WO2012074116A1 - アロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域が均一なVα-Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング - Google Patents

アロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域が均一なVα-Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング Download PDF

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明彦 古関
渡会　浩志
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Definitions

  • the present invention uses allo NKT cells derived from cells in which the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the T cell antigen receptor (TCR) gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner.
  • TCR ⁇ ⁇ chain region of the T cell antigen receptor
  • TCR T cell antigen receptor
  • cancer advanced medicine using immune cells includes self-lymphocyte transfer therapy and cancer peptide vaccine therapy that activates patient lymphocytes outside the body and returns them to the patient's body, but results are still insufficient It is.
  • Adjuvant action is essential when antitumor effects are expected, but cancer cells, unlike pathogens, do not have adjuvant effects themselves, and normal immunotherapy does not provide sufficient therapeutic effects.
  • cancer cells unlike pathogens, do not have adjuvant effects themselves, and normal immunotherapy does not provide sufficient therapeutic effects.
  • cancer cells there are two types of cancer cells in cancer tissue: “cancer cells that express MHC molecules” and “cancer cells that have lost MHC molecules”. Cancer cannot be fundamentally treated unless cells are eliminated at the same time. There is also a need to develop treatments that can target any cancer, regardless of the type of cancer.
  • NKT cells natural killer T cells
  • NK cells natural killer T cells
  • ⁇ -GalCer synthetic glycolipid ⁇ -galactosylceramide
  • NKT cells are normal, they are present in a very small amount of 0.1% or less of peripheral blood lymphocytes, and in addition, NKT cell functions themselves may be reduced in cancer patients.
  • a technique for efficiently amplifying a sufficient number of NKT cells for treatment in vitro has not yet been established.
  • NKT cell immunotherapy treatment effect can be improved if a large amount of NKT cell clones can be obtained by re-differentiating and maturating the collected NKT cells after initializing, etc. Is done.
  • the present inventors succeeded in producing a large amount of NKT cells by differentiating ES cells transplanted with NKT cell nuclei into NKT cells in vitro (Patent Document 1).
  • NKT-iPS cells iPS cell characteristic properties
  • iPS-NKT cells functional mature NKT cells from the iPS cells
  • Non-patent Document 3 nuclear reprogramming factors
  • p53 inhibition It is a surprising finding that iPS cells could be established from NKT cells with only 4 factors because there is a report that (Non-patent Document 4) is required.
  • Increasing the number of transgenes or inhibiting p53, which is a tumor suppressor gene, is problematic in terms of safety, such as increasing the risk of tumorigenicity of cells differentiated from iPS cells. Their results expand the expectations of the availability of iPS cells for immune cell therapy.
  • graft-versus-host disease is known as one of complications in transplantation medicine. This is a collective term for symptoms caused by a donor (organ donor) organ attacking a recipient organ by an immune response.
  • GVHD occurs after various autologous organ transplants, but especially after hematopoietic stem cell transplantation (bone marrow transplantation) or after blood transfusion, in which immune tissues are directly transplanted.
  • hematopoietic stem cell transplantation bone marrow transplantation
  • blood transfusion in which immune tissues are directly transplanted.
  • lymphocytes are involved in the former and more immune functions are involved in the latter. ing.
  • NKT cells are a type of lymphocyte, and among the ⁇ T cells defined by cells expressing T cell antigen receptor ⁇ chain and ⁇ chain, T cell antigen receptor is human and ⁇ chain is V ⁇ 24-J ⁇ 18, ⁇ It is categorized into a subgroup characterized by expressing the chain V ⁇ 11, ⁇ chain V ⁇ 14-J ⁇ 18, and ⁇ chain V ⁇ 8 / 7/2 in mice, and includes CD4 positive and CD4 negative cells (non-patented) Reference 5). There have been reports that NKT cells on the recipient side have a suppressive effect on the development of GVHD (Non-Patent Documents 6 to 8).
  • Non-patent Document 9 On the other hand, regarding allo NKT cells derived from donors, in allograft experiments combined with other allolymphocyte cells, although there is a report that it works suppressively depending on conditions (Non-patent Document 9), only allo NKT cells were transplanted. There are no reports regarding whether or not GVHD develops. In addition, studies by the present inventors have revealed that gene expression is different between allo NKT cells that have been normally differentiated in vivo and allo NKT cells that have been differentiated from pluripotent stem cells in vitro (Non-patent Document 2). ), There is no report on the relationship between NKT cells differentiated from such pluripotent stem cells and GVHD.
  • the object of the present invention is to make the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor (TCR) gene derived from human NKT cells under a completely novel concept utilizing the characteristics of immune cell therapy specific to the NKT cell receptor.
  • TCR T cell antigen receptor
  • the present inventors have established a novel therapeutic strategy in which immune cells are used in the same manner as ordinary medicine.
  • Ordinary medicine is a foreign substance for the living body, and if it stays in the body for a long time, it is warped and adversely affects the living body. Therefore, it is desirable that it is rapidly excreted or metabolically decomposed outside the body after exerting a desired therapeutic effect.
  • transplanted cells unlike other transplantation treatments such as organ transplantation, transplanted cells are not necessarily transplanted after the immune cells are replenished and / or activated to attack target disease cells and exert their effects. There is no need to engraft and stay in the patient.
  • the point of attention of the present inventors is that if the allo-NKT cells whose MHC type is inconsistent with the recipient are transplanted, the transferred cells are rejected due to the alloimmune reaction, and therefore, they are caused by long-term retention of the transferred cells. It is possible to avoid the occurrence of possible side effects. In other words, the transferred NKT cells are eliminated from the body by the host immune system after a certain period of time due to the alloimmune reaction, so that they can be expected to exert their effects as a temporary drug without staying in the host for a long time. .
  • the present inventors established iPS cells from the NKT cells that have been established by the present inventors and have completed receptor gene reconstitution, and further obtained mature NKT cells from the iPS cells.
  • NKT cells were collected from individuals with mismatched recipient and MHC types, iPS cells were established, and further differentiated into mature NKT cells.
  • the cells were stimulated with ⁇ -GalCer, and the adjuvant effect and antitumor effect of the transferred cells were examined. A strong adjuvant effect and tumor growth inhibitory effect were observed. .
  • transplanted iPS-derived NKT cells remained in the recipient for a period sufficient to show a significant therapeutic effect, and were then rejected and eliminated by the recipient's immune system.
  • transplanted iPS-derived NKT cells remained in the recipient for a period sufficient to show a significant therapeutic effect, and were then rejected and eliminated by the recipient's immune system.
  • Recipients RAG-deficient mice, BALB / c background
  • NKT cells redifferentiated from iPS cells established from NKT cells in C57BL / 6 background in vitro.
  • GVHD developed in C57BL / 6 background allo CD4-positive helper T cells isolated from the spleen used as the target group, but allo NKT cells prepared by redifferentiation from iPS cells established from NKT cells. GVHD did not develop. According to this method, since it is not necessary to match the MHC between the donor and the recipient, it is easy to obtain a donor, and further, the problem of safety of iPS cell-derived NKT cells can be solved. In addition, it is safe because it does not involve GVHD associated with transplantation. Based on the above findings, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • [1] Contains NKT cells obtained by in vitro differentiation of cells in which the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner
  • An immunocytotherapeutic agent comprising the allogeneic individual in which the genotype of at least one of the MHC loci does not match that of the NKT cell.
  • [2] The cell according to [1] above, wherein the cell in which the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner is a pluripotent stem cell. Agent.
  • the pluripotent stem cell is an ES cell.
  • the ES cells are human ES cells.
  • an allogeneic individual whose genotype at at least one of the HLA loci does not match that of the human ES cell is to be administered.
  • the pluripotent stem cell is an iPS cell.
  • the iPS cells are human iPS cells.
  • the pluripotent stem cells are derived from NKT cells.
  • NKT cells are human NKT cells.
  • an allogeneic individual whose genotype at at least one of the HLA loci does not match that of the human NKT cell is an administration target.
  • HLA locus is HLA-A, HLA-B and HLA-C.
  • NKT cell receptor ligand is ⁇ -galactosylceramide.
  • NKT cells obtained by in vitro differentiation of cells in which the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner, Immune cell therapy for an individual comprising administering an effective amount to an allogeneic individual whose genotype of at least one of the MHC loci does not match the NKT cell.
  • the bank construction method according to [28] which includes the following steps (1) to (4): (1) determining the genotype of a particular HLA locus of the donor registrant; (2) collecting NKT cells from a donor registrant; (3) From the NKT cells, human cells in which the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner are established and established as necessary.
  • the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor gene established from a patient who requires administration of human NKT cells and a human NKT cell whose genotype does not match at least one HLA locus is NKT cell receptor specific Receiving a cell from the bank according to [28] above, or cells that have been reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in such a manner or the cell-derived NKT cells, (2) The cells were redistributed in which the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor gene established from human NKT cells in (1) was reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner.
  • An immune cell therapy comprising administering to the patient an effective amount of the human NKT cells obtained in (1) or (2) above.
  • the method described in [30] above further comprising administering to the patient an effective amount of NKT cell receptor ligand or a dendritic cell pulsed with an NKT cell receptor ligand.
  • the NKT cell receptor ligand is ⁇ -galactosylceramide.
  • the present invention is based on a completely new idea that a transplanted cell is used in a manner such that it disappears after it has existed in the body for a suitable period of time and exhibits a medicinal effect, like a normal medicine.
  • the transferred cells are eliminated by the host immune system.
  • iPS cells were established and maintained and amplified from human (donor) NKT cells whose A, B, and C loci do not completely match, and when used, the differentiation from iPS cells to NKT cells was induced. NKT cells are transplanted into the patient (recipient).
  • transplanted NKT cells have haplotypes of A, B, and C different from those of the recipient, it is expected that they will not be engrafted and are eliminated by the host immune system, and a sufficient adjuvant effect can be exhibited during that time.
  • NKT cells because the number of NKT cells has decreased, it is possible to carry out the treatment even for patients with advanced cancer and recurrent cancer that have not previously satisfied the entry criteria for adjuvant immunocytotherapy. It becomes. Since NKT cells are rejected by an alloimmune reaction even when transferred to normal allo individuals, immune cell therapy can be safely performed. NKT cells differentiated from cells in which the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor (TCR) gene has been reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner. Because it does not cause side effects caused by GVHD can be avoided. NKT cells are selectively induced from cells in which the TCR ⁇ chain region on the chromosome is uniformly reconstituted in a manner specific to NKT cells.
  • TCR T cell antigen receptor
  • the NKT cells derived from the cells are used for the immune cell therapy of the present invention, the possibility that normal allo-T cells are mixed can be avoided, and the risk that a serious GVH reaction occurs can be suppressed.
  • the immune cell therapy of the present invention it is not necessary to match the HLA of the donor and the recipient, so that the donor can be easily obtained. Therefore, the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of T cell antigen receptor (TCR) gene such as iPS cells derived from NKT cells provided by donors is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell specific manner.
  • the NKT cells can be stably supplied by banking the cells or the NKT cells derived from the cells.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of the TCR ⁇ locus of wild type and NKT cells. It is a figure which shows V ⁇ -J ⁇ reconstruction in NKT-iPS cells. It is a figure which shows the expression of the ES cell specific gene in a NKT-iPS cell. It is a figure which shows the correlation of a gene expression profile between NKT-iPS cell and NKT-ES cell or ES cell, and between NKT-iPS cell and a wild type spleen NKT cell. It is a figure which shows the similarity with a MEF origin iPS cell or an ES cell in the form of NKT-iPS cell and the expression of SSEA1 and Oct3 / 4 gene.
  • NKT-iPS cell clones 7a and 7g It is a figure which shows establishment of the iPS cell from a C57BL / 6 wild mouse spleen cell. It is a figure which shows preparation of the NKT clone mouse
  • NKT-iPS cell clones 7a and 7g It is a figure which shows the morphological observation of NKT-iPS cell clones 7a and 7g, and the expression of an ES cell marker. It is a figure which shows the DNA methylation analysis of NKT-iPS cell clones 7a and 7g. It is a figure which shows the offspring transmission of NKT-iPS cell clones 7a and 7g. It is a figure which shows the in vitro NKT cell differentiation-inducing method from NKT-iPS cell clones 7a and 7g. It is a figure which shows the expression of the cell surface marker of the cell differentiation-induced in the test tube from NKT-iPS cell clones 7a and 7g. It is a figure which shows the comprehensive gene expression correlation analysis of the cells 7a-dif.
  • the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner, and has the ability to self-proliferate and differentiate into NKT cells. It contains NKT cells obtained by inducing differentiation in vitro from cells having the ability (however, excluding NKT cells) as an active ingredient. Such cells are not particularly limited as long as the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner.
  • IPS cells established from existing NKT cells ie, the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner, and self-proliferating and pluripotent
  • iPS cells ES cell-like gene expression pattern (NKT-iPS cells), ⁇ -chain of NCR cell-specific TCR gene and pluripotent stem cells
  • NKT-iPS cells ES cell-like gene expression pattern
  • TCR ⁇ ⁇ -chain of NCR cell-specific TCR gene
  • pluripotent stem cells By inserting the gene so that the ⁇ chain can be expressed, the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner, or NKT cell receptor-specific.
  • NKT a pluripotent stem cell in which uniform V ⁇ -J ⁇ can be inserted into a specific region on the genome and expressed Pluripotent stem cells established from cells nuclear transfer embryo, established from NKT cells reconfiguration is completed, the cells (e.g., blood stem cells) with regeneration ability to at least NKT cells, and the like.
  • pluripotent stem cells can be cultured in vitro and are derived from all cells constituting the living body excluding the placenta (three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm)). A stem cell having the ability to differentiate into a tissue (pluripotency). Pluripotent stem cells include iPS cells, embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells) and the like.
  • mammalian cells are usually used.
  • mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, pets such as dogs and cats, humans, monkeys, Primates such as orangutans and chimpanzees.
  • the mammal is preferably a rodent (such as a mouse) or a primate (such as a human), and more preferably a mouse or a human.
  • an “iPS cell” is a cell that has artificially acquired differentiation pluripotency and self-replication ability by contacting a nuclear reprogramming factor with a somatic cell, and has a gene expression profile that is different from that of an ES cell.
  • pluripotency refers to a plurality of lineage hematopoietic / immune system cells such as NKT cells, T cells, B cells, erythrocytes, macrophages or precursor cells thereof, and one or more cells other than hematopoietic / immune systems. It means the ability to differentiate into lineage and is distinguished from pluripotency in hematopoietic stem cells and pluripotent progenitor cells.
  • “Self-replicating ability” means the ability of a cell to continue amplification while maintaining the above “pluripotency” in a specific environment (for example, conditions suitable for ES cell culture).
  • “the gene expression profile is similar to that of ES cells” means that the correlation coefficient r between the gene expression data group in the target cell and the gene expression data group in the ES cell is 0.9 or more.
  • Examples of ES cells to be compared include ES cells prepared from fertilized eggs of the same species, preferably from the same strain, ES cells prepared from NKT cell nuclear transfer embryos, and the like.
  • the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into a uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner, and has self-proliferative ability and differentiation pluripotency. It may be a cell having properties characteristic of iPS cells such as having an ES cell-like gene expression pattern.
  • the term “NKT cell receptor specific embodiment” will be described later.
  • the NKT-iPS cells of the present invention are reprogrammed to somatic cells such as NKT cells in which the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner. It can be established by contacting factors.
  • somatic cells such as NKT cells in which the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner. It can be established by contacting factors.
  • “NKT cell” is not particularly limited as long as one of the TCR ⁇ regions is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ , and is characterized by mature NKT cells (for example, NK1.1 + / CD3 ⁇ + ) As well as its progenitor cells (eg, cells characterized by CD4 + / CD8 + ).
  • NKT cells can be obtained from spleen, lymph nodes, peripheral blood, umbilical cord blood, etc.
  • mice it is preferable to collect from the spleen and lymph nodes where the proportion of NKT cells is high. It is desirable to prepare.
  • the NKT cell that can be used for the production of the NKT-iPS cell of the present invention may be derived from any animal species that can establish the NKT-iPS cell by contacting the NKT cell with a nuclear reprogramming factor.
  • specific examples include those derived from humans and mice, but human-derived NKT cells are preferred.
  • the human or mouse from which the NKT cells are collected is an individual who is the subject of immune cell therapy and an allogeneic individual in which at least one genotype of the major locus of MHC does not match, preferably all the genotypes. Allogeneic individuals whose types do not match.
  • the administered NKT cells are recognized by the recipient's immune system and eventually eliminated.
  • the MHC locus in the case of normal human organ transplantation, the match / mismatch of the three loci of HLA-A, HLA-B and HLA-C is a criterion for matching. Therefore, an individual whose at least one of these three loci is different from the recipient is usually selected as a donor.
  • the H-2K, H-2D and H-2L loci of the class I region can be mentioned as the main loci in the present invention.
  • At least one (preferably two, more preferably three) genotype of the above-mentioned three loci is used as an NKT cell derived from an individual different from the individual to be subjected to immunocytotherapy.
  • the administered NKT cells are eliminated by the recipient's alloimmune reaction due to mismatches in the MHC locus, so that they are expected to be eliminated after effectively exerting an effect such as an adjuvant effect. Is done.
  • NKT cells prepared by the above method from peripheral blood, umbilical cord blood, spleen, lymph nodes, etc. may be immediately contacted with a nuclear reprogramming factor to induce NKT-iPS cells, or cryopreserved by conventional methods Alternatively, NKT-iPS cells can be induced by thawing and culturing at the time of use and then contacting with a nuclear reprogramming factor.
  • NKT cells are immunocompetent cells that are thought to be functionally uniform, characterized by reconstitution of one of the TCR ⁇ regions into V ⁇ -J ⁇ (V ⁇ 24-J ⁇ 18 in humans and V ⁇ 14-J ⁇ 18 in mice). .
  • reconstitution into NKT-TCR is preserved.
  • the NKT-iPS cell of the present invention may be a somatic cell other than an NKT cell, theoretically from the iPS cell obtained from the somatic cell, from the ⁇ chain of the T cell antigen receptor gene.
  • the region can be established by selecting a region in which the region is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner and contacting the somatic cell with a nuclear reprogramming factor.
  • the frequency of NKT cell-specific receptors (Va24-Ja18) obtained by gene rearrangement is about 1/10 6 , inducing iPS cells directly from NKT cells produces NKT-iPS cells efficiently. It is a method to do.
  • the NKT cell receptor is a T cell receptor that is specifically expressed in NKT cells and specifically recognizes ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer) presented on CD1d.
  • the ⁇ chain of the NKT cell receptor is usually reconstituted into V ⁇ 24-J ⁇ 18 in humans and V ⁇ 14-J ⁇ 18 in mice. Therefore, reconstitution in an NKT cell receptor-specific manner is obtained when the VJ combination in the ⁇ chain region of the T cell antigen receptor is V ⁇ 24-J ⁇ 18 in humans and V ⁇ 14-J ⁇ 18 in mice. It means gene rearrangement of ⁇ chain region such that TCR ⁇ can constitute NKT cell receptor.
  • Such somatic cells can be prepared by a method known per se.
  • such a somatic cell is obtained by transplanting an NKT cell nucleus into an enucleated cell (eg, an oocyte) and subjecting it to a predetermined operation to produce an NKT cell cloned animal.
  • an enucleated cell eg, an oocyte
  • Somatic cells Production of cloned animals is described in, for example, WO2006 / 018998.
  • cloned humans cannot be produced, but it is theoretically possible to produce human cloned embryos by NKT cell nuclear transfer and induce differentiation into arbitrary somatic cells in vitro.
  • the “nuclear reprogramming factor” is a proteinous factor or a substance that can induce cells having differentiation pluripotency and self-renewal ability from somatic cells such as NKT cells. It may be composed of any substance such as a nucleic acid to be encoded (including a form incorporated in a vector) or a low molecular weight compound.
  • the nuclear reprogramming factor is a protein factor or a nucleic acid encoding the same, the following combinations are preferably exemplified (in the following, only the name of the protein factor is described).
  • (1) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc where Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • Klf4 can be replaced with Klf1, Klf2 or Klf5. Furthermore, c-Myc can be replaced with T58A (active mutant), N-Myc, or L-Myc.) (2) Oct3 / 4, Klf4, Sox2 (3) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc (4) Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28 (5) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28 (6) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, bFGF (7) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, SCF (8) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF (9) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
  • the present invention uses iPS-NKT cells redifferentiated from NKT-iPS cells for immunocytotherapy, among these combinations, a combination of three factors Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 is more preferable.
  • the present invention is also intended to disappear from the host body after a certain period of time without engrafting the transferred NKT cells, so that the NKT cells remain within the body within a period of time, such as tumorigenesis.
  • other reprogramming factors eg, c-Myc
  • 4 factors of Oct3 / 4, Klf4, 2Sox2 and c-Myc or N-Myc, or 5 factors with Lin28 or Nanog added thereto are also preferred as nuclear reprogramming factors.
  • NKT-iPS cells can be obtained only with the above-described nuclear reprogramming factors that are usually used for reprogramming fibroblasts and the like, and it has been reported in the case of T cells and B cells conventionally. It does not require the use of other factors. This can reduce the potential for tumorigenicity in cells and tissues induced to differentiate from NKT-iPS cells.
  • Mouse and human cDNA sequence information for each of the protein factors described above can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO62007 / 069666 (Nanog is described as “ECAT4” in the publication)
  • mouse and human cDNA sequence information of Lin28 refer to NCBI accession number NM_145833 and NM_024674, respectively
  • mouse and human cDNA sequence information of L-Myc refer to NCBI accession number NM_008506 and NM_001033081, respectively.
  • Those skilled in the art can easily isolate these cDNAs.
  • the obtained cDNA is inserted into an appropriate expression vector and introduced into a host cell, and the recombinant proteinous factor is obtained from the culture obtained by culturing the cell. Can be prepared by recovering.
  • the obtained cDNA is inserted into a viral vector, episomal vector, plasmid vector or the like to construct an expression vector, which is then used for the nuclear reprogramming step. Is done.
  • the nuclear reprogramming factor can be contacted with a somatic cell such as an NKT cell using a known method for introducing a protein into a cell.
  • a somatic cell such as an NKT cell
  • a method for introducing a protein into a cell examples include a method using a protein introduction reagent, a method using a protein introduction domain (PTD) or a cell-penetrating peptide (CPP) fusion protein, and a microinjection method.
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes), Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) and ProVectin (IMGENEX), and lipid-based Profect-1 (Targeting Systems) ), Penetrain Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on membrane-permeable peptides are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows.
