JP2019514360A - 超並列シークエンシングのためのdnaライブラリーを生成する方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
方法は、幾つかの反応及び幾つかの酵素が関わる多数の後続工程を伴う。
方法は、それ自体で単一細胞サンプルに由来するDNAに適用可能でない。
他に定義されていなければ、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有するものである。本明細書に記載されるものと同様な又は均等な多くの方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を下に記載している。他に言及されていなければ、本発明に使用される本明細書に記載の技法は当業者に既知の標準的な方法である。
以下の表に本発明による幾つかの考え得るワークフローをまとめる。
本明細書全体で一次WGA DNAライブラリーに言及する。同じワークフローを、例えばdsDNA合成、又は標準WGAプライマーを用いた(例えば、可能な場合はAmpli1(商標) ReAmp/dsキット(Menarini Silicon Biosystems spa,Italy)を用いた)ライブラリー再増幅等の付加的なプロセスに更に供した一次WGA DNAライブラリーに適用することができる。便宜上、本明細書においては、これらの付加的なプロセスを考慮することなく一次WGA DNAライブラリーのみに言及する。この種の全てのインプットサンプルを、特許請求の範囲に報告されているものについても好適なサンプルインプットとして使用することができることが意図されるものとする。
無視することができない量の一次WGAプライマーが一次WGAアウトプット産物中に存在する場合、DNAライブラリー精製を含む初期DNAライブラリー選択を行うことが有利である場合がある。実際、本発明によるプライマーは、一次WGAプライマー中に見られる共通配列に対応する配列を3’末端に有するため、無視することができない量の残留一次WGAプライマーの存在は、本発明による超並列シークエンシングライブラリーを得るために使用される再増幅プライマーと競合し、所望に応じて再増幅プライマー(複数の場合もある)(又はそれらの逆相補鎖(reverse complementary))を両末端に有するDNAライブラリー分子の収率を減少させる可能性がある。
再増幅DNAライブラリーの量の変動が、共にプール及びシークエンシングされるサンプル間で比較的大きい場合、ライブラリーを等分し、各サンプルについてシークエンシングされるリード数を均等化するために、各サンプルからのDNAライブラリーの量を定量化することが有利である場合がある。
幾つかの超並列シークエンサー(Ion Torrentプラットホーム及びIlluminaプラットホームを含む)は、用いられる種々の化学作用に応じて50bp〜800bpに含まれるサイズ分布ピークを有するDNAフラグメント、例えば150bp、200bp、400bp、650bpに分布ピーキング(peaking)を有するDNAフラグメントのシークエンシングを用いる。pWGAlibサイズ分布は約1kbp等のより大きなフラグメントのピーク及び150bp、200bp、400bpのはるかに少量のDNAを有し得るため、所望の範囲の再増幅DNAライブラリー量の定量化は、所望のフラグメント範囲の事前サイズ選択なしに大量の再増幅DNAライブラリーに対して行った場合に不正確となる可能性がある。結果として、大量のDNA定量化及びプール中の様々なサンプルの均等化は、シークエンサーサイズ範囲内のフラグメントの数がライブラリー内のDNAフラグメントの分布の不正確さにより確率的に変動することから、1サンプル当たりの実際のリード数の比較的大きな変動を生じる可能性がある(このため、完全に均等化された総量のDNAライブラリーであっても、シークエンシングされるフラグメントの数の顕著な変動を生じる)。
(再増幅前のサイズ選択による)
全DNAライブラリーに対するシークエンサーリード長範囲内のDNAライブラリーの量の割合を増大するために、一次WGA産物サイズ分布を変更する必要がある場合、DNAライブラリーサイズ選択を含む初期DNAライブラリー選択を行うことが有利である場合がある。
代替的又は付加的には、所望の範囲のDNAライブラリーフラグメントの選択的増幅に好都合な条件下で再増幅反応を行うことが有利である場合がある。
より短いフラグメントに好都合な反応条件は、より短いフラグメントを選択的に増幅するポリメラーゼを用いた再増幅PCR反応、又はより短い伸長段階によって長いフラグメントが完全長まで複製するのを防ぎ、不完全ライブラリーフラグメントを生成する初期PCRサイクルを含み得る。不完全ライブラリーフラグメントは再増幅プライマー(複数の場合もある)の3’セクションに逆相補的な3’末端部分を欠くため、このフラグメントは該再増幅プライマー(複数の場合もある)を用いた更なる複製工程から除外され、不完全フラグメントの指数関数的増幅が妨げられ、より長い一次WGA DNAライブラリーフラグメントに由来する線形の(サイクルによる)数の不完全増幅フラグメントしか生成することができない(consenting)。
Wf1)は、Ion Torrent PGM(例えば、サンプルバーコードを必要としない単一サンプルを処理する314チップ)でのWGAライブラリーのLPWGSに適用することができる。2つのプライマーを用いた再増幅により、バーコードを用いない2つのシークエンシングアダプターの導入が可能となる。
