。
  17. 癌転移及び/又は血管新生の抑制に使用するための、請求項１記載の融合分子。
  18. 癌転移及び/又は血管新生抑制剤を製造するための、請求項１記載の融合分子の使用。
  19. 循環器系疾患の治療及び/又は予防に使用するための、請求項１記載の融合分子。
  20. 循環器系疾患の治療及び/又は予防薬を製造するための、請求項１記載の融合分子の使用。
  21. マトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤として使用するための、請求項１記載の融合分子。
  22. マトリックスメタロプロテアーゼ－２阻害剤を製造するための、請求項１記載の融合分子の使用。
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