  • Dilute the nuclear reprogramming factor in an appropriate solvent eg, PBS, HEPES, etc.
  • an appropriate solvent eg, PBS, HEPES, etc.
  • PTDs those using cell-passing domains of proteins such as Drosophila-derived AntP, HIV-derived TAT, and HSV-derived VP22 have been developed.
  • a fusion protein expression vector incorporating a nuclear reprogramming factor cDNA and a PTD sequence is prepared and recombinantly expressed, and the fusion protein is recovered and used for introduction.
  • Microinjection is a method in which a protein solution is placed in a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into a cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • the protein introduction operation can be performed any number of one or more times (for example, 1 to 10 times or 1 to 5 times), and preferably the introduction operation is performed 2 or more times (for example, 3 or 4 times). ) Can be done repeatedly. Examples of the interval when the introduction operation is repeated include 6 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • the nuclear reprogramming factor in the form of a nucleic acid encoding it rather than as a protein.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • the nucleic acid is double stranded DNA, in particular cDNA.
  • the cDNA of the nuclear reprogramming factor is inserted into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in somatic cells such as NKT cells as a host.
  • expression vectors examples include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai virus and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV). , PcDNAI / Neo) or the like.
  • the type of vector to be used can be appropriately selected according to the use of the obtained NKT-iPS cells.
  • adenovirus vectors, plasmid vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used.
  • Examples of the promoter used in the expression vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molone murine leukemia virus) LTR. HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used. Of these, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may optionally contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, an SV40 replication origin, and the like.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene and a neomycin resistance gene.
  • An expression vector containing a nucleic acid that is a nuclear reprogramming factor can be introduced into a cell by a technique known per se, depending on the type of the vector.
  • the vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • the vector in the case of a plasmid vector, the vector can be introduced into cells using lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc. .
  • the nuclear reprogramming factor is a low molecular weight compound
  • contact of the compound with somatic cells such as NKT cells can be accomplished by dissolving the compound in an aqueous or non-aqueous solvent at an appropriate concentration and isolating NKT isolated from humans or mice.
  • somatic cells such as cells (eg IL-2, IL-7, SCF, cytokines such as Flt3 ligand, minimal essential medium (MEM) containing about 5-20% fetal calf serum, Dulbecco In a modified eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc.) the range where the concentration of nuclear reprogramming factor is sufficient for somatic cells such as NKT cells and no cytotoxicity is observed
  • somatic cells eg IL-2, IL-7, SCF, cytokines such as Flt3 ligand, minimal essential medium (MEM) containing about 5-20% fetal calf serum, Dulbecco In a modified eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc.
  • DMEM modified eagle medium
  • RPMI1640 medium 199 medium
  • F12 medium etc.
  • the concentration of the nuclear reprogramming factor varies depending on the type of the nuclear reprogramming factor used, but is appropriately selected within the range of about 0.1 nM to about 100 nM.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the nuclear reprogramming of the cells to be achieved, but it is usually sufficient that the contact period coexists in the medium until a positive colony appears.
  • the NKT-iPS cell of the present invention is produced by bringing a nuclear reprogramming factor into contact with an NKT cell
  • the NKT cell that is contacted with the nuclear reprogramming factor is anti-antibody in the presence of IL-2 and IL-12.
  • Those stimulated by CD3 antibody and anti-CD28 antibody may also be used.
  • NKT cells can be stimulated, for example, by adding IL-2 and IL-12 to a culture medium suitable for NKT cell culture as described above, on a culture dish in which anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody are bound to the surface. Can be performed by culturing NKT cells for a certain period of time.
  • the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody may be used in a form dissolved in a medium as long as they can stimulate NKT cells.
  • the concentration of each antibody when bound to the plate is 0.1-100 ⁇ g / ml, and the concentration of each antibody when used in a form dissolved in a medium is 0.1-100 ⁇ g / ml.
  • the concentration of IL-2 and IL-12 to be added is appropriately selected within the range of, for example, 0.1-100 ng / ml.
  • the culture period is not particularly limited as long as it is sufficient for the proliferation of NKT cells and stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, but it is usually about 3 days to 1 month, for example, 1 week. NKT cells stimulated by such a process are brought into contact with a nuclear reprogramming factor.
  • HDAC histone deacetylase
  • nucleic acid expression inhibitors such as sodium, small molecule inhibitors such as MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg, HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.)], G9a Histone methyltransferase inhibitors [eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology) Etc.), etc., etc.], etc., etc., etc., etc. are included.
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector comprising DNA encoding siRNA or shRNA.
  • a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells with a somatic cell such as an NKT cell may occur when the substance is (a) a protein factor, (b) a nucleic acid encoding the protein factor, or (c )
  • the nuclear reprogramming factor can be carried out by the same method as described above.
  • iPS cell establishment efficiency improving substances can be combined with nuclear reprogramming factors and NKT cells. Either somatic cell may be contacted, or either may be contacted first.
  • the nuclear reprogramming factor when the nuclear reprogramming factor is a nucleic acid encoding a protein factor, and the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is a chemical inhibitor, the former uses a protein factor from the gene transfer treatment. Since there is a lag of a certain period until large-scale expression, the latter can act on the cells quickly, so after culturing the cells for a certain period from the gene transfer treatment, a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is added to the medium can do.
  • both the nuclear reprogramming factor and the substance for improving the establishment efficiency of iPS cells when both the nuclear reprogramming factor and the substance for improving the establishment efficiency of iPS cells are used in the form of a viral vector or a plasmid vector, they may be simultaneously introduced into the cell.
  • Somatic cells such as NKT cells isolated from humans or mice are known per se known media (for example, cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, SCF, Flt3 ligand, about 5- It is also possible to pre-culture in a minimum essential medium (MEM) containing about 20% fetal bovine serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc.).
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium 199 medium
  • F12 medium etc.
  • the cells After contacting with a nuclear reprogramming factor (and a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells), the cells can be cultured under conditions suitable for culturing ES cells, for example.
  • a nuclear reprogramming factor and a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells
  • the cells can be cultured under conditions suitable for culturing ES cells, for example.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • cells are cultured as feeder cells in the presence of fibroblasts (MEFs) derived from mouse embryos that have been treated with radiation or antibiotics to stop cell division.
  • MEFs fibroblasts
  • STO cells and the like are often used as MEFs, but SNL cells (McMahon, AP & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) and the like are often used for induction of iPS cells.
  • the selection of candidate colonies for NKT-iPS cells includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method based on visual morphological observation.
  • the former include a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • somatic cells such as recombinant NKT cells targeted to a reporter gene, colonies that are drug resistant and / or reporter activity positive are selected.
  • examples of a method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashi et al., Cell, 131, 861-872-8 (2007).
  • the method using reporter cells is simple and efficient, since the present invention aims to apply NKT-iPS cells to human therapeutic uses, it is desirable to select colonies visually from the viewpoint of safety. A candidate colony of NKT-iPS cells can be selected sufficiently efficiently by visual morphological observation.
  • NKT-iPS cells can be confirmed by various test methods known per se, such as ES cell-specific genes (eg, Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cripto, Dax1, ERas, Fgf4 , Esg1, Rex1, Zfp296, etc.) are measured using RT-PCR, DNA microarray, etc., and the expression profile is determined from ES cells (eg, ES cells derived from fertilized eggs, NKT cells). This can be performed by comparing with the gene expression profile in cloned embryo-derived ES cells obtained by somatic cell nuclear transfer. For further accuracy, the selected cells may be induced to differentiate to confirm embryoid body formation or transplanted to mice to confirm teratoma formation.
  • ES cell-specific genes eg, Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cripto, Dax1, ERas, Fgf4 , Esg1, Rex1, Zfp296, etc.
  • ES cells eg, ES cells derived from fertilized eggs
  • NKT-iPS cells are derived from somatic cells such as NKT cells in which the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner. Can be performed by examining the presence or absence of gene rearrangement to NKT-TCR by genomic PCR.
  • somatic cells such as NKT cells in which the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in a NKT cell receptor-specific manner.
  • the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is uniform in an NKT cell receptor-specific manner.
  • a pluripotent stem cell that has been reconstituted into V ⁇ -J ⁇ or capable of expressing a uniform V ⁇ -J ⁇ in a specific region on the genome in a manner specific to the NKT cell receptor is disclosed in, for example, Patent No.
  • a microcell containing a chromosomal fragment containing the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ from NKT cells in a NKT cell receptor-specific manner, It can be produced by transferring the chromosomal fragment into pluripotent stem cells by fusion with microcells, or by transferring into a genomic region (such as human AAVS1 region) that can be steadily expressed.
  • the form of the NKT cell that can be used for the preparation of this chromosome fragment is as described above for the NKT cell that can be used for the preparation of NKT-iPS cells.
  • NKT cell nuclei are transplanted into enucleated cells (eg, oocytes), and subjected to predetermined procedures to produce NKT cell cloned animals Then, ES cells can be established by culturing the inner cell mass of the early embryo obtained by mating the cloned animals on feeder cells. Production of cloned animals is described in, for example, WO2006 / 018998. In the case of humans, it is not possible to create cloned humans, but it is possible to establish ES cells by creating human cloned embryos by NKT cell nuclear transfer and culturing the inner cell mass on feeder cells in vitro. It is theoretically possible.
  • a cell established from NKT cells that have been reconstituted and having at least the ability to redifferentiate into NKT cells can be established by direct reprogramming.
  • Direct reprogramming is easier to maintain and proliferate than NKT cells by introducing genes such as transcription factors into NKT cells and adding chemical substances that induce differentiation into the culture medium.
  • neural stem cells were obtained by introducing Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc into fibroblasts and culturing them under culture conditions suitable for neural cell induction. (Kim et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108,) 7838-7843 (2011)).
  • NKT cells If the same direct reprogramming is performed on NKT cells, and the cells that have at least the ability to redifferentiate into NKT cells obtained as a result of direct reprogramming are cells with a variety of differentiation, T / NKT It has been reported that a large amount of NKT cells can be obtained by culturing under conditions suitable for cell induction (Watarai et al. J Clin Invest, 120, 2610-2618, 2010).
  • hematopoietic stem cells in which the ⁇ chain (TCR ⁇ ) region of the TCR gene is reconstituted into uniform V ⁇ -J ⁇ in an NKT cell receptor-specific manner.
  • the hematopoietic stem cells can be obtained, for example, by culturing the above-mentioned NKT-iPS cells or NKT-PS cells under conditions for differentiation into hematopoietic stem cells, or by directly reprogramming NKT cells into hematopoietic stem cells.
  • NKT-iPS cells and NKT-PS cells Differentiation conditions from NKT-iPS cells and NKT-PS cells to hematopoietic stem cells include forced expression of Lhx2 (Kitajima et al., Blood, 117 (14), 3748-3758 (2011)), induction of differentiation in invivo (In vivo evaluation of putative hematopoietic stem cells derived from human pluripotent stem cells. Hexum MK, Tian X, Kaufman DS. Methods Mol Biol. 2011; 767: 433-447.).
  • NKT-derived cells cells defined as pluripotent stem cells (hereinafter abbreviated as NKT-PS cells; eg, NKT-iPS cells) are based on reports in ES cells, and the presence of cytokines such as IL-7 and Flt3 ligand
  • NKT-PS cells pluripotent stem cells
  • cytokines such as IL-7 and Flt3 ligand
  • the stromal cells expressing Notch ligand can be differentiated into CD4 / CD8 double positive NKT cells by culturing them as feeder cells.
  • functional mature NKT cells can be differentiated in vitro by using the method described below.
  • NKT-derived cells are activated by stimulation of a NKT cell receptor ligand such as ⁇ -GalCer, eg, for use as a source of NKT cell immunotherapeutic agents. Differentiated in vitro into functional mature or immature NKT cells.
  • NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • stromal cells expressing Notch ligand.
  • DP-NKT cells CD4 / CD8 double positive NKT cells
  • stromal cells include, but are not limited to, OP9 cells and S17 cells in which Notch ligand (eg, Delta-like 1; hereinafter also referred to as “Dll-1”) is forcibly expressed.
  • media for differentiation induction examples include cytokines such as interleukin-2 (IL-2), IL-7, IL-15, stem cell factor (SCF), and Flt3 ligand (FL) (each 0.1-10 ng / mL) , Preferably 1-5 ng / mL), minimal essential medium (MEM) containing about 5 to about 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc.
  • cytokines such as interleukin-2 (IL-2), IL-7, IL-15, stem cell factor (SCF), and Flt3 ligand (FL)
  • IL-2 interleukin-2
  • SCF stem cell factor
  • FL Flt3 ligand
  • NKT-iPS cells are seeded in a culture container known per se so that the cell density becomes, for example, about 1.0 ⁇ 10 6 to about 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL, and 5% CO 2 /95% in an atmosphere of air.
  • Confirmation of differentiation into DP-NKT cells can be achieved by, for example, antibodies against cell surface markers (eg, antibodies against CD4 and CD8, antibodies against CD3, TCRb, etc.) and multimers of CD1d pulsed with ⁇ -galactosylceramide (two The phenotype of the cell surface antigen can be analyzed using a cell sorter and a tetramer. If necessary, the expression of various other cell surface antigens can also be examined and the phenotype can be compared with that of CD4 + / CD8 + cells present in the thymus, for example.
  • cell surface markers eg, antibodies against CD4 and CD8, antibodies against CD3, TCRb, etc.
  • multimers of CD1d pulsed with ⁇ -galactosylceramide two The phenotype of the cell surface antigen can be analyzed using a cell sorter and a tetramer. If necessary, the expression of various other cell surface antigens can also be examined and the phenotype can be
  • DP-NKT cells obtained as described above By co-culturing DP-NKT cells obtained as described above with stromal cells in the presence of several cytokines selected from IL-2, IL-7, IL-15, IL-15Ralpha and FL, A large amount of NKT cells can be amplified.
  • stromal cells used at this time include the same cells as described above, such as OP9 cells and S17 cells, but the cells may or may not express Notch ligand.
  • the medium those similar to the above are preferably exemplified except for the combination of cytokines.
  • Specific cytokine combinations include IL-7 / FL, IL-2 / IL-7 / IL-15, IL-2 / IL-7 / IL-15 / IL-15Ralpha, IL-2 / IL-7 / FL, IL-2 / IL-15 / FL, IL-2 / IL-15 / IL-15Ralpha / FL, IL-7 / IL-15 / FL, IL-7 / IL-15 / IL-15Ralpha / FL , IL-2 / IL-7 / IL-15 / FL, IL-2 / IL-7 / IL-15 / FL, IL-2 / IL-7 / IL-15 / IL-15Ralpha / FL, particularly preferably IL-7 / FL, IL-2 / A combination of IL-15 / IL-15Ralpha / FL and IL-2 / IL-7 / IL-15 / IL-15Ralpha / FL.
  • each cytokine can be appropriately selected within the range of 0.1-10 ng / mL, preferably 1-5 ng / mL.
  • another cytokine eg, SCF, etc.
  • the culture may be appropriately adjusted according to the animal species from which the cells are derived.For example, in an atmosphere of 5% CO 2 /95% air, about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C., about 3 days -About 6 weeks, preferably about 3 days-about 4 weeks, more preferably about 5 days-about 3 weeks. By main culture, the amount of cells increases about 20 to about 30 times or more in 5 days.
  • NKT cells obtained by stimulation of the above cytokine combination produce IFN- ⁇ by stimulation of NKT cell receptor ligand (eg, ⁇ -galactosylceramide), and thus have an adjuvant effect.
  • NKT cell receptor ligand eg, ⁇ -galactosylceramide
  • a preferred cytokine combination is IL-7 / FL or IL-7 / IL-15 / IL-15Ralpha / FL. This is because the profile of cytokines produced by NKT cells induced by a combination of these cytokines is relatively biased in Th1 type.
  • NKT cells that closely resemble peripheral NKT cells can be produced.
  • the NKT cells are characterized by positive NK markers (CD161 in humans, NK1.1 in B6 mice), but also exhibit phenotypes such as CD3 ⁇ + , Sca1 + , CD44 + , CD69 + , CD34 ⁇ , Flt3 ⁇ ,
  • the expression of TCR ⁇ (V ⁇ 24 in humans and V ⁇ 14 in mice) is also decreased as compared to DP-NKT cells, showing the same level of expression as peripheral NKT cells.
  • NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • feeder cells are switched from stromal cells expressing Notch ligand to stromal cells not expressing the ligand.
  • stromal cells that do not express Notch ligand include, but are not limited to, OP9 cells and S17 cells.
  • a medium used for inducing differentiation from NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • DP-NKT cells a medium used for inducing differentiation from NKT-PS cells
  • IL-2, IL-7, IL- IL-2, IL-7, IL-
  • IL-15 two or more cytokines selected from 15 and FL, and it is more preferable to include IL-15.
  • the timing of switching feeder cells from stromal cells that express Notch ligand to stromal cells that do not express the ligand is as long as NKT cells (eg, NK1.1 positive cells) equivalent to peripheral NKT cells are finally obtained.
  • NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • stromal cells expressing Notch ligand preferably about 14 to about 18 days Later, the feeder cells are switched to stromal cells that do not express the ligand.
  • the co-culture period with stromal cells that do not express Notch ligand is not particularly limited, and is, for example, about 3 days to about 4 weeks, preferably about 5 days to about 3 weeks.
  • NKT cells differentiated and matured to the same extent as peripheral NKT cells can be obtained.
  • NKT cells that produce a large amount of IFN- ⁇ can be produced by culturing in the presence of several types of cytokines such as IL-7 / FL for 4 weeks or longer.
  • NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • the TCR ⁇ chain region on the chromosome has been reconstituted into an NKT cell-specific mode (V ⁇ 24-J ⁇ 18 for humans and V ⁇ 14-J ⁇ 18 for mice).
  • NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells
  • the source of NKT cells allotropes can be obtained.
  • NKT cells derived from NKT-PS cells eg, NKT-iPS cells.
  • NKT cells derived from NKT-derived cells obtained as described above (hereinafter, NKT cells derived from NKT-derived cells are referred to as “redifferentiated NKT cells”, NKT-PS cell-derived NKT cells) are called “PS-NKT cells” and NKT-iPS cell-derived NKT cells are also called “iPS-NKT cells”), which are CD1d-restricted, so dendritic cells presenting NKT cell receptor ligands such as ⁇ -GalCer By contacting with (DC), redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) can be activated.
  • DC redifferentiated NKT cells
  • DCs are preferably of the same type as redifferentiated cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells), but as long as they can activate redifferentiated cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) (For example, mouse DC and human redifferentiated NKT cells (eg, human PS-NKT cells, human iPS-NKT cells) are contacted).
  • DC is not particularly limited as long as it can activate redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) via NKT cell receptor ligands, and myeloid dendritic cells (DC1) Any of lymphoid dendritic cells (DC2) may be used, but DC1 is preferred.
  • DC may be prepared by any method known per se and can be isolated from bone marrow, peripheral non-lymphoid tissue, T cell region of lymphoid tissue, imported lymph, epidermis, dermis, etc.
  • Monocytes, bone marrow cells, etc. can be separated from bone marrow cells and peripheral blood by density gradient centrifugation, etc., and cultured in the presence of GM-CSF (and IL-4) for about 7 to about 10 days. (Nature, 408, p.740-745, 2000).
  • the NKT cell receptor ligand used for pulsing DC is specifically recognized by the T cell receptor on the NKT cell when presented on the CD1d molecule, and the NKT cell is specifically identified.
  • the NKT cell is specifically identified.
  • Examples of NKT cell receptor ligands used in the present invention include ⁇ -glycosylceramide, isoglobotrihexosylceramide (Science, 306, p.1786-1789, 2004), OCH (Nature 413: 531, 2001).
  • Etc. ⁇ -Glycosylceramide is a glycosphingolipid in which saccharides such as galactose and glucose and ceramide are bonded in an ⁇ -coordinate.
  • the NKT cell receptor ligand is used to mean a salt thereof.
  • salts of NKT cell receptor ligands salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) are used, and particularly physiologically acceptable acids. Addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid
  • the NKT cell receptor ligand is used as a meaning including its solvate (hydrate, etc.).
  • the NKT cell receptor ligand used to pulse DC is of GMP grade It is desirable.
  • DC pulsing with an NKT cell receptor ligand may be performed by a conventional method, for example, a serum-containing medium containing an NKT cell receptor ligand at a concentration of about 0.1 to about 200 ng / mL (for example, RPMI-containing 10% FCS) 1640 medium, etc.) can be performed by culturing DC for about 12 to about 48 hours.
  • the pulse of the NKT cell receptor ligand may be performed by adding ⁇ -GalCer to the medium in the process of culturing and maturing immature DC in the presence of GM-CSF (and IL-4).
  • NKT cell receptor ligand to the medium in the step of co-culturing mature DCs with redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) as described below. Good.
  • NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • peripheral NKT cells from, for example, NKT-derived cells (eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells)
  • NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the two can be co-cultured in the above-mentioned medium.
  • activated NKT cells refers to redifferentiated NKT cells that produce Th1 cytokines such as IFN- ⁇ in response to DCs presenting at least ⁇ -GalCer (eg, PS-NKT cells, iPS- NKT cells).
  • the cells may further have the ability to produce Th2 cytokines such as IL-4, and may have the ability to proliferate.
  • NKT-derived cells eg, NKT
  • NKT-iPS cells In the process of inducing differentiation from -PS cells, NKT-iPS cells) to redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells), it is necessary to continue co-culture with stromal cells expressing Notch ligand In that case, the ability to produce IFN- ⁇ is also higher than redifferentiated NKT cells obtained by switching to stromal cells that do not express Notch ligand (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells).
  • IL-7 / FL or IL-15 / IL-15R alpha / IL can be used as a cytokine in a culture process that amplifies a large amount of redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) from DP-NKT cells.
  • NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • the Th1 / Th2 cytokine production balance particularly in activated NKT cells, shows a Th1 advantage.
  • the present invention provides an immunocytotherapeutic agent comprising redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) obtained as described above.
  • the redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • the redifferentiated NKT cells are preferably activated NKT cells.
  • Redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • provided by the present invention have an ability to proliferate and produce Th1-dominant cytokines, and have an adjuvant effect similar to endogenous NKT cells. Therefore, it is useful for the prevention and treatment of various diseases such as cancer, infectious diseases, allergic diseases, and autoimmune diseases.
  • cancer examples include all kinds of primary cancers, and cancers of all conditions including early stage cancer and advanced cancer having metastasis / invasive ability.