本発明の第1の実施形態において、
a. 既知の5’WGA配列セクション(5SS)と、中央WGA配列セクション(MSS)と、該既知の5’WGA配列セクションに逆相補的な既知の3’WGA配列セクション(3SS)とを含むフラグメントを含む一次WGA DNAライブラリー(pWGAlib)を準備する工程であって、上記既知の5’WGA配列セクション(5SS)がWGAライブラリー汎用配列アダプターを含み、上記中央WGA配列セクション(MSS)が、WGA前の元の非増幅DNAのDNA配列に対応する挿入セクション(IS)を少なくとも含み、上記中央WGA配列が任意に、隣接5’中間セクション(F5)及び/又は隣接3’中間セクション(F3)を更に含む、工程と、
b. 上記一次WGA DNAライブラリーを、少なくとも1つの第1プライマー(1PR)及び少なくとも1つの第2プライマー(2PR)を用いて再増幅する工程と、
を含み、
上記少なくとも1つの第1プライマー(1PR)が、第1プライマー5’セクション(1PR5S)と第1プライマー3’セクション(1PR3S)とを含み、該第1プライマー5’セクション(1PR5S)が、少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)と、該少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)の3’位かつ上記第1プライマー3’セクション(1PR3S)の5’位に少なくとも1つの第1シークエンシングバーコード(1PR5BC)とを含み、上記第1プライマー3’セクション(1PR3S)が、上記既知の5’配列セクション(5SS)又は上記既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズし、
上記少なくとも1つの第2プライマー(2PR)が、第2プライマー5’セクション(2PR5S)と第2プライマー3’セクション(2PR3S)とを含み、該第2プライマー5’セクション(2PR5S)が、上記少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)とは異なる少なくとも1つの第2シークエンシングアダプター(2PR5SA)を含み、上記第2プライマー3’セクション(2PR3S)が、上記既知の5’配列セクション(5SS)又は上記既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズする、方法が提供される。
c. 複数のバーコード化された超並列シークエンシングライブラリーを準備すると共に、種々のシークエンシングバーコード(BC)を用いて得られるサンプルをプールする工程と、
d. プールしたライブラリーをシークエンシングする工程と、
を含む、方法が、本発明の一実施形態に従って実行される。
e.上記バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの各々におけるDNAを定量化する工程と、
f.バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの量を正規化する工程と、
を更に含む。
g.再増幅されたWGA dsDNAライブラリーを上記官能化常磁性ビーズと共に設計条件下でインキュベートすることにより、ビオチンと該官能化常磁性ビーズに割り当てられたストレプトアビジンとの間に共有結合を生じさせる工程と、
h.結合していない非ビオチン化dsDNAフラグメントを洗い流す工程と、
i.上記官能化常磁性ビーズから残留ssDNAフラグメントを溶出させる工程と、
の更なる工程を含む。
第1プライマー5’セクション(1PR5S)と第1プライマー3’セクション(1PR3S)とを含み、該第1プライマー5’セクション(1PR5S)が、少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)と、該少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)の3’位かつ上記第1プライマー3’セクション(1PR3S)の5’位に少なくとも1つの第1シークエンシングバーコード(1PR5BC)とを含み、上記第1プライマー3’セクション(1PR3S)が、一次WGA DNAライブラリー(pWGAlib)のフラグメントのWGAライブラリー汎用配列アダプターを含む既知の5’配列セクション(5SS)又は該既知の5’配列セクションに逆相補的な既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズし、上記フラグメントが上記既知の5’配列セクション(5SS)の3’かつ上記既知の3’配列セクション(3SS)の5’の中央配列セクション(MSS)を更に含む、1つの第1プライマー(1PR)、
第2プライマー5’セクション(2PR5S)と第2 3’セクション(2PR3S)とを含み、該第2プライマー5’セクション(2PR5S)が、上記少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)とは異なる少なくとも1つの第2シークエンシングアダプター(2PR5SA)を含み、上記第2 3’セクションが、上記フラグメントの上記既知の5’配列セクション(5SS)又は上記既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズする、1つの第2プライマー(2PR)、
を少なくとも含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キットに関する。