  • lung cancer small and / or non-small cell
  • brain tumor stomach cancer, esophageal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, bladder cancer, breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, testicular cancer , Skin cancer, osteosarcoma, colorectal cancer, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, acute nonlymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, ACTH-producing tumor, adrenocortical carcinoma, cutaneous T-cell lymphoma, endometrial cancer , Ewing sarcoma, gallbladder cancer, head and neck cancer, Hodgkin lymphoma, Kaposi sarcoma, melanoma, mesothelioma, multiple myeloma, neuroblastoma, non-small cell
  • Autoimmune diseases include multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, common vitiligo, Behcet's disease, collagen disease, type I diabetes, uveitis, Sjogren's syndrome, autoimmune myocarditis, autoimmune liver Examples include, but are not limited to, diseases, autoimmune gastritis, pemphigus, Guillain-Barre syndrome, HTLV-1-related myelopathy. Allergic diseases include, but are not limited to, asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, allergic gastroenteritis and the like. Infectious diseases include, but are not limited to, viral infections such as CMV (for example, HCMV or MCMV), herpes simplex virus, EB virus, human immunodeficiency virus, influenza virus, SARS virus and the like.
  • CMV for example, HCMV or MCMV
  • herpes simplex virus EB virus,
  • the immunocytotherapeutic agent of the present invention is an allogeneic strain in which redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells), which are active ingredients thereof, do not match the genotype of at least one of the MHC loci.
  • NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • Individuals are to be administered. This is because the present inventors are subject to administration of individuals from which NKT cells are derived and allogeneic individuals in which the MHC type is identical (ie, the genotype of the main locus of MHC is substantially completely identical). It is an epoch-making “drug” that has a completely different treatment concept from the previously reported immune cell therapies.
  • the latter is based on the premise that the transferred NKT cells continue to take and function in the host body, whereas in the immunocytotherapeutic agent of the present invention, the transferred NKT cells have at least the MHC locus. Due to some discrepancies, the transferred NKT cells are recognized by the recipient's immune system and are eventually eliminated and do not engraft. However, since the adjuvant effect of NKT cells is achieved in a short period of time, immune system cells (eg, CD8T cells, NK cells) other than NKT cells can be activated. Therefore, in the immunocytotherapeutic agent of the present invention, NKT cells play the same role as “ordinary pharmaceuticals” that are quickly eliminated from the body after exerting a drug effect for a necessary period.
  • immune system cells eg, CD8T cells, NK cells
  • the MHC locus has the same meaning as described above, and in the case of human MHC (HLA), three loci of HLA-A, HLA-B and HLA-C can be mentioned. Similarly, in the case of mice, the H-2K, H-2D and H-2L loci of the class I region can be mentioned as the main loci in the present invention.
  • an allogeneic individual in which at least one (preferably two, more preferably three) genotype of the above three loci differs from the NKT cell to be transferred is the subject of immunocell therapy.
  • the administered NKT cells are eliminated by the recipient's alloimmune reaction due to the difference in the MHC locus, so that they can be eliminated after effectively exhibiting an effect such as an adjuvant effect. Be expected.
  • Re-differentiated NKT cells are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier according to conventional means, and so on, orally / parenteral preparations, preferably injections, suspensions It is manufactured as a parenteral preparation such as a drug or infusion.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants.
  • An aqueous liquid for injection can be mentioned.
  • the agent of the present invention includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, Polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants and the like.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, Polyethylene glycol, etc.
  • redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT
  • PS-NKT redifferentiated NKT cells
  • the aqueous solution has a concentration of about 1.0 ⁇ 10 6 to about 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • Cells, iPS-NKT cells may be suspended.
  • the method of administration is not particularly limited and can be administered orally or parenterally, but is preferably injection or infusion, intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, affected area Direct administration etc. are mentioned.
  • the dose of the immunocytotherapeutic agent varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but usually in an adult patient (with a body weight of 60 kg), for example, once in the case of parenteral administration Conveniently, about 1.0 ⁇ 10 7 to about 1.0 ⁇ 10 9 cells per NKT cell are administered about 4 to about 8 times at intervals of about 1 to 2 weeks.
  • redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • redifferentiated NKT cells for example, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • NKT cell receptor ligands may be combined.
  • NKT cell receptor ligands used in combination with redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • those described above in the production of activated NKT cells can be used as well, but preferably ⁇ -GalCer.
  • a GMP grade NKT cell receptor ligand is used.
  • Patients suffering from diseases that require NKT cell therapy, such as cancer, may have reduced numbers of endogenous DCs or lack of function, so redifferentiated NKT cells (eg, For the purpose of enhancing in vivo activation of PS-NKT cells and iPS-NKT cells), DC pulsed with an NKT cell receptor ligand may be used instead of the NKT cell receptor ligand.
  • the DC collection source is preferably the patient who is the subject of administration (ie autotransplantation), but is limited to this if it is an allogeneic individual that is predicted to be compatible with the patient. Not.
  • NKT cell receptor ligands are usually produced as parenteral preparations such as injections, suspensions, drops and the like together with pharmaceutically acceptable carriers.
  • pharmaceutically acceptable carriers include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants.
  • An aqueous liquid for injection can be mentioned.
  • the agent of the present invention includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, Polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants and the like.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, Polyethylene glycol, etc.
  • preservatives antioxidants and the like.
  • an appropriate organic solvent eg, DMSO
  • the NKT cell receptor ligand formulated as described above can be administered orally or parenterally, but is preferably injection or infusion, intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, muscle Intraperitoneal administration, intraperitoneal administration, direct administration to the affected area, etc.
  • the dose of the NKT cell receptor ligand varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but usually in an adult patient (with a body weight of 60 kg), for example, once for parenteral administration The amount is usually about 0.6 to about 6.0 mg.
  • the dosage is usually about 1.0 ⁇ 10 7 to about 1.0 ⁇ 10 9 cells at a time. These amounts can be administered depending on the administration protocol of the iPS-NKT cell-containing preparation.
  • Redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • NKT cell receptor ligand-containing preparations can be administered separately or mixed at the same time, or redifferentiated NKT cells (Eg, PS-NKT cell, iPS-NKT cell) -containing preparation, followed by NKT cell receptor ligand-containing preparation, in that order, can also be administered over time.
  • the present invention also provides immune cell therapy using the above-mentioned human redifferentiated NKT cells (eg, human PS-NKT cells, human iPS-NKT cells) under conditions that are more rapid, universal, and excellent in quality control.
  • Human NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the NKT-derived cell-derived NKT cells redifferentiated NKT cells
  • PS-derived NKT cells PS-derived NKT cells
  • iPS-derived NKT cells iPS-derived NKT cells
  • the characteristics of the human NKT cell-derived cell (eg, PS cell, iPS cell) bank or the NKT-derived cell (eg, PS cell, iPS cell) -derived NKT cell bank of the present invention have already been reconstructed. Because it is composed only of NKT cell-derived cells (eg, PS cells, iPS cells) (or NKT-derived cells (eg, PS cells, iPS cells) -derived NKT cells), differentiation of functional NKT cells can be induced. It is easy.
  • a human iPS cell repertoire that can provide cells and organs that can be engrafted in the body so that the human iPS cell bank that has been proposed so far can be adapted to any patient, that is, HLA
  • HLA HLA
  • NKT-devired cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the difference is that the goal is to have redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells).
  • allogeneic individuals whose genotype at at least one of the MHC loci does not coincide with NKT cells are targeted for administration. Since all genotypes at the MHC locus are rarely identical between NKT cells and patients, one kind of NKT cell has been confirmed theoretically to be safe and to differentiate into NKT cells. With derived cells (eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells), almost all patients can be covered. Thus, in the present invention, if at least one of the HLA loci (for example, at least one locus selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B, and HLA-C) is mismatched, transplantation can be used. Thus, banking of human NKT-devired cells (eg, human NKT-PS cells, human NKT-iPS cells) that meet the objectives of the present invention is achieved to a degree that can cover the majority of the patient population relatively easily. Should get.
  • human NKT-devired cells eg, human NKT-PS cells, human NKT-iPS cells
  • the invention provides for a specific HLA locus in a population (eg, at least one selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B and HLA-C (preferably two, more preferably 3
  • the total genotype frequency of the two loci covers 50% or more (eg 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more) of the entire population.
  • a bank of human NKT cell-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • NKT-derived cell-derived NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells having a genotype repertoire I will provide a.
  • the human NKT cell-derived cell bank of the embodiment (or the NKT-derived cell-derived NKT cell bank) is used, 50% or more (for example, 60% or more, preferably Only a genotype of a specific HLA locus (hereinafter referred to as “target HLA”) covering 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more) is determined, and a geno different from the patient is determined.
  • target HLA a genotype of a specific HLA locus
  • human NKT cell-derived iPS cells with the type of HLA from the bank, for almost all patients included in the population, specific HLA loci (eg, HLA-A, HLA-B and HLA- Human NKT cell-derived cells (eg, NKT-) whose genotype does not match that of the patient at least one (preferably two, more preferably three) loci selected from the group consisting of C loci PS cells, NKT-iPS fine ) And the NKT-derived cells derived NKT cells (e.g., PS-NKT cells, it is possible to smoothly supply the iPS-NKT cells).
  • HLA loci eg, HLA-A, HLA-B and HLA- Human NKT cell-derived cells (eg, NKT-) whose genotype does not match that of the patient at least one (preferably two, more preferably three) loci selected from the group consisting of C loci PS cells, NKT-iPS fine )
  • the NKT-derived cells derived NKT cells e.g.,
  • NKT cell-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • NKT-derived cell-derived NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • the target HLA is preferably HLA-A, HLA-B or HLA-C, and there are fewer allele types, and serotypes (two-digit level) are A24, A2, A11, A26, A31, and A33, Japanese. It is particularly preferable to select HLA-A because it is easier to obtain an HLA genotype suitable for the purpose of the present invention when selecting a genotype of the HLA-A locus that covers 92% of the gene.
  • a “group” is a national unit such as the entire Japanese, the entire American, an ethnic unit, or a race such as an entire white race, an entire yellow race, or an entire black race. It can be a unit or even the whole human race.
  • the human NKT-derived cell bank or human regenerated NKT cell bank of the present invention can be constructed by performing the following steps (1) to (4): (1) determining the genotype of a particular HLA locus of a donor registrant (eg, at least one HLA locus selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B and HLA-C); (2) collecting NKT cells from a donor registrant; (3) Establishing human NKT-derived cells from the NKT cells, and establishing human redifferentiated NKT cells from the human NKT-derived cells established as necessary; and (4) NKT of the established human NKT-derived cells.
  • the human NKT-iPS cell bank or human iPS-NKT cell bank of the present invention can be constructed by performing the following steps (1) to (4): (1) determining the genotype of a particular HLA locus of a donor registrant (eg, at least one HLA locus selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B and HLA-C); (2) collecting NKT cells from a donor registrant; (3) a step of establishing a human iPS cell by contacting the NKT cell with a nuclear reprogramming factor, and establishing a human NKT cell from the established human iPS cell as necessary; and (4) NKT of the established human iPS cell; A process of testing cell differentiation ability and post-differentiation tumorigenicity, and sequentially banking cells that meet the criteria.
  • a donor registrant eg, at least one HLA locus selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B and HLA-C
  • collecting NKT cells from a donor registrant e.g,
  • the constructed human NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the NKT-derived cell-derived NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • the constructed human NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the NKT-derived cell-derived NKT cells eg, iPS-NKT cells
  • a specific HLA locus eg, HLA-A of a cell derived from (eg, NKT-PS cell, NKT-iPS cell) or NKT-derived cell-derived NKT cell (eg, PS-NKT cell, iPS-NKT cell)
  • the genotype repertoire of at least one (preferably two, more preferably three) loci selected from the group consisting of HLA-B and HLA-C is the sum of the frequencies in a population of each genotype Is 50% or more of the entire population (for
  • Donor registration can be done, for example, by obtaining informed consent in advance for peripheral blood collected by normal blood donation (or lymphocytes collected by component blood donation) and umbilical cord blood collected at birth. It is expected that entry will be easily obtained.
  • HLA typing is to determine HLA-A, HLA-B and HLA-C genotypes by SBT method commonly used in bone marrow transplant donor search, or to predict high frequency alleles by fluorescent bead method. Can do.
  • Human NKT cells can be easily prepared by requesting peripheral blood and umbilical cord blood to humans who have already completed HLA typing after organ registration or bone marrow transplantation.
  • NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the differentiation ability of human NKT-derived cells (eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells) established in the step (4) into NKT cells is the above-mentioned redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT). Cells, iPS-NKT cells), and determining whether differentiation induction is achieved in NKT cells.
  • karyotyping chromosome specimens are stained with Giemsa and analyzed for the number of chromosomes and chromosomal structure abnormalities under a microscope) and evaluation by cells with repeated passages (changes in cell characteristics)
  • Soft agar medium method utilizing that cells with tumorigenicity do not require a scaffold for cell adhesion for growth
  • transplantation into immunodeficient animals intramuscular such as nude mice
  • can be assayed using a technique such as injecting human NKT-derived cells (eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells) subcutaneously to examine the presence or absence of tumor formation.
  • human NKT cell-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • the NKT-derived cell-derived NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • Banked cells are cryopreserved in a dispensed manner using standard methods, thawing a portion of the stock at the time of use, and an appropriate medium (for example, for human ES cell culture).
  • human redifferentiated NKT cells eg, PS
  • NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • induction of differentiation into NKT cells are carried out by the medical facility receiving the cells after receiving the distribution of the target cells from the cell bank
  • NKT-derived cells eg, NKT-PS cells, NKT-iPS cells
  • redifferentiated NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-
  • NKT cells After inducing differentiation into (NKT cells), it is desirable to distribute the cells in the state of re-differentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells) to the medical facility where the cells are to be provided.
  • a medical facility that wants to receive human redifferentiated NKT cells performs HLA typing of the target patient and reports it to the cell bank.
  • the medical facility has at least one HLA locus (for example, at least one selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B and HLA-C (preferably two, More preferably, the genotypes of 3) loci) are confirmed to be inconsistent and used for therapeutic purposes.
  • the health care facility simply reports the genotype of the patient's HLA locus, and the cell bank is responsible for at least one of the patient's HLA loci (eg, HLA-A, HLA-B) based on the data accumulated so far.
  • NKT cell-derived cells eg, NKT- PS cells, NKT-iPS cells
  • cell-derived NKT cells eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells
  • each medical facility that receives the cells provides the cell bank with the administration method, treatment protocol, therapeutic effect, and treatment of redifferentiated NKT cells (eg, PS-NKT cells, iPS-NKT cells).
  • Example 1 Establishment of iPS cells from mouse spleen cell-derived NKT cells In C57BL / 6 mice, the T cell antigen receptor ⁇ chain (TCR ⁇ ) region has already been reconstituted into TCR (NKT-TCR) used in NKT cells. NKT cells were prepared from spleen cells.
  • NKT cells are characterized by recognizing the glycolipid antigen presented on CD1d, an MHC class I-like molecule, and solubilized CD1d-mouse IgG1 recombinant sandwiched between ⁇ -GalCer, a glycolipid antigen ( Cells reactive with the anti-mouse IgG1 antibody labeled with BD Bioscience) were positively selected using the MACS method (Miltenyi Biotech) using anti-APC magnetic beads to concentrate the cells. By this operation, NKT cells defined as ⁇ -GalCer loaded CD1d dimer positive / TCR ⁇ positive cells had a purity of 90% or more.
  • NKT cells were cultured in RPMI medium containing 10% FCS at a cell density of 10 6 cells / ml for 24 hours in the presence of IL-2 (10 ng / ml), then Cell, 126: 663-676 (2006)
  • the cells were infected with a retrovirus (10 6 pfu / ml) containing 4 factors derived from mice (nucleic acids encoding Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc) for 24 hours.
  • Cells were collected 3-7 days after virus infection, repopulated on mouse embryonic fibroblasts (MEF), and co-cultured in an ES cell culture medium in the presence of LIF.
  • NKT-iPS cells NKT cell-derived iPS cells
  • NKT-iPS cells Characterization of NKT-iPS cells
  • genomic PCR In order to prove whether the 4 clones of NKT-iPS cells established in (1) above are derived from NKT cells, it was confirmed by genomic PCR whether or not reconstitution into NKT-TCR was performed.
  • cells with NKT-TCR one of the TCR ⁇ regions has already been reconstituted into V ⁇ 14-J ⁇ 18 (Fig. 1), so PCR was performed using the primers shown below as a template for each NKT-iPS clone genome. By doing, the presence or absence of reconstruction was confirmed.
  • NKT-iPS cells Gene expression profiling was performed to confirm whether the NKT-iPS cells confirmed in (2) above were reprogrammed into iPS-like cells.
  • NKT-iPS cells, NKT cell nuclear transfer embryo-derived ES cells (NKT-ES cells), and peripheral NKT cells were prepared by total phenol using the phenol-chloroform method, and a series of known expression in ES cells The expression of the gene group was analyzed by one step RT-PCR method (Invitrogen). The analyzed genes and the primer sequences used are listed below.
  • NKT-iPS cells may have iPS cell-like functions.
  • the correlation of gene expression profiles among NKT-iPS cells, NKT-ES cells, ES cells, and peripheral NKT cells was confirmed by DNA microarray (Affimetrix). NKT-iPS cells were found to be NKT-ES cells. Alternatively, it was found that it has a gene expression pattern very similar to that of ES cells and is different from peripheral NKT cells (FIG. 4).
  • mice were produced from the CKTBL / 6 mouse NKT clone-derived NKT-iPS cells established in (2) above and Balb / c-derived cells by the aggregation method. Cell surface antigens were analyzed for the spleen cells of the obtained chimeric mice. C57BL / 6-derived cells and Balb / c-derived cells were differentiated by MHC class I and gated (I-Ab and I-Ad, respectively), and the content of NKT cells was analyzed.
  • Reference Example 1 Establishment and characterization of iPS cells from human T cells After forced expression of human peripheral blood T cells by infection with a viral vector containing KSOM, iPS cells were established by co-culturing with mouse embryonic fibroblasts for 21-35 days (Cell Stem Cell 7 : 11-14,15-19, 20-24 (2010)). IPS cells established in this way have a comprehensive gene expression profile and epigenomic status of ES-related genes highly correlated with those of human ES cells, and T cell antigen receptor region has undergone gene rearrangement Has been confirmed.
  • Example 2 Establishment and characterization of iPS cells from human NKT cells
  • CD1d-restricted NKT cells present in human peripheral blood or umbilical cord blood are cells expressing both V ⁇ 24 and V ⁇ 11, and occupy about 0.001% to 0.1% of mononuclear cells.
  • glycolipid ligand was added to mononuclear cells and cultured for about 3 days to 1 month to increase NKT cells in vitro.
  • NKT cell-derived iPS cells can be infected and forcibly expressed using KSOM incorporated into viral vectors such as viruses and Sendai virus, and co-cultured with mouse embryo fibroblasts for 1-2 months. Establish.
  • Example 3 In vitro differentiation induction from mouse NKT-iPS cells ES cells are expressed as OP9 stromal cells (OP9 / Dll-1) forcibly expressing Delta-like1 (Dll-1), a Notch ligand, IL-7 and CD4 / CD8 double positive (DP) T cells can be induced to differentiate by co-culture in the presence of Flt3 ligand (FL) (Schmitt TM, de Pooter RF, Gronski MA, Cho SK, Ohashi PS, Zuniga -Pflucker JC. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 2004 Apr; 5 (4): 410-417.).
  • FL Flt3 ligand
  • NKT-iPS cells were co-cultured with OP9 / Dll-1 cells in the presence of IL-7 (1 ng / ml) and FL (5 ng / ml) for 20 days.
  • -GalCer loaded CD1d dimer positive / TCR ⁇ positive NKT cell-like cells (NKT-iPS cell-derived DP-NKT cells) were induced (FIG. 7).
  • Further detailed analysis of cell surface antigen expression revealed that the DP-NKT cell phenotype was very similar to that of CD4 / CD8 DP cells in the thymus (FIG. 8).
  • NKT-iPS cells are easily induced to differentiate into NKT-like cells under the influence of TCR ⁇ region gene rearrangement, and a new feature that takes advantage of gene rearrangement of immune cells.
  • target immune cells especially NKT cells, T cells, B cells
  • NKT-iPS cells were co-cultured with OP9 / Dll-1 from the 14th day of culture and cocultured with OP9 from the 14th day to the 20th day of culture. It was analyzed whether or not NKT cells were induced. As a result, NKT cells can appear even in the early differentiation stage where only Lin1 / CD44 / CD25 negative so-called DN1 appears (FIG. 9), and the surface markers of differentiation-induced NKT cells are peripheral NKT cells. (Fig. 9). This result indicates that NKT cells can differentiate into mature NKT cells even if Notch signal is deficient at an early stage of differentiation.
  • NK1.1 expression was induced in the cells cultured under these conditions, and it was speculated that differentiation induction was further advanced (FIG. 11). Therefore, NKT cells obtained by induction with a cytokine combination of IL-2 / IL-15 / FL or IL-2 / IL-7 / IL-15 / FL in co-culture with OP9 or OP9 / Dll-1
  • the co-culture of bone marrow cell-derived dendritic cells (induced with GM-CSF) in the presence of ⁇ -GalCer confirmed the proliferation ability and cytokine production ability.
  • proliferative ability was confirmed when further cultured with OP9 / Dll-1 (FIG. 12), and among these, Th1 biased when cultured with IL-2 / IL-15 / FL ( Fig. 12) was confirmed.
  • Example 4 In vitro differentiation induction of mature NKT cells from human NKT-iPS cells Human NKT-iPS cells were transformed into a mouse bone marrow stromal cell line OP9 and a strain OP9 / Dll-1 in which Dll-1 as a Notch ligand was forcibly expressed. By co-culturing, the human NKT-iPS cells differentiate into human NKT cells. That is, human NKT-iPS cells were cultured with OP9 for 12 to 14 days, then differentiated cells were collected, and OP30 / Dll-1 cells and cytokines such as IL-7, Flt-3L, and SCF were further present for 15-30 days Co-culture below. In this way, differentiation of CD1d-restricted NKT cells can be induced.
  • Example 5 Adjuvant effect of mouse NKT-iPS cell-derived mature NKT cells in vivo NKT-iPS cell-derived mature NKT cells induced in Example 3 (3) (OP9 / Dll-1 in the presence of IL-7 / FL) And co-cultured with OP9 / Dll-1 in the presence of IL-2 / IL-15 / FL for another 5 days), it was evaluated whether it was functional in vivo.
  • spleen cells derived from TAP knockout mice After culturing spleen cells derived from TAP knockout mice with 10 mg / ml ovalbumin (OVA) in hypertonic solution, apoptosis was induced, and 2 ⁇ 10 7 apoptotic cells together with 2 ⁇ g ⁇ -GalCer and NKT-iPS cells 10 5 or 10 6 derived mature NKT cells were transferred to J ⁇ 18 knockout mice (NKT cell-deficient mice) previously transferred 1 hour ago. Seven days later, spleen cells were collected from the mice, stimulated with OVA peptide (257-264) in vitro, and IFN- ⁇ production was analyzed by intracellular staining.
  • OVA ovalbumin
  • Example 6 Adjuvant effect of mouse NKT-iPS cell-derived mature NKT cells in vivo Allograft cells and transplanted organs are known to be rejected when cell transfer and organ transplantation do not match. Yes.
  • NKT cells differentiated from NKT-iPS cells established from C57BL / 6 mice C57BL / 6 background
  • the transferred NKT cells are transferred by the host Balb / c mice. Rejected.
  • both the innate immune system and the acquired immune system can be activated.
  • the immune system is activated by transferring dendritic cells pulsed with drugs that specifically activate NKT cells such as ⁇ -GalCer simultaneously with NKT cell transfer.
  • Example 7 Adjuvant effect of human NKT-iPS cell-derived mature NKT cells in vivo Immune humanized mice prepared by transferring hematopoietic stem cells into severely immunodeficient mice, NOD / SCID / Common ⁇ knockout mice Inconsistent), NKT cells differentiated from human NKT-iPS cells are transferred. As with mice, human iPS cell-derived NKT cells are also rapidly rejected and must be activated simultaneously with or immediately after transfer.
  • dendritic cells pulsed with NKT cell ligand ⁇ -GalCer monocyte-derived dendritic cells derived from monocytes with GM-CSF and IL-4, or lineage negative CD11c positive CD123 negative myeloid dendritic cells, etc.
  • ⁇ -GalCer monocyte-derived dendritic cells derived from monocytes with GM-CSF and IL-4, or lineage negative CD11c positive CD123 negative myeloid dendritic cells, etc.
  • Example 8 Establishment of iPS Cells from Wild Mouse Spleen Cell-Derived NKT Cells Establishment of NKT-iPS cells from the purified mouse NKT cell population in Examples 1, 3 and 5, and NKT cells from the NKT-iPS cells It has been clarified that the cell has a function as an NKT cell. Therefore, NKT cells were prepared from the spleen cells of C57BL / 6 mice by the same procedure as in Example 1 without concentration, and an NKT cell population with a purity of about 30-50% was obtained.
  • Example 1 after culturing the cells for 24 hours at a cell density of 10 6 cells / ml in the presence of IL-2 (10 ng / ml), 4 factors derived from mice (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, A retrovirus (10 6 pfu / ml) containing c-Myc) was infected for 24 hours. Cells were collected 3-7 days after virus infection, repopulated on mouse embryonic fibroblasts (MEF), and co-cultured in an ES cell culture medium in the presence of LIF.
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • C57BL / 6 background NKT clone mice were prepared for the purpose of carrying out cell transfer experiments. That is, the nuclei of NKT cells derived from the spleen of C57BL / 6 mice were transferred to the enucleated oocytes of BDF1 mice. These cells were fused with BDF1 ⁇ ICR ES cells and transferred to the womb of a temporary parent to obtain a chimeric mouse that was born. An offspring obtained by mating the resulting chimeric mouse (male) with a C57BL / 6 mouse (female) was used as a CKTBL / 6 background NKT clone mouse.
  • the NKT clone mice established by this method are 100% of the original nucleus and are derived from NKT cells derived from the spleen of C57BL / 6 mice, so they are complete C57BL / 6, allogenic or C57BL / 6 mice. Does not cause a semi-allogenic reaction.
  • the genomic difference between C57BL / 6 background NKT cloned mice and C57BL / 6 mice is considered to be only the sequence difference due to the rearrangement of the T cell receptor region accompanying differentiation into NKT cells.
  • FIG. 16 shows the nucleotide sequence of the T cell receptor region of the NKT cloned mouse in the C57BL / 6 background after gene rearrangement.
  • Example 9 Establishment of iPS cells derived from embryonic fibroblasts derived from NKT cloned mice
  • the conventional method for establishing mouse iPS cells established by Yamanaka et al. was to use Oct3 / 4, Sox2 for embryonic fibroblasts (MEF). , Klf4, and c-Myc.
  • iPS cells were established from MEFs of NKT cloned mice created in Reference Example 2, and NKT-iPS cells 7a and 7g were successfully established.
  • the T cell receptor region causes gene rearrangement in the T cell receptor of NKT cells (FIG. 17), and the expression of genes that can serve as ES cell markers is expressed in ES cells.
  • Example 10 In Vitro Differentiation Induction from NKT Cloned Mouse MEF-Derived iPS Cells to NKT Cells
  • NKT cells were induced to differentiate in vitro from MEF-derived 7a and 7g.
  • 7a and 7g were co-cultured for 25 days with the cell line OP9 / Dll-1 in which Dll-1 as a Notch ligand was forcibly expressed in OP9, a bone marrow-derived stromal cell, using the protocol shown in FIG.
  • FIG. 24 it was revealed that differentiation was induced into ⁇ -GalCer / CD1d dimer positive and TCR ⁇ positive NKT cell-like cells (7a dif.
  • 7a dif. And 7g dif. Were very similar in expression of their cell surface markers to that of so-called DP cells positive for CD4 + CD8 present in the thymus.
  • comprehensive gene expression analysis by DNA microarray and its cluster analysis show that 7a dif. And 7g dif. Are far from 7a and 7g before differentiation induction and are close to peripheral spleen-derived NKT cells. (FIG. 25). Therefore, in order to evaluate whether 7a dif. And 7g dif. Are functionally equivalent to NKT cells, they were stimulated with ⁇ -GalCer, a glycolipid ligand, and proliferated in co-culture with dendritic cells.
  • Example 11 Analysis of in vivo function of 7a dif. And 7g dif. Since 7a dif. And 7g dif. Have the same functions as peripheral NKT cells as described in Example 10, similar effects in vivo It was analyzed using NKT cell-deficient mice. After 7a dif. And 7g dif. Were transferred to NKT cell-deficient mice, the presence of the transferred cells at 1 and 2 weeks was confirmed, and ⁇ -GalCer / CD1d dimer positive, TCR ⁇ positive 7a dif. And 7g dif were observed in the liver. Was found to exist (FIG. 27). Thus, based on the protocol shown in FIG.
  • mice were evaluated by a malignant tumor rejection model using the C57BL / 6 mouse thymoma cell line EL4 or EG7 (EL4 OVA-transfectant).
  • EG7 which is an OVA compulsory expression strain
  • malignant tumor progression is observed in wild-type mice not subjected to TOG immunization, whereas 7a dif. And 7g dif.
  • Example 12 In vivo functional analysis of human NKT-iPS cell-derived mature NKT cells With reference to the differentiation induction system of human ES cells to CD4-positive CD8-positive T cell-like cells (J Immunol, 183: 4859-4870 (2009)), In vitro NKT cell differentiation induction was performed from human NKT-iPS cells. NKT-iPS cells are co-cultured with OP9 cells for 12-14 days. Then, NKT cell progenitor cells are collected and cocultured with OP9 / Dll-1 cells in the presence of IL-7, Flt3L, and SCF for 14-35 days, so that CD1d-restricted V ⁇ 24-positive V ⁇ 11-positive NKT cells Appear.
  • Example 13 Rejection of Allo iPS-NKT Cells Transferred to Mice Transfer of allo NKT cells to normal mice causes rapid rejection, and the transferred NKT cells are eliminated without causing GvH. Under these conditions, when dendritic cells pulsed with NKT cell ligand ⁇ -GalCer or ⁇ -GalCer are co-transfected, NKT cells before rejection are activated in vivo and can exert an antitumor effect or an adjuvant effect.
  • Example 14 Method for Establishing Efficient iPS Cells from Wild-Type NKT Cells
  • iPS cells were successfully established from NKT cells derived from spleen cells of wild-type mice.
  • IPS cell establishment method was established. That is, after concentrating CD1d-restricted NKT cells from spleen cells using MACS beads, NKT cells having a purity of 99.9% are obtained by FACS sorting.
  • the NKT cells are proliferated by adding IL-2 (10 ng / ml) and IL-12 (10 ng / ml) under stimulation with anti-CD3 antibody (10 ⁇ g / ml) and anti-CD28 antibody (10 ⁇ g / ml). Can be put in.
  • the NKT cells are infected with a retrovirus containing a nucleic acid encoding Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc to establish iPS cells more than 10 times more efficiently than in Example 8.
  • the NKT-iPS clone 14k was successfully established (FIG. 31). As shown in FIG. 32, 14k undergoes ES cell-like morphology, expression of ES cell markers, and reconstitution of the NKT cell T cell receptor in the T cell receptor region. Moreover, differentiation into NKT cell-like cells was observed by the method described in Example 9, and the cells proliferated by stimulation with glycolipids in vitro to become functional cells producing cytokines (FIG. 33).
  • Example 15 Maturation of iPS-NKT cells
  • NKT-iPS cell-derived DP-NKT cells whose induction was confirmed in (1) of Example 3 in vitro
  • a combination of various cytokines was used. Culture was performed for 5 days. As a result, IL-7 / Flt3-L, IL-7 / IL-15 / Flt3-L, IL-7 / Flt-3L / IL-2 or IL-2 / It was revealed that the number of cells could be increased more than 10 times by culturing with the cytokine combination of IL-7 / IL-15 / Flt3-L (FIG. 34).
  • NK1.1 expression was induced in the cells cultured under these conditions, and it was speculated that differentiation induction was further advanced (FIG. 35). Therefore, NKT cells obtained by induction with a cytokine combination of IL-2 / IL-15 / FL or IL-2 / IL-7 / IL-15 / FL in co-culture with OP9 or OP9 / Dll-1
  • the co-culture of bone marrow cell-derived dendritic cells (induced with GM-CSF) in the presence of ⁇ -GalCer confirmed the proliferation ability and cytokine production ability.
  • proliferation ability was confirmed when further cultured with OP9 / Dll-1 (FIG. 36), and among them, Th1 biased when cultured with IL-7 / Flt3-L (FIG. 36). ) was confirmed.
  • Example 16 Adjuvant effect on T cells by allo NKT cells After transfecting NKT cells into NKT-deficient mice (Ja18-KO mice), the adjuvant effect was evaluated in a system in which OVA protein antigen and ⁇ -GalCer were co-administered.
  • Page 3, left OVA and ⁇ -GalCer were administered to wild-type mice (C57BL / 6 background).
  • spleen cells were isolated, and CD8T cell epitopes, class I-restricted OVA peptides were used.
  • IFN- ⁇ production of antigen-specific CD8T cells was observed (FIG. 39, left).
  • Example 17 Anti-tumor effect of allo NKT cells As described above, it has been clarified that allo NKT cells exert an adjuvant effect on OVA antigen-specific CD8-positive T cells. The effect of allo NKT cells on the removal of the cells was confirmed. Mice were inoculated with EL4, a mouse lymphoma cell line, and EG7, a cell line in which OVA was forcibly expressed in EL4. Tumor diameter after tumor cell administration was measured for the following three groups: (i) C57BL / 6 wild type mice, (ii) C57BL / 6 wild type mice administered OVA and ⁇ -GalCer one week before tumor cell inoculation.
  • NKT cell therapy of the present invention and the human NKT-derived cells or the cell NKT cell bank therefor, it is possible to achieve more rapid, universal and quality control with respect to immune cell therapy that has been conventionally performed in the handicrafts. This is extremely useful in that it can provide excellent technology.
  • this banking system Through the commercialization of this banking system, the development of basic technology for human immune cell iPS that can be put to practical use, the development of applied technology that clearly clarifies the treatment of target diseases, and the bedside collaborative medical infrastructure have been established. Is used as a prototype of advanced immunotherapy technology platform utilizing iPS technology for other disease areas, and is expected to have a great ripple effect on health care in Japan and around the world. This application is filed in US provisional application no. 61 / 419,064 (filing date: December 2, 2010), the contents of which are incorporated in full herein.

Abstract

　本発明は、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を含有してなる、免疫細胞療法剤であって、該NKT細胞と、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが一致しない同種異系個体を投与対象とする剤を提供する。また、本発明は、T細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域が均一なVα-Jαに再構成されているヒト細胞または該細胞由来NKT細胞のバンクを提供する。本発明の剤や細胞バンクは、がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および／または治療に有用である。

Description

アロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域が均一なVα-Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング
　本発明は、T細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞に由来するアロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキングに関する。
　わが国ではがんによる死亡数は年間34万人以上であり、国内の死因第一位となっている（2009年厚生労働省「人口動態統計の年間推計」）。部位別のがんの死亡数は肺がんが男性で1位（48,610人）、女性で2位（18,239人）である（2008年国立がんセンターがん対策情報センター調査）。肺がん術前には、既にがん細胞が全身の至るところに転移していると考えられ、この結果、手術後であっても50%の患者が再発を引き起こすことが、部位別がん死亡数を高めていると考えられる。
　現在、免疫細胞を用いた「がん先進医療」として、患者のリンパ球を体外で活性化し、患者体内に戻す自己リンパ球移入療法やがんペプチドワクチン療法などがあるが，成果が未だ不十分である。抗腫瘍効果を期待する場合には、アジュバント作用が必須であるが、がん細胞は病原体と異なり、がん細胞自身ではアジュバント効果を持ち合わせず、通常の免疫療法では十分な治療効果が得られない場合がある。また、がん組織には「MHC分子を発現しているがん細胞」と「MHC分子を失ったがん細胞」の「二種類のがん細胞」が存在し、これら「二種類のがん細胞」を同時に排除しない限り、がんを根本的に治療することはできない。また、がんの種類を選ばず、どんながんでも標的にできる治療法の開発が必要とされている。
　本発明者らは、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）というリンパ球がアジュバント作用を示し、優れた抗がん効果を有することを明らかにし、さらにNKT細胞の活性化を介してがん細胞を攻撃する新しい治療法を開発した。即ち、NKT細胞はアジュバント作用により強力な免疫増強作用を発揮し、免疫系の他の細胞（NK細胞、CTL等）を動員してがん細胞を死滅させるが、その際にNKT細胞を活性化する合成糖脂質α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）でパルスした樹状細胞をがん患者に投与する、「アジュバント免疫細胞療法」が有効であることを最近明らかにしている。
　これまでに、進行肺がんまたは再発肺がんの症例17例に対して、上述のアジュバント免疫細胞療法についての第I、II相の臨床試験を終了し、その結果、初回治療だけで、すべての症例において生存期間の延長（平均19ヶ月）が認められ、現在使用されている分子標的薬による治療（平均約10ヶ月）と比較しても、有意な期間延長がみられた。この治療法によく反応した患者（全症例の60%）の生存期間の中央値は31.9ヶ月であり、分子標的薬治療の3倍以上を示した。それ以外の症例でも平均生存期間は9.6ヶ月であり、分子標的薬治療と同等の効果であった（非特許文献１）。
　しかし、進行肺がんおよび再発肺がん患者の約2/3はNKT細胞数が減少しており、本治療のエントリー基準を満たしていない。そのため、本治療の対象となり得る患者は全体の約1/3にすぎない。
　患者本人から採取したNKT細胞を試験管内で増加させる技術が開発されれば、アジュバント免疫細胞療法は、より広範な患者を対象とした効果的な治療法となることが期待される。しかし、NKT細胞は、正常でも末梢血リンパ球の0.1%以下とごく少量しか存在せず、さらに、がん患者ではNKT細胞の機能自体が減少している場合もある。また、治療に十分な数のNKT細胞を試験管内で効率よく増幅させる技術は未だ確立されていない。
　採取したNKT細胞を初期化等して大量増幅させた後、再度分化・成熟させることにより、大量にNKT細胞クローンを得ることができれば、NKT細胞免疫療法の治療効果を向上させることができると期待される。
　本発明者らは、NKT細胞の核を移植したES細胞を試験管内でNKT細胞へ分化させることにより、大量にNKT細胞を製造することに成功した（特許文献１）。
　また、本発明者らは、マウス脾臓由来のNKT細胞にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの4因子を導入することにより、T細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域がVα14-Jα18に再構成されており、かつiPS細胞に特徴的な性質を備えた細胞（以下、「NKT-iPS細胞」と称する）を樹立すること、さらに、該iPS細胞から機能的な成熟NKT細胞（以下、「iPS-NKT細胞」と称する）へと分化させることに、世界で初めて成功した（特許文献２、非特許文献２）。通常、最終分化した細胞は、未分化な細胞に比べて初期化が容易ではない。B細胞やT細胞においては、4因子あるいは3因子（Oct3/4、Sox2、Klf4）のみではiPS細胞を誘導できず、核初期化因子として他の遺伝子の使用（非特許文献３）やp53阻害（非特許文献４）を必要とするとの報告があることから、NKT細胞から4因子のみでiPS細胞を樹立できたことは意外な知見である。導入遺伝子の数を増やしたり、がん抑制遺伝子であるp53を阻害したりすることは、iPS細胞から分化させた細胞の腫瘍化リスクを増大させるなど安全性の面で問題があるため、本発明者らの成果は、iPS細胞の免疫細胞療法への利用可能性の期待を拡げるものといえる。
　とはいえ、iPS細胞由来の分化した細胞を移植医療に繋げるには、まだまだ解決すべき課題が山積している。中でも最大の課題の１つは、生着した細胞・組織の腫瘍化リスクを排除する等の安全性の確保である。この点に関し、プラスミド、アデノウイルス、センダイウイルス等の非組込み型ベクターを用いる方法やタンパク質導入や低分子化合物を用いた初期化方法の改良、高品質なiPS細胞を選別したり、未分化細胞の混入を防止したりする方法の開発などが進められている。しかしながら、これらの研究は、いずれも「移植医療＝生着」という大前提の上に立つものである。
　一方、移植医療における合併症の一つとして移植片対宿主病（graft versus host disease; GVHD）が知られている。これは、ドナー（臓器提供者）の臓器が、免疫応答によってレシピエントの臓器を攻撃することによって起こる症状の総称である。GVHDは様々な他家臓器移植の後に発生するが、特に免疫組織を直接移植する、造血幹細胞移植（骨髄移植）後や輸血後のものが知られている。この血液移植に伴うGVHDは急性のものと慢性のものがあり、それぞれの発症機構に関しては前者においてはリンパ球が関わっている事、後者にはより多くの免疫機能が関わっている事が推測されている。
　NKT細胞はリンパ球の一種に位置づけられ、T細胞抗原受容体α鎖とβ鎖を発現する細胞によって定義づけられるαβＴ細胞のうち、T細胞抗原受容体がヒトにおいてα鎖がVα24-Jα18、β鎖がVβ11、マウスにおいてα鎖がVα14-Jα18、β鎖がVβ8/7/2、を発現すると言う特徴を持つ亜群に分類され、CD4陽性とCD4陰性の細胞が含まれている（非特許文献５）。これまでにレシピエント側のNKT細胞がGVHDの発症において抑制的に働くと言う報告はある（非特許文献６～８）。一方、ドナー由来のアロNKT細胞に関しては、他のアロリンパ球細胞と合わせた移植実験において、条件によっては抑制的に働くと言う報告はあるものの（非特許文献９）、アロNKT細胞のみを移植した際にGVHDを発症するか否かに関しての報告はない。また、本発明者らの研究によって、体内で正常に分化したアロＮＫＴ細胞とin vitroで多能性幹細胞から分化させたアロＮＫＴ細胞は遺伝子発現が相違する事がわかっており（非特許文献２）、この様な多能性幹細胞から分化させたＮＫＴ細胞とＧＶＨＤとの関係に関する報告は一切ない。
国際公開第2008/038579号パンフレット（2008年4月3日公開） 国際公開第2010/027094号パンフレット（2010年3月11日公開）
Motohashi S. et al., J. Immunol., 2009; 182: 2492-2501 Watarai, H. et al., J. Clin. Invest., 2010 Jun 1;120(7):2610-2618 Hanna, J. et al., Cell, 2008 Apr 18; 133(2): 250-264. Erratum in: Cell. 2008 Jul 25; 134(2): 365 Hong, H. et al., Nature, 2009 Aug 27; 460(7259): 1085-1086 Taniguchi M et al., Int. Immunol., 2010; 22: 1-6 Hashimoto, D. et al., The Journal of Immunology, 2005; 174; 551-556 Haraguchi, K. et al., The Journal of Immunology, 2005; 175; 1320-1328 Pillai, A.B. et al., The Journal of Immunology, 2007; 178; 6242-6251 Leveson-Gower, D.B. et al., blood, 2011 117: 3220-3229
　本発明の目的は、免疫細胞療法の特徴を生かした、全く新規な発想の下でのヒトNKT細胞に由来するT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング、及びそれを利用した移植治療法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するにあたり、免疫細胞を通常の医薬と同様に使用するという新規な治療戦略をうち立てた。通常の医薬品は生体にとっては異物であり、長く体内に留まり過ぎると反って生体に悪影響を及ぼすので、所望の治療効果を発揮した後は、速やかに体外に排泄あるいは代謝分解されることが望ましい。免疫細胞療法の場合も、臓器移植のような他の移植治療とは異なり、免疫細胞を補充および／または活性化して標的となる疾患細胞を攻撃して効果を発揮した後は、移植細胞は必ずしも生着して患者体内に留まる必要はない。末期のがん患者では、患者本人から必要なリンパ球だけを必要な数採取することは容易ではないので、同種異系（アロ）細胞を用いることにより現実味がある。しかし、既成概念に基づけば、完全に生着させるべく主要組織適合性抗原（MHC）の型が実質的に一致するドナーから移植することが当然であった。すなわち、アロの移植細胞は患者の免疫系によって拒絶されるので、長期間生着させるためには、患者とMHCの型が一致するドナー由来の細胞を移植に用いるのが常識的であった。
　本発明者らが着目した点は、MHCの型がレシピエントとは不一致のアロNKT細胞を移植すれば、移入細胞側はアロ免疫反応により拒絶されるので、移入細胞の長期間の滞留により生じる可能性がある副作用の発生を回避し得ることである。すなわち、移入したNKT細胞はアロ免疫反応により一定期間を経ると宿主免疫系によって体内から排除されるため、長期にわたって宿主体内に留まることなく、一時的な薬剤としての効果を発揮することが期待できる。
　一方、アロNKT細胞を移植する際にはGVHDの発症の有無はその安全性において非常に重要である。前述の通り、これまでに体内で正常に分化させたアロNKT細胞のみを移植した場合のGVHD発症の有無はもちろん、in vitroで多能性幹細胞から分化させたアロNKT細胞のみを移植した場合のGVHD発症の有無については報告が無い。そのため、T細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域が均一な細胞から分化させたアロNKT細胞のみを用いた移植医療の安全性を検証する必要があった。
　そこで、本発明者らは上記の仮説を実証すべく、本発明者ら自身が確立した、受容体遺伝子再構成を終えたNKT細胞からiPS細胞を樹立し、さらに該iPS細胞から成熟NKT細胞を分化誘導する技術を応用し、レシピエントとMHCの型が不一致の個体からNKT細胞を採取して、iPS細胞を樹立し、さらに成熟NKT細胞へと分化させた。得られたiPS-NKT細胞をレシピエントに移植したのち、α-GalCerで刺激し、移入細胞のアジュバント作用および抗腫瘍効果を調べたところ、強力なアジュバント効果と腫瘍の増殖抑制効果が観察された。さらに、移植したiPS由来NKT細胞は顕著な治療効果を示すのに十分な期間レシピエント体内に留まった後、レシピエントの免疫系により拒絶されて排除された。また、T細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域が均一な細胞から分化させたアロNKT細胞のみを移植した際のGVHDの発症の有無を検証するため、免疫系の細胞を有さないレシピエント(RAG欠損マウス、BALB/cバックグラウンド)にin vitroでC57BL/6バックグラウンドのNKT細胞から樹立したiPS細胞から再分化させたNKT細胞を移植した。その結果、対象群として用いた脾臓より単離したC57BL/6バックグラウンドのアロCD4陽性ヘルパーT細胞ではGVHDが発症したが、NKT細胞から樹立したiPS細胞から再分化させる事によって調製したアロNKT細胞ではGVHDは発症しなかった。この方法によれば、ドナーとレシピエントの間でMHCを一致させる必要がないのでドナーを得るのが容易であり、さらにiPS細胞由来NKT細胞の安全性の問題をも解決し得る。また、移植に伴うGVHDの発症を伴わないので安全である。以上の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を含有してなる、免疫細胞療法剤であって、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、剤。
［２］T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、上記［１］記載の剤。
［３］多能性幹細胞がES細胞である、上記［２］記載の剤。
［４］ES細胞がヒトES細胞である、上記［３］記載の剤。
［５］HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトES細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、上記［４］記載の剤。
［６］多能性幹細胞がiPS細胞である、上記［２］記載の剤。
［７］iPS細胞がヒトiPS細胞である、上記［６］記載の剤。
［８］多能性幹細胞がNKT細胞由来である、上記［２］記載の剤。
［９］NKT細胞がヒトNKT細胞である、上記［８］記載の剤。
［１０］HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、上記［９］記載の剤。
［１１］HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、上記［５］または［１０］記載の剤。
［１２］NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞と組み合わせてなる、上記［１］～［１１］のいずれかに記載の剤。
［１３］NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、上記［１２］記載の剤。
［１４］がん、感染症、アレルギー疾患、または自己免疫疾患の予防および／または治療用である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の剤。
［１５］T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体に有効量投与することを含む、該個体に対する免疫細胞療法。
［１６］T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、上記［１５］記載の方法。
［１７］多能性幹細胞がES細胞である、上記［１６］記載の方法。
［１８］ES細胞がヒトES細胞である、上記［１７］記載の方法。
［１９］多能性幹細胞がiPS細胞である、上記［１６］記載の方法。
［２０］iPS細胞がヒトiPS細胞である、上記［１９］記載の方法。
［２１］多能性幹細胞がNKT細胞由来である、上記［１６］記載の方法。
［２２］NKT細胞がヒトNKT細胞である、上記［２１］記載の方法。
［２３］HLA遺伝子座のうち、少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、上記［２２］記載の方法。
［２４］HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、上記［２３］記載の方法。
［２５］前記個体に、NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞を有効量投与することをさらに含む、上記［１５］～［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、上記［２５］記載の方法。
［２７］がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および／または治療用である、上記［１５］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているヒトNKT細胞由来細胞または該細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞のバンク。
［２９］以下の（１）～（４）の工程を含む、上記［２８］記載のバンクの構築方法：
（１）ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座のジェノタイプを確定する工程；
（２）ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程；
（３）該NKT細胞から、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているヒト細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒト細胞からヒトNKT細胞を樹立する工程；
（４）樹立ヒト細胞からNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たしたヒト細胞または該細胞由来NKT細胞を順次バンキングする工程。
［３０］
（１）ヒトNKT細胞の投与を必要とする患者と、少なくとも1つのHLA遺伝子座のジェノタイプが一致しないヒトNKT細胞から樹立したT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞または該細胞由来NKT細胞を、上記［２８］に記載のバンクから分譲を受けること、
（２）（１）においてヒトNKT細胞から樹立したT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞の分譲を受けた場合、該細胞を成熟NKT細胞に分化誘導すること、
（３）該患者に、上記（１）又は（２）で得たヒトNKT細胞の有効量を、投与することを含む、免疫細胞療法。
［３１］前記患者に、NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞を有効量投与することをさらに含む、上記［３０］記載の方法。
［３２］NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、上記［３１］記載の方法。
［３３］がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および／または治療用である、上記［３０］～［３２］のいずれかに記載の方法。
　本発明は、移植細胞を通常の医薬と同様に、適切な期間体内に存在して薬効を発揮した後、消失するような態様で利用するという全く新規な発想に基づくものである。ドナーとレシピエントとの間でHLAが一致しない場合、ホスト免疫系により移入した細胞が排除されるという性質を利用する。例えば、A、B、C遺伝子座が完全に一致しないヒト（ドナー）NKT細胞からiPS細胞を樹立して維持及び増幅し、用時このiPS細胞からNKT細胞への分化を誘導し、得られたNKT細胞を患者（レシピエント）に移植する。すると、移植されたNKT細胞はレシピエントとは異なるA、B、Cのハプロタイプを有するので、生着せず、ホスト免疫系により排除され、その間に十分なアジュバント効果を発揮し得ると期待される。
　本発明によれば、NKT細胞数が減少しているために、従来はアジュバント免疫細胞療法のエントリー基準を満たさなかった進行がんおよび再発がん患者に対しても、当該治療を実施することが可能となる。
　NKT細胞は、正常のアロ個体へ移入してもアロ免疫反応により拒絶されるので、安全に免疫細胞療法を実施することが出来る。
　T細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞から分化したNKT細胞はアロ個体へ移入した際にGVHDを引き起こさないため、GVHDに起因する副作用を回避することができる。
　染色体上のTCRα鎖領域がNKT細胞特異的な態様で均一に再構成されている細胞からはNKT細胞が選択的に誘導される。従って、該細胞から誘導したNKT細胞を本発明の免疫細胞療法へ用いれば、通常のアロT細胞が混入する可能性を回避し、重篤なGVH反応が生じるリスクを抑制することができる。
　本発明の免疫細胞療法においては、ドナーとレシピエントのHLAを一致させなくてもよいので、ドナーを容易に獲得することが出来る。従って、ドナーから提供されたNKT細胞から誘導したiPS細胞等のT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞あるいは該細胞由来NKT細胞をバンキングすることにより、NKT細胞を安定的に供給することができる。どのようなHLAタイプのT細胞抗原受容体（TCR）遺伝子のα鎖（TCRα）領域が均一なVα-Jαに再構成されているヒトNKT細胞由来細胞あるいは該細胞由来NKT細胞も同じ効果が期待できるため、これらをバンキングすることにより、あらゆるHLAタイプの患者に対して有効なアロNKT細胞を即座に調製し、治療に用いることが可能となる。
ワイルドタイプおよびNKT細胞のTCRα遺伝子座の模式図である。 NKT-iPS細胞におけるVα-Jα再構成を示す図である。 NKT-iPS細胞におけるES細胞特異的遺伝子の発現を示す図である。 NKT-iPS細胞とNKT-ES細胞あるいはES細胞との間、およびNKT-iPS細胞とワイルドタイプ脾臓NKT細胞との間における遺伝子発現プロファイルの相関を示す図である。 NKT-iPS細胞の形態並びにSSEA1およびOct3/4遺伝子の発現における、MEF由来iPS細胞、またはES細胞との類似性を示す図である。 C57BL/6マウス由来NKT-iPS細胞クローン2aとBalb/Cマウス由来細胞とから作製したNKT-iPSキメラマウスの脾臓細胞における、各マウス由来細胞でのTCRα/βの発現の様子を示す図である。 NKT-iPS細胞からのDP-NKT細胞の試験管内分化誘導を示す図である。 DP-NKT細胞の表現型解析の結果を示す図である。 NKT-iPS細胞からの末梢NKT細胞と同様の表現型を示すNKT細胞の試験管内分化誘導を示す図である。 サイトカインの組み合わせによるDP-NKT細胞からのNKT細胞の大量増幅を示す図である。 DP-NKT細胞を、各種サイトカインの組み合わせで（Ａ）Notchリガンドを発現しない/（Ｂ）発現するストローマ細胞と共培養して得られる細胞における、インバリアントTCRαの発現、CD4/CD8の発現、およびNK1.1の発現を示す図である。 NKT-iPS細胞より分化誘導したNKT細胞のα-GalCer応答性を示す図である。 NKT-iPS細胞より分化誘導したNKT細胞の生体内アジュバント効果を示す図である。 C57BL/6ワイルドマウス脾臓細胞からのiPS細胞の樹立を示す図である。 C57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスの作製を示す図である。 C57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスのT細胞レセプター領域の塩基配列を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン７aおよび7gの遺伝子再構成解析を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gの遺伝子発現解析を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gのDNAマイクロアレイ解析と相関解析を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gの形態学的観察およびES細胞マーカーの発現を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gのDNAメチル化解析を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gの子孫伝達を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gからの試験管内NKT細胞分化誘導方法を示す図である。 NKT-iPS細胞クローン7aおよび7gより試験管内で分化誘導された細胞の細胞表面マーカーの発現を示す図である。 試験管内で分化誘導された細胞7a dif.および7g dif.の網羅的遺伝子発現相関解析を示す図である。 試験管内で分化誘導された細胞7a dif.および7g dif.の試験管内での機能解析を示す図である。 NKT細胞欠損マウスに、試験管内で分化誘導された細胞7a dif.および7g dif.を移入後、1週間（1w）および2週間（2w）における移入細胞の存在を確認した図である。 試験管内で分化誘導された細胞7a dif.および7g dif.の生体内評価のプロトコルを示す図である。 試験管内で分化誘導された細胞7a dif.および7g dif.による抗原特異的CD8陽性T細胞の誘導を示す図である。 試験管内で分化誘導された細胞7a dif.および7g dif.による悪性腫瘍拒絶を示す図である。 野生型NKT細胞からの効率的なiPS細胞樹立方法を示す図である。 NKT-iPSクローン14kの性質を示す図である。 NKT-iPSクローン14kより分化誘導した細胞の試験管内機能評価を示す図である。 サイトカインの組み合わせによるDP-NKT細胞からのNKT細胞の大量増幅を示す図である。 DP-NKT細胞を、各種サイトカインの組み合わせでNotchリガンドを発現するストローマ細胞と共培養して得られる細胞における、インバリアントTCRα、TCRβ、CD3εおよびNK1.1の発現を示す図である。 NKT-iPS細胞より分化誘導したNKT細胞のα-GalCer応答性を示す図である。 iPS細胞から誘導したアロのNKT細胞がGVHDを誘導しないことを示す図である。 NKTクローンマウスのアロNKT細胞がGVHDを誘導しないことを示す図である。 セミアロNKT細胞のCD8T細胞へのアジュバント効果を示す図である。 抗原特異的抗腫瘍作用に対するセミアロNKT細胞のアジュバント効果を示す図である。
　本発明の免疫細胞療法剤は、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されており、かつ自己増殖能およびNKT細胞への分化能を有する細胞（但し、NKT細胞は除く）からin vitroで分化誘導させて得られるNKT細胞を有効成分として含有する。この様な細胞は、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている限り特に限定されないが、例えば、再構成が終了しているNKT細胞から樹立したiPS細胞（即ち、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されており、かつ自己増殖および分化多能性を有し、ES細胞様の遺伝子発現パターンを示す等のiPS細胞に特徴的な性質を備えた細胞（NKT-iPS細胞））、多能性幹細胞にNKT細胞特異的なTCR遺伝子のα鎖及びβ鎖が発現できるように遺伝子挿入を行う事によってTCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているあるいはNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαがゲノム上特定領域に挿入されそれを発現し得る多能性幹細胞、NKT細胞の核移植胚から樹立される多能性幹細胞、再構成が終了しているNKT細胞から樹立され、少なくともNKT細胞への再分化能を有する細胞（例、血液幹細胞）等が挙げられる。
　本明細書において、「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化多能性（pluripotency））を有する幹細胞をいう。多能性幹細胞には、iPS細胞、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）等が包含される。
　本発明においては、通常哺乳動物の細胞が用いられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）であり、より好ましくはマウス又はヒトである。
　本明細書において「iPS細胞」とは、体細胞に核初期化因子を接触させることにより、人為的に分化多能性および自己複製能を獲得した細胞であって、遺伝子発現プロファイルがES細胞と類似する細胞をいう。ここで「分化多能性」とは、NKT細胞、T細胞、B細胞、赤血球、マクロファージまたはその前駆細胞などの複数の系列の造血・免疫系細胞、並びに１以上の造血・免疫系以外の細胞系列に分化し得る能力を意味し、造血幹細胞や多能性前駆細胞における多能性とは区別される。また「自己複製能」とは、細胞が特定の環境（例えば、ES細胞の培養に適した条件）下において、上記「分化多能性」を保持したまま増幅し続けることができる能力を意味する。さらに、「遺伝子発現プロファイルがES細胞と類似する」とは、対象の細胞における遺伝子発現データ群とES細胞における遺伝子発現データ群との相関係数rが0.9以上であることを意味する。比較対象となるES細胞としては、同一種、好ましくは同一系統由来の受精卵から作製されるES細胞や、NKT細胞の核移植胚から作製されるES細胞等が挙げられる。
　本発明のNKT-iPS細胞は、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されており、かつ自己増殖能および分化多能性を有し、ES細胞様の遺伝子発現パターンを示す等のiPS細胞に特徴的な性質を備えた細胞であり得る。用語「NKT細胞受容体特異的な態様」については、後述する。
　本発明のNKT-iPS細胞は、NKT細胞等の、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている体細胞に核初期化因子を接触させることにより樹立することができる。本明細書において「NKT細胞」とは、TCRα領域の片方が均一なVα-Jαに再構成されている限り特に限定されず、成熟NKT細胞（例えば、NK1.1+/CD3ε+で特徴付けられる）だけでなく、その前駆細胞（例えば、CD4+/CD8+で特徴付けられる細胞等）をも含む意味で用いられる。NKT細胞は脾臓、リンパ節、末梢血、臍帯血などから、自体公知の方法、例えば、上記細胞表面マーカーに対する抗体又はα-ガラクトシルセラミドをパルスしたCD1dの多量体（二量体、四量体等）とセルソーターとを用いてフローサイトメトリーにより、単離することができる。マウスの場合は、NKT細胞の存在割合が高い脾臓やリンパ節から採取することが好ましいが、ヒトの場合、侵襲性が少なく調製が容易との観点から、末梢血、臍帯血などからNKT細胞を調製することが望ましい。
　本発明のNKT-iPS細胞作製に用いることができるNKT細胞は、当該NKT細胞に核初期化因子を接触させることによりNKT-iPS細胞を樹立することができるいかなる動物種由来のものであってもよく、具体的にはヒトおよびマウス由来のものが挙げられるが、好ましくはヒト由来のNKT細胞である。NKT細胞の採取源となるヒトまたはマウスは、免疫細胞療法の対象である個体と、MHCの主要遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが一致しない同種異系個体、好ましくは全ての座のジェノタイプが一致しない同種異系個体である。このように、両者のMHC遺伝子座の少なくとも1座のジェノタイプが一致しないことにより、投与されたNKT細胞はレシピエントの免疫系により認識され、最終的に排除される。MHC遺伝子座としては、通常のヒト臓器移植の場合、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cの３遺伝子座の一致・不一致が適合の基準となる。したがって、通常、これらの３遺伝子座のうち少なくとも１座がレシピエントと異なる個体がドナーとして選ばれる。マウスの場合も同様に、クラスI領域のH-2K、H-2DおよびH-2L遺伝子座を、本発明における主要遺伝子座として挙げることができる。
　一態様において、上記の3遺伝子座のうち、少なくとも1座（好ましくは2座、より好ましくは3座）のジェノタイプが、免疫細胞療法の対象である個体と異なる個体由来のNKT細胞が用いられる。この態様においては、MHC遺伝子座の不一致により、投与されたNKT細胞はレシピエントのアロ免疫反応により排除されるので、アジュバント効果等の作用を効果的に発揮した後で、排除されることが期待される。特に、移入されたNKT細胞を、アロのレシピエントにより排除させる観点から、上記3遺伝子座の全てのジェノタイプが、免疫細胞療法の対象である個体と異なる個体由来のNKT細胞を用いるのが好ましい。
　末梢血、臍帯血、脾臓、リンパ節などから、上述の方法により調製したNKT細胞は、直ぐに核初期化因子と接触させてNKT-iPS細胞を誘導してもよいし、あるいは常法により凍結保存し、用時融解して培養した後に核初期化因子と接触させて、NKT-iPS細胞を誘導することもできる。
　NKT細胞は、TCRα領域の片方が均一なVα-Jα（ヒトではVα24-Jα18、マウスではVα14-Jα18）に再構成されていることを特徴とする機能的に均一と考えられる免疫担当細胞である。本発明のNKT-iPS細胞においては、NKT-TCRへの再構成が保存されている。
　また、本発明のNKT-iPS細胞は、NKT細胞以外の体細胞であっても、理論的には該体細胞から得られるiPS細胞に由来する細胞の中からT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているものを選び、該体細胞に核初期化因子を接触させることによって樹立することができる。しかし、遺伝子再構成で得られるNKT細胞特異的受容体（Va24-Ja18）の出現頻度は約1/106なので、NKT細胞から直接iPS細胞を誘導するのが、NKT-iPS細胞を効率よく製造する方法である。ここで、NKT細胞受容体とは、NKT細胞に特異的に発現しており、CD1d上に提示されたα-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）を特異的に認識する、T細胞受容体である。NKT細胞受容体のα鎖は、通常、ヒトではVα24-Jα18、マウスではVα14-Jα18に再構成されている。従って、NKT細胞受容体特異的な態様での再構成とは、T細胞抗原受容体のα鎖領域におけるV-Jの組み合わせが、ヒトにおいてはVα24-Jα18、マウスにおいてVα14-Jα18であって、得られるTCRαがNKT細胞受容体を構成することのできるような、α鎖領域の遺伝子再構成を意味する。そのような体細胞は、自体公知の方法により作製することができる。例えば、このような体細胞は、NKT細胞の核を、除核した細胞（例、卵母細胞）に移植し、所定の操作に付すことによりNKT細胞クローン動物を作製し、該動物から採取された体細胞であり得る。クローン動物の作製は、例えば、WO2006/018998などに記載されている。ヒトの場合には、クローン人間を作製することはできないが、NKT細胞核移植によりヒトクローン胚を作製し、試験管内で任意の体細胞に分化誘導することは、理論的には可能である。
　本発明において「核初期化因子」とは、NKT細胞等の体細胞から分化多能性および自己複製能を有する細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化因子がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
　本発明は、NKT-iPS細胞から再分化誘導したiPS-NKT細胞を免疫細胞療法に用いるものであるから、これらの組み合わせの中でも、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせがより好ましい。しかし、本発明はまた、移入したNKT細胞を生着させずに一定期間経過後には宿主体内から消失させることを目的とするものであるから、NKT細胞が体内に留まる期間内に、腫瘍化などの好ましくない影響を宿主に及ぼさない限りにおいて、通常の臓器移植ではリスクファクターとなり得る他の初期化因子（例えば、c-Myc）を用いることを妨げない。従って、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-MycあるいはN-Mycの4因子か、それにLin28またはNanogを加えた5因子もまた、核初期化因子として好ましい。
　本発明においては、線維芽細胞などの初期化に通常使用される上記核初期化因子のみでNKT-iPS細胞を取得することができ、従来、T細胞やB細胞の場合において報告されているような他の因子の使用を必要としない。このことにより、NKT-iPS細胞から分化誘導される細胞、組織における腫瘍化の潜在的可能性を少なくすることができる。
　上記の各タンパク性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれNCBI accession number NM_145833及びNM_024674を参照することにより、L-Mycのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれNCBI accession number NM_008506及びNM_001033081を参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。核初期化因子としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化因子としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
　核初期化因子のNKT細胞等の体細胞への接触は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）もしくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
　タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化因子を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
　PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化因子のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
　PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
　マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
　タンパク質導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回または4回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば6～48時間、好ましくは12～24時間が挙げられる。
　iPS細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化因子を、タンパク質としてではなくそれをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
　核初期化因子のcDNAは、宿主となるNKT細胞等の体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。
　用いるベクターの種類は、得られるNKT-iPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用され得る。
　発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　核初期化因子である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。
　核初期化因子が低分子化合物である場合、該化合物のNKT細胞等の体細胞への接触は、該化合物を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離したNKT細胞等の体細胞の培養に適した培地（例えば、IL-2、IL-7、SCF、Flt3リガンド等のサイトカイン類、約5-20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化因子濃度がNKT細胞等の体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該化合物溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化因子濃度は用いる核初期化因子の種類によって異なるが、約0.1nM-約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
　また、核初期化因子をNKT細胞に接触させることで本発明のNKT-iPS細胞を作製する場合、核初期化因子と接触されるNKT細胞は、IL-2およびIL-12の存在下で抗CD3抗体および抗CD28抗体によって刺激されたものであってもよい。NKT細胞の刺激は、例えば、上述したようなNKT細胞の培養に適した培地中に、IL-2およびIL-12を添加し、抗CD3抗体および抗CD28抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上でNKT細胞を一定期間培養することによって行うことができる。抗CD3抗体および抗CD28抗体は、NKT細胞を刺激し得ることができるのであれば、培地に溶解した態様で用いてもよい。プレートに結合させた時の各抗体の濃度は0.1-100μg/mlであり、培地に溶解した態様で用いる時の各抗体の濃度は0.1-100μg/mlである。添加されるIL-2およびIL-12の濃度としては、それぞれ例えば0.1-100ｎg/mlの範囲で適宜選択される。また、培養期間としては、NKT細胞の増殖および抗CD3抗体および抗CD28抗体による刺激のために十分な時間であれば特に制限されないが、通常3日間～1ヶ月程度、例えば１週間である。このような工程により刺激されたNKT細胞を核初期化因子と接触させる。
　従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化因子に加え、これら樹立効率改善物質をNKT細胞等の体細胞に接触させることにより、NKT-iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　iPS細胞の樹立効率改善物質のNKT細胞等の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化因子についてそれぞれ上記したのと同様の方法により、実施することができる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較してNKT細胞等の体細胞からのNKT-iPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化因子と同時にNKT細胞等の体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化因子がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化因子とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
　ヒトまたはマウスから分離したNKT細胞等の体細胞は、その培養に適した自体公知の培地（例えば、IL-2、IL-7、IL-15、SCF、Flt3リガンド等のサイトカイン類、約5-約20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）で前培養することも可能である。
　核初期化因子（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化因子（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。ヒト細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を添加して培養を行うことが好ましい。一方、マウス細胞の場合には、bFGFの代わりにLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。
　NKT-iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え型のNKT細胞等の体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、本発明はNKT-iPS細胞をヒトの治療用途に適用することを目的とするので、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましく、また、目視による形態観察によっても十分効率よくNKT-iPS細胞の候補コロニーを選択することができる。
　選択されたコロニーの細胞がNKT-iPS細胞であることの確認は、自体公知の種々の試験方法、例えばES細胞特異的遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2、Nanog、Cripto、Dax1、ERas、Fgf4、Esg1、Rex1、Zfp296等）を含む遺伝子群の発現を、RT-PCRやDNAマイクロアレイ等を用いて測定し、その発現プロファイルを、ES細胞（例えば、受精卵由来のES細胞、NKT細胞からの体細胞核移植により得られるクローン胚由来のES細胞等）における遺伝子発現プロファイルと比較することにより行うことができる。さらに正確を期す場合は、選択された細胞を分化誘導して胚葉体形成を確認するか、マウスに移植してテラトーマ形成を確認すればよい。
　また、NKT-iPS細胞がNKT細胞等の、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている体細胞由来であることの確認は、NKT-TCRへの遺伝子再構成の有無を、ゲノミックPCRにより調べることにより行うことができる。
　NKT-iPS細胞の製造方法の詳細については、WO 2010/027094に記載されている。
　多能性幹細胞にNKT細胞特異的なTCR遺伝子のα鎖及びβ鎖が発現できるように遺伝子挿入を行う事によってTCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている、あるいはNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαがゲノム上特定領域に挿入されそれを発現し得る多能性幹細胞は、例えば、特許第3030092号に記載された方法に従って、NKT細胞からNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されたTCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域を含む染色体断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、多能性幹細胞へ前記染色体断片を移入したり、定常的に発現が可能なゲノム領域（ヒトAAVS1領域など）に移入することにより製造することができる。この染色体断片の調製に用いることができるNKT細胞の態様は、NKT-iPS細胞作製に用いることができるNKT細胞として上述した通りである。
　NKT細胞の核移植胚から樹立される多能性幹細胞は、NKT細胞の核を、除核した細胞（例、卵母細胞）に移植し、所定の操作に付すことによりNKT細胞クローン動物を作製し、該クローン動物同士を交配することにより得られる初期胚の内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することによりES細胞を樹立することにより得ることができる。クローン動物の作製は、例えば、WO2006/018998などに記載されている。ヒトの場合には、クローン人間を作製することはできないが、NKT細胞核移植によりヒトクローン胚を作製し、試験管内で内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することによりES細胞を樹立することは、理論的には可能である。
　再構成が終了しているNKT細胞から樹立され、少なくともNKT細胞への再分化能を有する細胞は、ダイレクトリプログラミングにより確立しうる。ダイレクトリプログラミングとは、転写因子等の遺伝子をNKT細胞に導入する、培養液中に分化を誘導する化学物質を添加する事等により、NKT細胞よりも維持・増殖等が容易であって、NKT細胞への再分化が可能な細胞を樹立することをいう。ダイレクトリプログラミングの例としては、例えば線維芽細胞にOct4, Sox2, Klf4およびc-Mycを遺伝子導入し、神経細胞の誘導に適した培養条件で培養する事により神経幹細胞を得たと言う報告がある（Kim et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108, 7838-7843 (2011))。また、同様のダイレクトリプログラミングをNKT細胞に行い、ダイレクトリプログラミングの結果得られた少なくともNKT細胞への再分化能を有する細胞が分化の多様性を持つ細胞であった場合には、T/NKT細胞の誘導に適した条件で培養することにより、NKT細胞を大量に得ることもできることが報告されている（Watarai et al. J Clin Invest, 120, 2610-2618, 2010））。
　その他、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されており、かつ自己増殖能およびNKT細胞への分化能を有する細胞としては、TCR遺伝子のα鎖（TCRα）領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成された造血幹細胞をあげることができる。該造血幹細胞は、例えば、上記のNKT-iPS細胞やNKT-PS細胞を、造血幹細胞への分化条件下で培養する、あるいはNKT細胞を造血幹細胞へダイレクトリプログラミングすることにより得ることができる。NKT-iPS細胞やNKT-PS細胞から造血幹細胞への分化条件としては、Lhx2の強制発現（Kitajima et al., Blood, 117(14), 3748-3758 (2011)）、in vivoでの分化誘導（In vivo evaluation of putative hematopoietic stem cells derived from human pluripotent stem cells. Hexum MK, Tian X, Kaufman DS. Methods Mol Biol. 2011;767:433-447.）等を挙げることができる。
　このようにして樹立されたT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞（以下、NKT-derived細胞と略する）のうち多能性幹細胞として定義づけられる細胞（以下、NKT-PS細胞と略する；例、NKT-iPS細胞）は、ES細胞での報告に基づき、IL-7やFlt3リガンドなどのサイトカインの存在下、Notchリガンドを発現するストローマ細胞をフィーダー細胞として培養することにより、CD4/CD8ダブルポジティブNKT細胞に分化させることができる。さらに、後述の方法を用いることにより、機能的な成熟NKT細胞まで試験管内で分化させることができる。
　好ましい一実施態様において、NKT-derived細胞（例、NKT-iPS細胞）は、例えばNKT細胞免疫療法剤のソースとしての利用のために、α-GalCer等のNKT細胞受容体リガンドの刺激により活性化される、機能的な成熟もしくは未成熟なNKT細胞に生体外で分化させられる。
　例えば、NKT-derived細胞としてNKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）を用いる場合、まず、NKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）を、Notchリガンドを発現するストローマ細胞と共培養することにより、CD4/CD8ダブルポジティブNKT細胞（以下、「DP-NKT細胞」ともいう）を作製することができる。ストローマ細胞としては、Notchリガンド（例、Delta-like 1；以下「Dll-1」ともいう）を強制発現させたOP9細胞、S17細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。分化誘導用の培地としては、例えば、インターロイキン-2（IL-2）、IL-7、IL-15、幹細胞因子（SCF）、Flt3リガンド（FL）等のサイトカイン類（それぞれ0.1-10ng/mL、好ましくは1-5ng/mL）、約5-約20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、これらに限定されない。培養は、自体公知の培養容器中にNKT-iPS細胞を、例えば約1.0x106-約1.0x107細胞/mLの細胞密度となるように播種し、5% CO2/95% 大気の雰囲気下、約30-約40℃、好ましくは約37℃で、約1-約4週間、好ましくは約2-約3週間行われる。DP-NKT細胞に分化したことの確認は、例えば、細胞表面マーカーに対する抗体（例えば、CD4およびCD8に対する各抗体、CD3, TCRb等に対する抗体）及びα-ガラクトシルセラミドをパルスしたCD1dの多量体（二量体、四量体等）とセルソーターを用いて、細胞の表面抗原の表現型を解析することにより行うことができる。必要に応じて、さらに他の各種細胞表面抗原の発現についても調べ、その表現型を、例えば胸腺内に存在するCD4+/CD8+細胞のそれと比較することもできる。
　上記のようにして得られるDP-NKT細胞を、IL-2、IL-7、IL-15、IL-15RalphaおよびFLから選ばれる数種類のサイトカインの存在下で、ストローマ細胞と共培養することにより、NKT細胞を大量に増幅することができる。この際使用するストローマ細胞としては、例えばOP9細胞やS17細胞等の上記と同様のものが挙げられるが、該細胞はNotchリガンドを発現していてもよいし、発現していなくてもよい。培地としては、サイトカインの組み合わせを除けば、上記と同様のものが好ましく例示される。具体的なサイトカインの組み合わせとしては、IL-7/FL、IL-2/IL-7/IL-15、IL-2/IL-7/IL-15/IL-15Ralpha、IL-2/IL-7/FL、IL-2/IL-15/FL、IL-2/IL-15/IL-15Ralpha/FL、IL-7/IL-15/FL、IL-7/IL-15/IL-15Ralpha/FL、IL-2/IL-7/IL-15/FL、IL-2/IL-7/IL-15/IL-15Ralpha/FLが挙げられるが、特に好ましくはIL-7/FL、IL-2/IL-15/IL-15Ralpha/FLおよびIL-2/IL-7/IL-15/IL-15Ralpha/FLの組み合わせである。各サイトカインの濃度は0.1-10ng/mL、好ましくは1-5ng/mLの範囲で適宜選択することができる。培地には、さらに別のサイトカイン（例、SCFなど）を添加することもできる。培養は、細胞の由来する動物種に応じて適宜調整すれば良いが、例えば、5% CO2/95% 大気の雰囲気下、約30-約40℃、好ましくは約37℃で、約3日-約6週間、好ましくは約3日-約4週間、さらに好ましくは約5日-約3週間行われる。本培養により、細胞量は5日間で約20-約30倍もしくはそれ以上に増大する。
　上述のサイトカインの組み合わせの刺激により得られるNKT細胞は、いずれもNKT細胞受容体リガンド（例、α-ガラクトシルセラミド）の刺激によりIFN-γを産生するので、アジュバント効果を有するが、このアジュバント効果を強化する観点から、好ましいサイトカインの組み合わせは、IL-7/FL又はIL-7/IL-15/IL-15Ralpha/FLである。これらのサイトカインの組み合わせにより誘導されたNKT細胞が産生するサイトカインのプロファイルが、比較的Th1型に偏りがあるからである。
　一方、上記のようにして得られるDP-NKT細胞を、Notchリガンドを発現しないストローマ細胞と共培養することにより、末梢のNKT細胞に酷似したNKT細胞を作製することができる。該NKT細胞はNKマーカー（ヒトではCD161、B6マウスではNK1.1）ポジティブで特徴づけられるが、さらにCD3ε+、Sca1+、CD44+、CD69+、CD34-、Flt3-等の表現型を示し、TCRα（ヒトにおいてはVα24、マウスにおいてはVα14）の発現もDP-NKT細胞と比較して低下し、末梢のNKT細胞と同等の発現レベルを示す。言い換えれば、NKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）からDP-NKT細胞への分化誘導培養の途中で、フィーダー細胞を、Notchリガンドを発現するストローマ細胞から該リガンドを発現しないストローマ細胞に切り換えることにより、末梢のNKT細胞と同等のNKT細胞にまで分化・成熟させることができる。Notchリガンドを発現しないストローマ細胞としては、例えばOP9細胞、S17細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、NKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）からDP-NKT細胞への分化誘導に使用される培地を同様に使用することができるが、IL-2、IL-7、IL-15およびFLから選ばれる2以上のサイトカインを含むことが好ましく、IL-15を含むことがより好ましい。フィーダー細胞を、Notchリガンドを発現するストローマ細胞から該リガンドを発現しないストローマ細胞に切り換えるタイミングは、最終的に末梢のNKT細胞と同等のNKT細胞（例、NK1.1ポジティブ細胞）が得られる限り特に制限されないが、例えば、NKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）とNotchリガンドを発現するストローマ細胞との共培養を開始してから約12-約20日後、好ましくは約14-約18日後に、フィーダー細胞を、該リガンドを発現しないストローマ細胞に切り換える。Notchリガンドを発現しないストローマ細胞との共培養期間も特に制限されないが、例えば、約3日-約4週間、好ましくは約5日-約3週間である。本培養を、IL-2、IL-7、IL-15およびFLから選ばれる3以上のサイトカインを含む（好ましくは、そのうちの1つはIL-15である）培地を用いて実施することにより、末梢のNKT細胞と同程度に分化・成熟したNKT細胞を大量に取得することができる。また、IL-7/FL等数種類のサイトカイン存在下で４週間あるいはそれ以上培養する事でIFN-γを大量に作るNKT細胞を作ることが出来る。
　NKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）においては、染色体上のTCRα鎖領域がNKT細胞特異的な態様（ヒトではVα24-Jα18、マウスではVα14-Jα18）に再構成されているので、これを上述の条件で分化誘導すると、ほとんど全ての細胞がNKT細胞へ分化し、通常のT細胞への分化は実質的に生じない。従って、本発明において、NKT細胞とは同種異系の個体を投与対象とする場合に、NKT細胞のソースとしてNKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）から誘導したNKT細胞を用いれば、アロの通常のT細胞が混入する可能性を回避し、通常のT細胞による重篤なGVH反応が生じるリスクを抑制することができる。従って、以上の観点から、NKT-PS細胞（例、NKT-iPS細胞）から誘導されたNKT細胞を使用することは有利である。
　上記のようにして得られるNKT-derived細胞（例、NKT-iPS細胞）由来のNKT細胞（以下、NKT-derived細胞由来のNKT細胞を「再分化NKT細胞」、NKT-PS細胞由来のNKT細胞を「PS-NKT細胞」、NKT-iPS細胞由来のNKT細胞を「iPS-NKT細胞」ともいう）はCD1d拘束性であるので、α-GalCer等のNKT細胞受容体リガンドを提示した樹状細胞（DC）と接触させることにより、再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を活性化することができる。DCは再分化細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）と同種由来のものが好ましいが、再分化細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を活性化し得る限り異種DCを用いてもよい（例えば、マウスDCとヒト再分化NKT細胞（例、ヒトPS-NKT細胞、ヒトiPS-NKT細胞）とを接触させる）。DCは、NKT細胞受容体リガンドを介して再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を活性化し得るものであれば特に制限はなく、ミエロイド系の樹状細胞（DC1）、リンパ系の樹状細胞（DC2）のいずれであってもよいが、好ましくはDC1である。DCは自体公知のいかなる方法によって調製されてもよく、骨髄、末梢非リンパ系組織、リンパ系組織のT細胞領域、輸入リンパ、表皮、真皮などから分離することもできるが、好ましくは、例えば、骨髄細胞や末梢血等から密度勾配遠心法などにより単球、骨髄球などを分離し、GM-CSF（およびIL-4）存在下で約7-約10日間培養して、調製することができる（Nature, 408, p.740-745, 2000）。
　本発明において、DCをパルスするのに用いられるNKT細胞受容体リガンドとは、CD1d分子上に提示されたときに、NKT細胞上のT細胞受容体により特異的に認識され、NKT細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用されるNKT細胞受容体リガンドとしては、例えば、α－グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド（Science, 306, p.1786-1789, 2004）、ＯＣＨ（Nature 413:531, 2001）等を挙げることができる。α－グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、WO93/05055、WO94/02168、WO94/09020、WO94/24142、WO98/44928、Science, 278, p.1626-1629, 1997 等に開示されているものを挙げることができる。中でも、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－Ｏ－（α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－ヘキサコサノイルアミノ－１，３，４－オクタデカントリオール（α－ガラクトシルセラミド又はα－GalCerと称する）が好ましい。
　本明細書中、NKT細胞受容体リガンドは、その塩をも含む意味として用いられる。NKT細胞受容体リガンドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いら、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
　また、本明細書中、NKT細胞受容体リガンドは、その溶媒和物（水和物等）をも含む意味として用いられる。
　本発明の再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）はヒトへの投与を目的とするので、DCをパルスするのに用いるNKT細胞受容体リガンドはGMPグレードのものであることが望ましい。
　NKT細胞受容体リガンドによるDCのパルスは慣用の手法により行えばよく、例えば、NKT細胞受容体リガンドを約0.1-約200ng/mLの濃度で含有する血清含有培地（例えば、10％ FCS含有RPMI-1640培地等）中で、DCを約12-約48時間培養することにより実施することができる。NKT細胞受容体リガンドのパルスは、未成熟のDCをGM-CSF（およびIL-4）存在下で培養・成熟させる過程で、培地にα-GalCerを添加することにより行ってもよい。あるいは、下記のように成熟させたDCを再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）と共培養する工程で、培地にNKT細胞受容体リガンドを添加することにより行ってもよい。
　DCと再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）との接触は、例えばNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）から末梢NKT細胞と同等の表現型を示す再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）への分化誘導において上記した培地中で、両者を共培養することにより実施することができる。
　本明細書において「活性化NKT細胞」とは、少なくともα-GalCerを提示したDCに応答して、IFN-γ等のTh1サイトカインを産生する再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を意味する。該細胞は、さらにIL-4等のTh2サイトカインの産生能を有していてもよく、また増殖能を有していてもよい。再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）が、α-GalCerを提示したDC刺激により増殖能およびTh2サイトカイン産生能をも獲得するには、NKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）から再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）への分化誘導の過程で、Notchリガンドを発現するストローマ細胞と共培養し続ける必要があり、その場合、Notchリガンドを発現しないストローマ細胞に切り換えて得られる再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）に比べてIFN-γ産生能も高くなる。また、DP-NKT細胞から再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を大量増幅させる培養工程で、サイトカインとしてIL-7/FLまたはIL-15/IL-15R alpha/IL-7/FLの組み合わせを選択することにより、特に活性化NKT細胞におけるTh1/Th2サイトカイン産生バランスがTh1優位を示す。
　本発明は、上記のようにして得られる再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を含有してなる免疫細胞療法剤を提供する。該再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）は、好ましくは活性化NKT細胞である。本発明により提供される再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）は、増殖能およびTh1優位なサイトカイン産生能を有し、内在性のNKT細胞と同様にアジュバント効果を有するので、例えば、がん（cancer）、感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患などの各種疾患の予防・治療に有用である。がんとしては、あらゆる種類の原発性癌が挙げられ、また、初期癌および転移・浸潤能を有する進行癌を含むあらゆる状態のがんが挙げられる。具体的には、がんとしては、肺癌（小および／または非小細胞）、脳腫瘍、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、皮膚癌、骨肉腫、結腸直腸癌、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ＡＣＴＨ生成腫瘍、副腎皮質癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、メラノーマ、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣（胚細胞）癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽腫、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌、甲状腺癌、栄養膜新生物、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、尋常性白斑、ベーチェット病、膠原病、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、シェーグレン症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性肝疾患、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、HTLV-1関連脊髄症等を挙げることができるが、これらに限定されない。アレルギー疾患としては、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎などが挙げられるが、これらに限定されない。感染症としては、CMV（例えば、HCMVまたはMCMVなど）、単純ヘルペスウイルス、EBウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、SARSウイルスなどのウイルス感染症が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の免疫細胞療法剤は、その有効成分である再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）と、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが一致しない同種異系個体を投与対象とする。これは、NKT細胞が由来する個体自身やMHCの型が一致する（即ち、MHCの主要遺伝子座のジェノタイプが実質的に完全一致する）同種異系個体を投与対象とする、本発明者ら自身が以前に報告した免疫細胞療法剤とは、治療コンセプトを全く異にする、画期的な「薬剤」である。即ち、後者が、移入NKT細胞が宿主体内に生着して機能し続けることを前提にしているのに対し、本発明の免疫細胞療法剤では、移入したNKT細胞は、MHC遺伝子座は少なくともその一部が一致していないため、移入したNKT細胞はレシピエントの免疫系により認識され、最終的に排除され、生着することはない。しかし、NKT細胞のアジュバント効果は短期間で達成されるので、NKT細胞以外の免疫系細胞（例、CD8T細胞、NK細胞）を活性化することができる。したがって、本発明の免疫細胞療法剤においては、NKT細胞は、必要な期間薬効を発揮した後は、速やかに体内から排除される「通常の医薬品」と同様の役割を果たしている。
　MHC遺伝子座とは上記と同義であり、ヒトMHC（HLA）の場合、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cの3遺伝子座を挙げることができる。マウスの場合も同様に、クラスI領域のH-2K、H-2DおよびH-2L遺伝子座を、本発明における主要遺伝子座として挙げることができる。
　一態様において、上記の3遺伝子座のうち、少なくとも1座（好ましくは2座、より好ましくは3座）のジェノタイプが、移入するNKT細胞と異なる同種異型個体が、免疫細胞療法の対象となる。この態様においては、MHC遺伝子座が異なることにより、投与されたNKT細胞はレシピエントのアロ免疫反応により排除されるので、アジュバント効果等の作用を効果的に発揮した後で、排除されることが期待される。特に、移入されたNKT細胞を、アロのレシピエントにより排除させる観点から、上記3遺伝子座の全てのジェノタイプが、免疫細胞療法の対象である個体と異なる個体由来のNKT細胞を用いるのが好ましい。
　再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、経口／非経口製剤、好ましくは、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合しても良い。
　本発明の剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に例えば、約1.0×106～約1.0×107細胞/mLとなるように、再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を懸濁させればよい。
　このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒトなどの哺乳動物に対して安全に投与することができる。投与方法は特に限定されず、経口又は非経口的に投与することができるが、好ましくは注射もしくは点滴投与であり、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、患部直接投与などが挙げられる。当該免疫細胞療法剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重60kgとして）においては、例えば、非経口投与の場合、１回につきNKT細胞数として約1.0×107～約1.0×109細胞を、約1～2週間隔で、約4～約8回投与するするのが好都合である。
　移入する再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の生体内における活性化を促進するため、本発明の免疫細胞療法剤においては、その有効成分である再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）と、NKT細胞受容体リガンドとを組み合わせてもよい。
　再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）と併用されるNKT細胞受容体リガンドとしては、活性化NKT細胞の作製において上記したものが同様に使用され得るが、好ましくはα-GalCerである。投与対象がヒトである場合はGMPグレードのNKT細胞受容体リガンドが使用される。がんなどのNKT細胞療法を必要とする疾患に罹患している患者の場合、内在DCの数が減少していたり、機能が欠損していたりする場合があるので、再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の生体内での活性化を亢進させる目的で、NKT細胞受容体リガンドに代えてNKT細胞受容体リガンドでパルスしたDCを用いてもよい。この場合、DCの採取源としては、投与対象である患者本人であること（即ち、自家移植）が好ましいが、患者に適合性があると予測される同種異系個体であれば、これに限定されない。
　NKT細胞受容体リガンドは、通常、医薬上許容される担体とともに、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合しても良い。NKT細胞受容体リガンドを水性液剤として製剤化する場合、適当な有機溶媒（例、DMSOなど）に溶解したNKT細胞受容体リガンドを、例えば約100μg～約1mg/mLの濃度となるように、上記水性液中に溶解すればよい。
　一方、NKT細胞受容体リガンドの代わりにNKT細胞受容体リガンドでパルスしたDCを用いる場合、活性化NKT細胞の作製において上記したような手法により調製されるNKT細胞受容体リガンドでパルスしたDCを、上記水性液に例えば約1.0×106～約1.0×107細胞/mLとなるように懸濁すればよい。
　上記のようにして製剤化されたNKT細胞受容体リガンドは、経口又は非経口的に投与することができるが、好ましくは注射もしくは点滴投与であり、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、患部直接投与などが挙げられる。NKT細胞受容体リガンドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重60kgとして）においては、例えば、非経口投与の場合、１回量として通常約0.6～約6.0mgである。一方、NKT細胞受容体リガンドの代わりにNKT細胞受容体リガンドでパルスしたDCを用いる場合、その投与量は、通常、１回につき約1.0×107～約1.0×109細胞である。これらの量を、iPS-NKT細胞含有製剤の投与プロトコルに応じて投与することができる。
　再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）含有製剤とNKT細胞受容体リガンド含有製剤とは、別個にもしくは用時混合して同時に投与することもできるし、再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）含有製剤、次いでNKT細胞受容体リガンド含有製剤の順で、経時的に投与することもできる。
　本発明はまた、上記のヒト再分化NKT細胞（例、ヒトPS-NKT細胞、ヒトiPS-NKT細胞）を用いた免疫細胞療法を、より迅速で普遍的かつ品質管理に優れた条件の下で提供することを可能にするための、ヒトNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（再分化NKT細胞）（例、PS由来NKT細胞（PS-NKT細胞）、iPS由来NKT細胞（iPS-NKT細胞））バンクを提供する。移植医療を目的としたヒトiPS細胞バンキングの構想は数多く存在する。しかし、本発明のヒトNKT細胞由来細胞（例、PS細胞、iPS細胞）バンクまたは該NKT-derived細胞（例、PS細胞、iPS細胞）由来NKT細胞バンクの特徴は、既に遺伝子再構成を終えたNKT細胞由来の細胞（例、PS細胞、iPS細胞）（または該NKT-derived細胞（例、PS細胞、iPS細胞）由来NKT細胞）のみで構成されるため、機能的なNKT細胞の分化誘導が容易である点にある。また、従来より提唱されているヒトiPS細胞バンクが、あらゆる患者に対して適応可能であるように、その体内に生着し得る細胞・臓器を提供できるだけのヒトiPS細胞のレパートリー、即ち、HLAの主要遺伝子座（HLA-A、HLA-B、HLA-CもしくはHLA-DRB1）のすべてについてジェノタイプが一致するヒトiPS細胞のレパートリーを準備することを念頭においているのに対し、本発明の場合、患者体内にある期間留まって薬効を発揮した後、患者体内から排除されるヒトNKT細胞を、あらゆる患者に対して提供できるだけのNKT-devired細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）又は再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を取り揃えることを目標とする点で大いに異なる。
　本発明の免疫細胞療法においては、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが、NKT細胞と一致しない同種異系個体が投与対象となる。MHC遺伝子座の全てのジェノタイプが、NKT細胞と患者との間で完全に一致することは殆ど無いため、理論的には安全性及びNKT細胞への分化能が確認された１種類のNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）があれば、殆どすべての患者をカバーすることが可能である。このように、本発明においては、HLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-B及びHLA-Cからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子座）の少なくとも１つが不一致であれば移植使用可能となるので、本発明の目的に適うヒトNKT-devired細胞（例、ヒトNKT-PS細胞、ヒトNKT-iPS細胞）のバンキングは、比較的容易に患者集団の大部分をカバーできる程度に達成され得るはずである。
　一態様において、本発明は、ある集団における特定のHLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ、より好ましくは３つ）の遺伝子座）のジェノタイプ頻度の合計が、その集団全体の50%以上（例えば、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上）をカバーするジェノタイプのレパートリーを有する、ヒトNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）のバンクを提供する。該態様のヒトNKT細胞由来細胞バンク（または該NKT-derived細胞由来NKT細胞バンク）を用いれば、ある特定の患者について、その細胞バンクにおいて集団全体の50%以上（例えば、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上）をカバーする特定のHLA遺伝子座（以下、「標的HLA」とする）のジェノタイプのみを決定し、該患者とは異なるジェノタイプの当該HLAを有するヒトNKT細胞由来iPS細胞を該バンクから選択することにより、該集団に含まれる殆ど全ての患者について、特定のHLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-C遺伝子座のうちからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ、より好ましくは３つ）の遺伝子座）のジェノタイプが該患者と一致しないヒトNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）及び該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を円滑に供給することが可能となる。あるいは、このように多様なレパートリーをバンク内に備えておくことにより、複数の遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cの全ての遺伝子座）のジェノタイプが投与対象と一致しないヒトNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を円滑に供給することが可能となる。
　標的HLAは、HLA-A、HLA-BもしくはHLA-Cが好ましく、アレルの種類がより少なく、血清型（2桁レベル）ではA24、A2、A11、A26、A31およびA33の6種類で日本人の92％をカバーするHLA-A遺伝子座のジェノタイプを選択する方が、本発明の目的に適合するHLAジェノタイプをより簡単に取得できる点で、HLA-Aであることが特に好ましい。
　ここで「ある集団」としては、例えば、日本人全体、アメリカ人全体などの国家単位であったり、民族単位であったり、あるいは白色人種全体、黄色人種全体、黒色人種全体といった人種単位であったり、さらには人類全体であり得る。
　本発明のヒトNKT-derived細胞バンクまたはヒト再分化NKT細胞バンクは、以下の（１）～（４）の工程を行うことにより構築することができる：
（１）ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも1つのHLA遺伝子座）のジェノタイプを確定する工程；
（２）ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程；
（３）該NKT細胞からヒトNKT-derived細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒトNKT-derived細胞からヒト再分化NKT細胞を樹立する工程；および
（４）樹立ヒトNKT-derived細胞のNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たした細胞を順次バンキングする工程。
　本発明のヒトNKT-iPS細胞バンクまたはヒトiPS-NKT細胞バンクは、以下の（１）～（４）の工程を行うことにより構築することができる：
（１）ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも1つのHLA遺伝子座）のジェノタイプを確定する工程；
（２）ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程；
（３）該NKT細胞に核初期化因子を接触させてヒトiPS細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒトiPS細胞からヒトNKT細胞を樹立する工程；および
（４）樹立ヒトiPS細胞のNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たした細胞を順次バンキングする工程。
　上記特定の態様のヒトNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）のバンクを構築する場合には、構築されたヒトNKT由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、iPS-NKT細胞）バンクが、バンキングされたヒトNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の特定のHLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ、より好ましくは３つ）の遺伝子座）のジェノタイプのレパートリーが、各ジェノタイプのある集団における頻度の合計がその集団全体の50%以上（例えば、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上）をカバーするようになるまで、繰り返し行うことにより構築することができる。
　ドナー登録は、例えば、通常の献血で採取される末梢血（あるいは成分献血で採取されるリンパ球）や出産時に採取される臍帯血について、予め文書でインフォームド・コンセントを得て行うなどすれば、容易にエントリーが得られることが期待される。HLAタイピングは、骨髄移植のドナー検索で一般的に使用されているSBT法によりHLA-A、HLA-BおよびHLA-Cのジェノタイプを確定するか、蛍光ビーズ法により高頻度アレルを予測することができる。臓器移植や骨髄移植のドナー登録をして既にHLAタイピングを完了しているヒトに、末梢血や臍帯血の提供を要請することにより、容易にヒトNKT細胞を揃えることもできる。
　前記工程（３）は、上述のNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）の作製方法をそのまま適用することができる。
　また、前記工程（４）において、樹立したヒトNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）のNKT細胞への分化能は、上述の再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の作製方法を適用して、NKT細胞に分化誘導が達成されるか否かを判定することにより実施できる。一方、分化後の造腫瘍性については、核型分析（染色体標本をギムザ染色し、顕微鏡下で染色体数や染色体構造異常を分析する）、継代数を重ねた細胞による評価（細胞特性に変化がないことを確認する）、軟寒天培地法（造腫瘍性を有する細胞は、増殖のための細胞接着の足場を必要としないことを利用）、免疫不全動物への移植（ヌードマウスなどの筋肉内や皮下にヒトNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）を注入し、腫瘍形成の有無を調べる）などの手法を用いて検定することができる。
　以上の検定の結果、NKT細胞への分化能を有し、分化後の造腫瘍性が実質的にないと判定されたヒトNKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）または該NKT-derived細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）をバンキングする。バンキングされた細胞は、標準的に使用されている方法により分注された状態で凍結保存され、用時ストックの一部を融解し、必要に応じて適当な培地（例えば、ヒトES細胞培養用培地など）で十分な量にまで増幅した後、上記NKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）からNKT細胞への分化誘導法に従って、ヒト再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を調製することができる。
　ヒトNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）の増幅およびNKT細胞への分化誘導は、細胞の提供を受ける医療施設が細胞バンクから対象細胞の分譲を受けて、自ら実施することもできるが、細胞自体や培地の品質管理（マイコプラズマ等の感染や未分化細胞の残存の検査など）、装置・施設の管理等で厳しい規制の条件をクリアする必要があるので、現実的ではない。したがって、細胞バンク施設内で、標準化されたプロトコルに従って、一律にNKT-derived細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）の増幅および再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）への分化誘導までを行った後、細胞の提供を受けようとする医療施設に再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の状態で分配することが望ましい。
　ヒト再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の提供を受けようとする医療施設は、対象患者のHLAタイピングを実施し、細胞バンクに届け出る。この際、該医療施設がバンキングされたNKT細胞リストの少なくとも１つのHLA遺伝子座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ、より好ましくは３つ）の遺伝子座）のジェノタイプが一致しないことを確認し、治療目的に使用する。医療施設は患者のHLA遺伝子座のジェノタイプを届け出るだけで、細胞バンク側が、それまでに蓄積されたデータに基づいて患者のHLA遺伝子座のうち少なくとも１座（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ、より好ましくは３つ）の遺伝子座）においてジェノタイプが異なることを確認したのち、NKT細胞由来細胞（例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞）あるいは該細胞由来NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）を供給できる。この目的のために、細胞の提供を受けた各医療施設は、細胞バンク側に対し、再分化NKT細胞（例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞）の投与方法や治療プロトコル、治療効果や副作用などに関する臨床データの情報を開示し、一方、細胞バンク側では、細胞の保存方法や細胞の増幅・分化誘導・精製の条件の最適化を図るだけでなく、各医療施設から収集した臨床情報をデータベース化して共有し、還元できるシステムを構築することが望ましい。
　刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、参照により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）マウス脾臓細胞由来NKT細胞からのiPS細胞の樹立
　T細胞抗原受容体α鎖（TCRα）領域が既にNKT細胞で用いられるTCR (NKT-TCR) に再構成しているC57BL/6マウスの脾臓細胞より、NKT細胞を調製した。NKT細胞はMHCクラスI様分子であるCD1dに提示される糖脂質抗原を認識することを特徴とするため、糖脂質抗原であるα-GalCerを挟んだ可溶化型CD1d-マウスIgG1組換え体 (BD Bioscience社製) をAPC標識した抗マウスIgG1抗体に反応性を有する細胞を、抗APC磁気ビーズを利用したMACS法（Miltenyi Biotech社製）を用いてポジティブ選択することにより、細胞を濃縮した。この操作により、α-GalCer loaded CD1d dimer陽性/TCRβ陽性の細胞として規定されるNKT細胞は90％以上の純度となった。濃縮したNKT細胞を、IL-2（10ng/ml）存在下、106個/mlの細胞密度で10%FCSを含むRPMI培地で24時間培養した後、Cell, 126: 663-676 (2006) に記載の方法に準じて、マウス由来の4因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸）を含むレトロウイルス（106pfu/ml）に24時間感染させた。ウイルス感染から3-7日後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞（MEF）上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、NKT細胞由来iPS細胞（NKT-iPS細胞）を4クローン樹立した（クローン名：2a, 5b, 5d, 5g）。
（２）NKT-iPS細胞のcharacterization
　上記（１）で樹立した4クローンのNKT-iPS細胞がNKT細胞由来であるか証明するために、NKT-TCRへの再構成が行なわれているか否かをgenomic PCRにより確認した。NKT-TCRを有する細胞では、TCRα領域の片方がVα14-Jα18に既に再構成していることから（図１）、下記に示すプライマーを用いて、各NKT-iPSクローンのゲノムを鋳型としてPCRを行うことにより、再構成の有無を確認した。
配列番号１：プライマー1: 5’-gacccaagtggagcagagtcct-3’
配列番号２：プライマー2: 5’-tcacctatgtctcctggaagcctc-3’
配列番号３：プライマー3: 5’-cagctccaaaatgcagcctccctaa-3’
［Vα14-Jα18に再構成していない（ワイルド）場合、プライマー１とプライマー２を用いたPCRにより、349bpのバンドが増幅される。一方、Vα14-Jα18に再構成している（NKT-TCR）場合、プライマー１とプライマー３を用いたPCRにより、317bpのバンドが増幅される。］
　その結果、樹立された４クローンいずれもゲノムの片方がNKT-TCRに再構成していることが明らかとなり（図２）、樹立されたiPS細胞がNKT細胞由来であることが確認できた。
（３）NKT-iPS細胞の遺伝子発現解析
　上記（２）で確認されたNKT-iPS細胞がiPS様の細胞へリプログラミングされているか否かを確認するために、遺伝子発現プロファイリングを実施した。NKT-iPS細胞、NKT細胞の核移植胚由来のES細胞（NKT-ES細胞）、末梢のNKT細胞からそれぞれtotal RNAをフェノール-クロロホルム法により調製し、ES細胞において発現が知られている一連の遺伝子群の発現をone step RT-PCR法 (Invitrogen社製) により解析した。解析を行った遺伝子と用いたプライマーの配列を下記に列記する。
Endogenous Oct3/4:   5’-tctttccaccaggcccccggctc-3’（配列番号４）
                     5’-tgcgggcggacatggggagatcc-3’（配列番号５）
Endogenous Sox2:     5’-tagagctagactccgggcgatga-3’（配列番号６）
                     5’-ttgccttaaacaagaccacgaaa-3’（配列番号７）
Endogenous Klf4:     5’-gcgaactcacacaggcgagaaacc-3’（配列番号８）
                     5’-tcgcttcctcttcctccgacaca-3’（配列番号９）
Endogenous c-Myc:    5’-tgacctaactcgaggaggagctggaatc-3’（配列番号１０）
                     5’-aagtttgaggcagttaaaattatggctgaagc-3’（配列番号１１）
Ecat1:               5’-tgtggggccctgaaaggcgagctgagat-3’（配列番号１２）
                     5’-atgggccgccatacgacgacgctcaact-3’（配列番号１３）
Nanog:               5’-caggtgtttgagggtagctc-3’（配列番号１４）
                     5’-cggttcatcatggtacagtc-3’（配列番号１５）
Gdf3:                5’-gttccaacctgtgcctcgcgtctt-3’（配列番号１６）
                     5’-agcgaggcatggagagagcggagcag-3’（配列番号１７）
Rex1:                5’-acgagtggcagtttcttcttggga-3’（配列番号１８）
                     5’-tatgactcacttccagggggcact-3’（配列番号１９）
Zfp296:              5’-ccattaggggccatcatcgctttc-3’（配列番号２０）
                     5’-cactgctcactggagggggcttgc-3’（配列番号２１）
HPRT:                5’-ctgtgtgctcaaggggggct-3’（配列番号２２）
                     5’-ggactcctcgtatttgcagattcaacttg-3’（配列番号２３）
　その結果、解析した全ての遺伝子において、NKT-iPS細胞、NKT-ES細胞で発現が確認され、末梢のNKT細胞では発現が確認されなかった（図３）。この結果は、樹立したNKT-iPS細胞がiPS細胞様の機能を有している可能性を示唆している。
　さらに、DNAマイクロアレイ(Affimetrix社製) により、NKT-iPS細胞、NKT-ES細胞、ES細胞、末梢のNKT細胞間での遺伝子発現プロファイルの相関を確認したところ、NKT-iPS細胞はNKT-ES細胞あるいはES細胞と非常に良く似た遺伝子発現パターンを有し、末梢のNKT細胞とは異なることが明らかとなった（図４）。
（４）NKT-iPS細胞の形態観察
　上記（２）で樹立されたNKT-iPS細胞の形態を顕微鏡下で観察した。その結果、SSEA1やOct3/4の発現局在や細胞自身の形態がES細胞のそれらと酷似していることが明らかとなった（図５）。
（５）NKT-iPSキメラマウスの樹立と解析
　上記（２）で樹立されたC57BL/6マウス NKTクローン由来のNKT-iPS細胞と、Balb/c由来細胞から、アグリゲーション法によりキメラマウスを作製した。得られたキメラマウスの脾臓細胞について、細胞表面抗原の解析を行なった。C57BL/6由来の細胞とBalb/c由来の細胞とを、MHCクラスIで見分けることによりゲート（それぞれI-AbとI-Ad）し、NKT細胞の含有率を解析した。その結果、C57BL/6由来の細胞はほとんど全ての細胞が、α-GalCer loaded CD1d dimer陽性/TCRβ陽性のNKT細胞様の表面抗原を有しているのに比して、Balb/c由来の細胞は通常の頻度のT/NKT細胞の含有率であった（図６）。
参考例１　ヒトＴ細胞からのiPS細胞の樹立およびcharacterization
　ヒト末梢血のT細胞に、KSOMを含むウイルスベクターを用いて感染により強制発現させた後、マウス胚性線維芽細胞と21-35日間共培養することでiPS細胞を樹立した（Cell Stem Cell 7: 11-14,15-19, 20-24 (2010)）。このようにして樹立されたiPS細胞は網羅的な遺伝子発現プロファイルやES関連遺伝子のエピゲノム状態がヒトES細胞のそれと相関性が高いこと、T細胞抗原受容体領域が遺伝子再構成を起こしていることが確認されている。
実施例２　ヒトNKT細胞からのiPS細胞の樹立およびcharacterization
　ヒト末梢血あるいは臍帯血中に存在するCD1d拘束性のNKT細胞は、Vα24、Vβ11の両方を発現している細胞で、単核球中の0.001%～0.1%程度を占める。単核球を調製した後、抗ヒトVα24抗体、抗ヒトVβ11抗体、糖脂質リガンド（α-GalCerなど）を挟んだ可溶化型ヒトCD1d組換え体等を用いて、陽性細胞をソーティングにより高純度に分離するか、あるいはNature Protoc, 3: 70-78 (2008)に記載の方法で、単核球に糖脂質リガンドを加えて3日から1ヶ月程度培養してNKT細胞を試験管内で増やした後にソーティングにより高純度に調製する。純化したNKT細胞は、抗ヒトCD3抗体と抗ヒトCD28抗体を固層化したプレートに蒔種し、IL-2、IL-12、IL-23、IL-25などのサイトカイン存在下培養し、レンチウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターに組み込んだKSOMを用いて感染、強制発現させ、1～2ヵ月マウス胚線維芽細胞などと共培養することで、NKT細胞由来iPS細胞（NKT-iPS細胞）を樹立する。
実施例３
（１）マウスNKT-iPS細胞からの試験管内分化誘導
　ES細胞は、NotchリガンドであるDelta-like1（Dll-1）を強制発現したOP9ストローマ細胞（OP9/Dll-1）と、IL-7およびFlt3リガンド（FL）存在下で共培養することにより、CD4/CD8ダブルポジティブ（DP）のT細胞に分化誘導させることができる（Schmitt TM, de Pooter RF, Gronski MA, Cho SK, Ohashi PS, Zuniga-Pflucker JC. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 2004 Apr;5(4):410-417.）。この知見に基づき、NKT-iPS細胞をOP9/Dll-1細胞とIL-7（1 ng/ml）、FL(5 ng/ml)存在下で20日間共培養したところ、CD4/CD8 DPのα-GalCer loaded CD1d dimer陽性/TCRβ陽性のNKT細胞様の細胞（NKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞）が誘導されることが明らかとなった（図７）。さらに詳細に細胞表面抗原の発現解析を行なうと、DP-NKT細胞の表現型は、胸腺内のCD4/CD8 DP細胞のそれと酷似していることが明らかとなった（図８）。この結果は、NKT-iPS細胞がTCRα領域の遺伝子再構成の影響を受けて、NKT様の細胞に分化誘導されやすいことを示唆しているとともに、免疫細胞の遺伝子再構成という特徴を生かした新しいコンセプトを導入することで、目的の免疫細胞 (特にNKT細胞、T細胞、B細胞) を大量に調製する技術を確立できることを示している。
（２）マウスNKT-iPS細胞から成熟NKT細胞の試験管内分化誘導
　NKT-iPS細胞を培養14日目までOP9/Dll-1と共培養し、培養14日目から20日目までOP9と共培養することによってNKT細胞が誘導されるか否かを解析した。その結果、Lin陰性/CD44陽性/CD25陰性の所謂DN1しか出現していない分化段階早期においても、NKT細胞が出現しうること（図９）、分化誘導したNKT細胞の表面マーカーが末梢のNKT細胞に酷似していること（図９）を見出した。この結果は、NKT細胞が分化段階早期にNotchシグナルが欠損しても、成熟したNKT細胞に分化し得ることを示すものである。
（３）マウスNKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞から成熟NKT細胞の試験管内分化誘導
　上記（１）で誘導が確認できたNKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞を試験管内でさらに増やし成熟化させるために、種々のサイトカインの組み合わせでフィーダー細胞あり、なしの条件で5日間培養を行なった。その結果、OP9あるいはOP9/Dll-1との共培養で、IL-2/IL-15/FLあるいはIL-2/IL-7/IL-15/FLのサイトカインの組み合わせで培養することにより、さらに10倍以上に細胞を増やせることが明らかとなった（図１０）。さらに、これら条件で培養した細胞はNK1.1の発現が誘導されており、より分化誘導が進んでいることが推測された（図１１）。そこで、OP9あるいはOP9/Dll-1との共培養で、IL-2/IL-15/FLあるいはIL-2/IL-7/IL-15/FLのサイトカインの組み合わせで誘導して得られるNKT細胞について、骨髄細胞由来樹状細胞（GM-CSFで誘導）とα-GalCer存在下で共培養することにより、その増殖能およびサイトカイン産生能を確認した。その結果、OP9/Dll-1でさらに培養した場合に増殖能が確認されること（図１２）、その中でもIL-2/IL-15/FLで培養した場合にTh1への偏りがあること（図１２）が確認できた。
実施例４　ヒトNKT-iPS細胞から成熟NKT細胞の試験管内分化誘導
　ヒトNKT-iPS細胞をマウス骨髄ストローマ細胞株OP9及びそれにNotchリガンドであるDll-1を強制発現させた株OP9/Dll-1と共培養することにより、該ヒトNKT-iPS細胞がヒトNKT細胞に分化する。すなわち、ヒトNKT-iPS細胞をOP9と12ないし14日間培養した後、分化した細胞を回収し、さらに15-30日間OP9/Dll-1細胞とIL-7、Flt-3L、SCFなどのサイトカイン存在下で共培養する。このようにして、CD1d拘束性のNKT細胞を分化誘導することができる。
実施例５　マウスNKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞の生体内におけるアジュバント効果
　実施例３（３）で誘導されたNKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞（IL-7/FL存在下、OP9/Dll-1と20日間共培養した後、IL-2/IL-15/FL存在下、OP9/Dll-1とさらに5日間共培養したもの）が、生体内で機能的であるか否かを評価した。TAPノックアウトマウス由来脾細胞を10mg/mlの卵白アルブミン（OVA）と高張液下培養した後、アポトーシスを誘導し、アポトーシスした細胞2×107個を、2μgのα-GalCerとともに、NKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞105個あるいは106個を1時間前に予め移入しておいたJα18ノックアウトマウス（NKT細胞欠損マウス）に移入した。7日後、該マウスより脾臓細胞を採取し、試験管内でOVAペプチド（257-264）により刺激し、細胞内染色によりIFN-γの産生を解析した。その結果、IFN-γ産生能を有するOVA抗原特異的CD8陽性T細胞が移入細胞数依存的に誘導できていることが確認され、NKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞が生体内で機能し、強力なアジュバント効果を有することが明らかとなった（図１３）。
実施例６　マウスNKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞のアロ生体内におけるアジュバント効果
　細胞移入や臓器移植において、MHCが不一致の場合には、移入した細胞や移植した臓器は拒絶されることが知られている。例えば、C57BL/6マウスから樹立したNKT-iPS細胞から分化誘導したNKT細胞（C57BL/6バックグラウンド）をBalb/cマウスに移植した場合、ホストであるBalb/cマウスによって、移入したNKT細胞は拒絶される。しかしながら、移入直後のNKT細胞を活性化させることで、自然免疫系、獲得免疫系両方を活性化させることができる。NKT細胞移入と同時にα-GalCerなどNKT細胞を特異的に活性化する薬剤をパルスした樹状細胞を移入することで、免疫系を活性化する。
実施例７　ヒトNKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞の生体内におけるアジュバント効果
　重症免疫不全マウスであるNOD/SCID/Common γノックアウトマウスに造血幹細胞を移入して作製される免疫系ヒト化マウス（HLA完全不一致）にヒトNKT-iPS細胞から分化誘導させたNKT細胞を移入する。マウスの場合と同様にヒトiPS細胞由来NKT細胞も速やかに拒絶されるので、移入と同時あるいはその直後に活性化する必要がある。この場合、NKT細胞リガンドであるα-GalCerなどをパルスした樹状細胞（単球からGM-CSFとIL-4で誘導する単球由来樹状細胞もしくはLineage陰性CD11c陽性CD123陰性ミエロイド樹状細胞など）、又はα-GalCerをNKT細胞と同時移入すると、拒絶前のNKT細胞が生体内で活性化し、抗腫瘍効果やアジュバント効果を発揮し得る。
実施例８　ワイルドマウス脾臓細胞由来NKT細胞からのiPS細胞の樹立
　実施例１、３および５で、純化したマウスNKT細胞集団からのNKT-iPS細胞の樹立と、該NKT-iPS細胞からのNKT細胞への分化誘導、該細胞がNKT細胞としての機能を有していることなどが明らかとなった。そこで、実施例１と同様の手順により、C57BL/6マウスの脾臓細胞より濃縮操作なしにNKT細胞を調製し、30-50％程度の純度のNKT細胞集団を得た。実施例１と同様に、IL-2（10ng/ml）存在下、106個/mlの細胞密度で24時間この細胞を培養した後、マウス由来の4因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸）を含むレトロウイルス（106pfu/ml）に24時間感染させた。ウイルス感染から3-7日後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞（MEF）上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、NKT-iPS細胞5クローンの樹立に成功した（クローン名：i12c, i12d, i13g, i13h, i13i）（図１４）。
参考例２　C57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスの作製
　図１５に示すように、細胞移入実験を行う目的でC57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスを作製した。すなわち、C57BL/6マウスの脾臓由来のNKT細胞の核をBDF1マウスの脱核した卵母細胞に移入した。この細胞をBDF1×ICRのES細胞とフュージョンし、仮親の子宮に移入し、産仔であるキメラマウスを得た。得られたキメラマウス（雄）をC57BL/6マウス（雌）と交配することで得られた産仔をC57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスとした。
　この方法で樹立されたNKTクローンマウスは、元となる核が100％、C57BL/6マウスの脾臓由来のNKT細胞に由来するため、完全なC57BL/6であり、C57BL/6マウスとアロジェニックあるいはセミアロジェニックな反応を起こさない。C57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスとC57BL/6マウスとのゲノム上の相違は、NKT細胞への分化に伴うT細胞レセプター領域の再構成による配列の相違のみと考えられる。遺伝子再構成を終えているC57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスのT細胞レセプター領域の塩基配列を図１６に示す。
実施例９　NKTクローンマウス由来胚性線維芽細胞に由来するiPS細胞の樹立
　従来の山中らにより確立されたマウスiPS細胞の樹立の方法は、胚性線維芽細胞（MEF）にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycを導入することによるものである。そこで、参考例２において創生されたNKTクローンマウスのMEFから、iPS細胞の樹立を試み、NKT-iPS細胞7aおよび7gの樹立に成功した。樹立された7aおよび7gは、T細胞レセプター領域がNKT細胞のT細胞レセプターに遺伝子再構成を起こしていることが確認される（図１７）とともに、ES細胞マーカーとなり得る遺伝子群の発現がES細胞と同等であることがRT-PCR法により確認された（図１８）。また、DNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析とそのクラスター解析から、樹立された7a及び7gはES細胞に近く、元となるNKTクローンマウスのMEFとは遠いという結果を得た（図１９）。さらに、その形態学的観察を行うと、7aおよび7gはES細胞のそれと非常に良く似ており、ES細胞マーカーであるSSEA1、Oct3/4、Nanogが発現していることも確認された（図２０）。さらに、Oct3/4及びNanogの遺伝子発現調節領域のゲノムのメチル化傾向を解析したところ、7aおよび7gにおいてはES細胞と同等に非メチル化されており、十分にリプログラミングされていることが明らかとなった（図２１）。また、7a及び7gからはキメラマウスも複数産まれ、C57BL/6マウスとの交配で得られた産仔は全て、NKT細胞のT細胞レセプターに遺伝子再構成を起こしていることから、子孫伝達も確認され、7aおよび7gが多能性を有することが示された（図２２）。以上のことから、7aおよび7gはiPS細胞のクライテリアを満たしていると結論付けた。
実施例１０　NKTクローンマウスMEF由来iPS細胞からNKT細胞への試験管内分化誘導
　次に、MEFに由来する7aおよび7gから試験管内でNKT細胞を分化誘導することが可能であるか否かを検証した。7aおよび7gを、骨髄由来ストローマ細胞であるOP9にNotchリガンドであるDll-1を強制発現させた細胞株OP9/Dll-1と、図２３に示すプロトコルで25日間共培養した。その結果、図２４に示すように、α-GalCer/CD1d dimer陽性、TCRβ陽性のNKT細胞様の細胞（7a dif.および7g dif.）に分化誘導されることが明らかとなった。さらに、7a dif.および7g dif.は、その細胞表面マーカーの発現が、胸腺内に存在するCD4陽性CD8陽性の所謂DP細胞のそれと酷似していた。また、DNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析とそのクラスター解析から、7a dif.および7g dif.は分化誘導前の7aおよび7gとは遠く、末梢に存在する脾臓由来NKT細胞に近いという結果を得た（図２５）。そこで、7a dif.および7g dif.が機能的にNKT細胞と同等であるか否かを評価するために、樹状細胞との共培養下、糖脂質リガンドであるα-GalCerで刺激し、増殖能およびサイトカイン産生能を調べた。その結果、7a dif.および7g dif.は、末梢のNKT細胞と同様に、顕著な増殖能を有し、大量のIFN-γやIL-4を産生する能力を有することが確認できた（図２６）。
実施例１１　7a dif.および7g dif.の生体内機能解析
　実施例１０に記載のように7a dif.および7g dif.が末梢のNKT細胞と同等の機能を有することから、生体内において同様の効果があるか否かをNKT細胞欠損マウスを用いて解析した。NKT細胞欠損マウスに7a dif.および7g dif.を移入後、1週間および2週間における移入細胞の存在を確認すると、肝臓に、α-GalCer/CD1d dimer陽性、TCRβ陽性の7a dif.および7g dif.が存在することが明らかとなった（図２７）。そこで図２８に示すプロトコルに基づいて、抗原特異的CD8陽性T細胞の誘導とそれに伴う抗腫瘍効果を確認した。TAPノックアウトマウス由来脾細胞を10mg/mlの卵白アルブミン（OVA）と高張液下培養した後、アポトーシスを誘導し、アポトーシスした細胞２×107個を、２μgのα-GalCerとともに7a dif.および7g dif.を一週間前に移入したNKT細胞欠損マウスに移入した（TOG免疫）。7日後、該マウスより脾臓細胞を採取し、試験管内でOVAペプチド（257-264）により刺激し、細胞内染色により、IFN-γの産生を解析した。その結果、IFN-γ産生能を有するOVA抗原特異的CD8陽性T細胞が野生型マウスと同等に誘導できていることが確認され、7a dif.および7g dif.が生体内で機能し、強力なアジュバント効果を有することが明らかとなった（図２９）。そこで、該マウスにC57BL/6 マウスの胸腺腫細胞系 EL4あるいはEG7（EL4 OVA- transfectant）を使用した悪性腫瘍拒絶モデルによる評価を行なった。その結果、OVA強制発現株であるEG7においては、TOG免疫を行なっていない野生型マウスでは悪性腫瘍の進行が見られるのに対して、TOG免疫を行なった7a dif.および7g dif.移入NKT細胞欠損マウスにおいては、TOG免疫を行なった野生型マウスと同様に進行が確認されなかった。EL4においては、TOG免疫を行なった野生型マウスとNKT細胞欠損マウスとで同様の進行が見られることから、移入した7a dif.および7g dif.による抗原特異的なアジュバント効果によってもたらされているものと結論付けた（図３０）。
　以上の結果は、如何なる細胞であれ、T細胞レセプターが再構成しているものであるならば、該T細胞レセプターに再構成している、機能的な免疫担当細胞に分化誘導させうることを示している。
実施例１２　ヒトNKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞の生体内機能解析
　ヒトES細胞からCD4陽性CD8陽性T細胞様細胞の分化誘導系（J Immunol, 183: 4859-4870(2009)）を参考に、ヒトNKT-iPS細胞から試験管内NKT細胞分化誘導を行った。NKT-iPS細胞をOP9細胞と12-14日間共培養する。その後、NKT細胞前駆細胞を回収し、OP9/Dll-1細胞と、IL-7、Flt3L、SCF存在下、14-35日間共培養することで、CD1d拘束性のVα24陽性Vβ11陽性のNKT細胞が出現する。
実施例１３　マウスに移入されたアロiPS-NKT細胞の拒絶
　正常マウスにアロのNKT細胞を移入することで速やかに拒絶が起こり、移入NKT細胞はGvHを起こさずに排除される。この条件でNKT細胞リガンドであるα-GalCerをパルスした樹状細胞ないし、α-GalCerを同時移入すると、拒絶前のNKT細胞が生体内で活性化し、抗腫瘍効果やアジュバント効果を発揮し得る。
実施例１４　野生型NKT細胞からの効率的なiPS細胞の樹立方法
　実施例８に示すように野生型マウスの脾臓細胞由来のNKT細胞からのiPS細胞の樹立に成功しているが、より効率的なiPS細胞樹立方法を確立した。
　すなわち、脾細胞よりMACSビーズを用いてCD1d拘束性のNKT細胞を濃縮後、FACSソーティングにより純度99.9％のNKT細胞を得る。該NKT細胞は、抗CD3抗体（10μg/ml）および抗CD28抗体（10μg/ml）による刺激下、IL-2（10ng/ml）及びIL-12（10ng/ml）を加えることにより、増殖サイクルに入れることができる。この条件下で、該NKT細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸を含むレトロウイルスに感染させることで、実施例８よりも１０倍以上効率的にiPS細胞を樹立することが可能であることが明らかとなり、NKT-iPSクローン14kの樹立に成功した（図３１）。図３２に示すように、14kはES細胞様の形態とES細胞マーカーの発現、さらにT細胞レセプター領域のNKT細胞T細胞レセプターの再構成が起こっている。また、実施例９に記載の方法により、NKT細胞様の細胞への分化がみられ、試験管内での糖脂質刺激によって増殖し、サイトカインを産生する機能的な細胞となった（図３３）。
実施例１５　iPS-NKT細胞の成熟化
　実施例３の(1)で誘導が確認できたNKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞を試験管内でさらに増やし成熟化させるために、種々のサイトカインの組み合わせで5日間培養を行った。その結果、OP9/Dll-1との共培養で、IL-7/Flt3-L、 IL-7/IL-15/Flt3-L、IL-7/Flt-3L/IL-2あるいはIL-2/IL-7/IL-15/Flt3-Lのサイトカインの組み合わせで培養することにより、さらに10倍以上に細胞を増やせることが明らかとなった（図３４）。さらに、これら条件で培養した細胞はNK1.1の発現が誘導されており、より分化誘導が進んでいることが推測された（図３５）。そこで、OP9あるいはOP9/Dll-1との共培養で、IL-2/IL-15/FLあるいはIL-2/IL-7/IL-15/FLのサイトカインの組み合わせで誘導して得られるNKT細胞について、骨髄細胞由来樹状細胞（GM-CSFで誘導）とα-GalCer存在下で共培養することにより、その増殖能およびサイトカイン産生能を確認した。その結果、OP9/Dll-1でさらに培養した場合に増殖能が確認されること（図３６）、その中でもIL-7/Flt3-Lで培養した場合にTh1への偏りがあること（図３６）が確認できた。
参考例３　アロT細胞あるいはNKT細胞移入による急性GVHDの発症
　アロT細胞あるいはNKT細胞移入による急性GVHDの発症効果を確認するために、T細胞、B細胞及びNKT細胞が欠損したRAG欠損マウス（BALB/cバックグラウンド）に、野生型マウス（C57BL/6バックグラウンド）脾臓由来CD4陽性ヘルパーT細胞あるいはNKTクローンマウス（C57BL/6バックグラウンド）脾臓由来NKT細胞を、細胞数のドーズをふって移入した。CD4陽性ヘルパーT細胞の場合、1x107個ないし3x106個の細胞を移入することで、激しい下痢を伴う体重減少が認められ（図３７）、急性GVHDを発症していることが観察された。一方で、クローンマウス脾臓由来NKT細胞を移入した場合、CD4陽性ヘルパーT細胞と同数の細胞を移入しても下痢や体重減少は認められない（図３８）ことから、GVHDは引き起こされていないと考えられた。C57BL/6バックグラウンド脾臓由来NKT細胞からOct-3/4, Sox2, Klf4, c-Mycを強制発現させることによって樹立されたiPS細胞を、OP9/Dll-1細胞とIL-7（1 ng/mL）とFlt3リガンド（10 ng/mL）存在下、25日間培養することで得られたNKT細胞を上記と同数移入した場合においても、下痢や体重減少は認められない（図３７）ことから、GVHDは引き起こされていないと考えられた。これらの結果より、アロのNKT細胞あるいはアロのiPS細胞由来NKT細胞は、CD4陽性ヘルパーT細胞とは異なり、移植によってGVHDを発症しないことが示唆された。
実施例１６　アロのNKT細胞によるT細胞へのアジュバント効果
　NKT欠損マウス(Ja18-KOマウス)にNKT細胞を輸注後、OVA蛋白抗原とα-GalCerを共投与する系でアジュバント効果を評価した。
　(頁3左図) 野生型マウス（C57BL/6バックグラウンド）にOVAとα-GalCerを投与し、一週間後に脾臓の細胞を単離し、CD8T細胞のエピトープであるクラスI拘束性のOVAペプチドで再刺激して細胞内染色で解析したところ、抗原特異的なCD8T細胞のIFN-γ産生が認められた（図３９、左）。しかしながら、Ja18-KOマウス（C57BL/6バックグラウンド）にOVAとα-GalCerを投与した場合は、アジュバント効果は発揮できなかった(図３９、中)。この両者の結果は、NKT細胞がアジュバント効果を示すことを意味する。
　一方で、セミアロ細胞であるB6/129由来のES細胞から分化させたNKT細胞をJa18-KOマウス（C57BL/6バックグラウンド）に投与して、OVAとα-GalCerを投与した場合には、CD8T細胞の免疫応答が認められた(図３９、右)。この結果は、ES細胞由来NKT細胞がアロでありながら、アジュバント効果を示すことを意味する。
実施例１７　アロのNKT細胞による抗腫瘍効果
　上記でアロのNKT細胞がOVA抗原特異的CD8陽性T細胞へのアジュバント効果を発揮することが明らかになったことから、OVAを疑似抗原とした腫瘍細胞の除去に対するアロNKT細胞の効果を確認した。マウスリンパ腫の細胞株であるEL4とEL4にOVAを強制発現させた細胞株であるEG7をマウスに接種した。以下の３群について腫瘍細胞投与後の腫瘍径を測定した：(i) C57BL/6野生型マウス、(ii) 腫瘍細胞接種１週間前にOVA及びα-GalCerを投与したC57BL/6野生型マウス、(iii) セミアロ細胞であるB6/129由来のES細胞から分化させたNKT細胞、OVA及びα-GalCerを腫瘍細胞接種１週間前に投与したJa18欠損マウス（C57BL/6バックグラウンド）。EL4接種群では3群とも同じように経時的な腫瘍の増大が確認された（図４０、右グラフ）ことから、この実験系がワークしていることが確認された。この条件下、EG7を移入した群については、(ii)及び(iii)の群において腫瘍の増大が確認できなかった（図４０、左グラフ）。この結果は、NKT細胞依存的に抗原特異的なアジュバント効果が誘導されること（(ii)の系）、セミアロNKT細胞でも移入によって抗原特異的なアジュバント効果が誘導されること（(iii)の系）を示している。
　本発明のNKT細胞療法とそのためのヒトNKT由来細胞又は該細胞NKT細胞バンクが提供されることにより、これまで手工業的に行われていた免疫細胞治療に対し、より迅速で普遍的かつ品質管理に優れた技術の提供を可能とする点で極めて有用である。
　本バンキングシステムの事業化達成により、実用化に耐えるヒト免疫細胞iPS化基礎技術の開発、標的疾患治療を明確にした応用技術開発とベッドサイドとの連携医療基盤が構築され、このパイプラインの確立は、他の疾患領域へのiPS技術を活用した先進免疫治療技術基盤のプロトタイプとして活用され、わが国はもとより世界各国の保健医療に大きな波及効果をもたらすことが期待される。
　本出願は米国仮出願Ｎｏ．６１／４１９，０６４（出願日：２０１０年１２月２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (33)

  1. 　T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を含有してなる、免疫細胞療法剤であって、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、剤。
  2. 　T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、請求項１記載の剤。
  3. 　多能性幹細胞がES細胞である、請求項２記載の剤。
  4. 　ES細胞がヒトES細胞である、請求項３記載の剤。
  5. 　HLA遺伝子座のうち少なくとも１座のジェノタイプが該ヒトES細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、請求項４記載の剤。
  6. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項２記載の剤。
  7. 　iPS細胞がヒトiPS細胞である、請求項６記載の剤。
  8. 　多能性幹細胞がNKT細胞由来である、請求項２記載の剤。
  9. 　NKT細胞がヒトNKT細胞である、請求項８記載の剤。
  10. 　HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、請求項９記載の剤。
  11. 　HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、請求項５または１０記載の剤。
  12. 　NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞と組み合わせてなる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の剤。
  13. 　NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、請求項１２記載の剤。
  14. 　がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および／または治療用である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の剤。
  15. 　T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体に有効量投与することを含む、該個体に対する免疫細胞療法。
  16. 　T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、請求項１５記載の方法。
  17. 　多能性幹細胞がES細胞である、請求項１６記載の方法。
  18. 　ES細胞がヒトES細胞である、請求項１７記載の方法。
  19. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項１６記載の方法。
  20. 　iPS細胞がヒトiPS細胞である、請求項１９記載の方法。
  21. 　多能性幹細胞がNKT細胞由来である、請求項１６記載の方法。
  22. 　NKT細胞がヒトNKT細胞である、請求項２１記載の方法。
  23. 　HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、請求項２２記載の方法。
  24. 　HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、請求項２３記載の方法。
  25. 　前記個体に、NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞を有効量投与することをさらに含む、請求項１５～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、請求項２５記載の方法。
  27. 　がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および／または治療用である、請求項１５～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 　T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている、ヒトNKT細胞由来細胞または該細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞のバンク。
  29. 　以下の（１）～（４）の工程を含む、請求項２８記載のバンクの構築方法：
    （１）ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座のジェノタイプを確定する工程；
    （２）ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程；
    （３）該NKT細胞から、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているヒト細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒト細胞からヒトNKT細胞を樹立する工程；および
    （４）樹立ヒト細胞のNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たしたヒト細胞または該細胞由来NKT細胞を順次バンキングする工程。
  30. （１）ヒトNKT細胞の投与を必要とする患者と、少なくとも1つのHLA遺伝子座のジェノタイプが一致しないヒトNKT細胞から樹立したT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞または該細胞由来NKT細胞を、請求項２８記載のバンクから分譲を受けること、
    （２）（１）においてヒトNKT細胞から樹立したT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞の分譲を受けた場合、該細胞を成熟NKT細胞に分化誘導すること、及び
    （３）該患者に、上記（１）又は（２）で得たヒトNKT細胞の有効量を、投与すること
    を含む、免疫細胞療法。
  31. 　前記患者に、NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞を有効量投与することをさらに含む、請求項３０記載の方法。
  32. 　NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、請求項３１記載の方法。
  33. 　がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および／または治療用である、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
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