a) 配列番号97(表2)のプライマー及び配列番号1〜配列番号96(表2)からなる群から選択される1つ以上のプライマー、又は、
b)配列番号194(表2)のプライマー及び配列番号98〜配列番号193(表2)からなる群から選択される1つ以上のプライマー、又は、
c)配列番号195〜配列番号202(表4)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号203〜配列番号214(表4)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、又は、
d)配列番号215〜配列番号222(表6)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号223〜配列番号234(表6)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、又は、
e)配列番号235〜配列番号242(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号243〜配列番号254(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、又は、
f)配列番号259〜配列番号266(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号267〜配列番号278(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、
を含む。
最適なシングルリードシークエンシングプロセスが行われるように設計された、
配列番号235〜配列番号242(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、及び配列番号243〜配列番号254(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、配列番号255のカスタムシークエンシングプライマー、及び配列番号256若しくは配列番号258のプライマー、又は、
配列番号259〜配列番号266(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、配列番号267〜配列番号278(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、並びに配列番号279及び配列番号280のプライマー、
を含む。
a. 上記のシークエンシングライブラリー調製キットを用いて開発されたDNAライブラリーをシークエンシングする工程と、
b. ゲノムの異なる領域にわたるシークエンシングリード密度を分析する工程と、
c. 上記ゲノムの領域についてのコピー数の値を、該領域におけるリード数を参照ゲノムの同じ領域において予測されたリード数に対して比較することによって決定する工程と、
を含む、方法に関する。
LPWGSによるCNAプロファイリングは、aCGHが十分に明らかな結果を生じることができない場合がある、より低いゲノム完全性指数により寛容である。実際に、aCGHプローブはゲノムの定位置に設計される。これらの位置がDNAの架橋のために確率的に増幅することができない場合、対応するプローブはハイブリダイゼーション後に適切な量のシグナルを生成せず、試験DNAと参照DNAとのシグナル比にノイズピクセル(noisy pixel)を生じる。
サイズ選択は、シークエンシングライブラリーの塩基対サイズとしての実質的に同じ長さ(アダプター挿入の正味)のDRS−WGAフラグメントで構成される領域内のゲノムのサブサンプリングを意味する。
DEPArrayシステム(Bolognesi et al.)を用いてFFPEからデジタル処理で選別された数百個の腫瘍細胞から出発して、DRS−WGAライブラリーを生成した。図6に示されるように、このライブラリーを用いて本発明によるIon/PGMのための超並列シークエンシングライブラリーを生成した。超並列ライブラリーを0.05未満の平均深度でシークエンシングした。
DRS−WGA後のIon Torrent PGMでのLPWGSのプロトコル
1)確定的制限部位全ゲノム増幅(DRS−WGA)
単一細胞DNAを、Ampli1(商標) WGAキット(Silicon Biosystems)を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。
5μLのWGAにより増幅されたDNAを、5μLのNuclease−Free Waterを添加することによって希釈し、結合していないオリゴヌクレオチド、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去するためにAgencourt AMPure XPシステム(Beckman Coulter)を用いて精製する。
(1)(5’−CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG[BC−]AGTGGGATTCCTGCTGTCAGT−3’)
(ここで、[BC]=バーコード配列である)、1μLの配列番号97の25μMプライマー:
(2)(5’−CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATAGTGGGATTCCTGCTGTCAGT−3’)
、1.75μlのAmpli1(商標) PCR dNTP(10mM)、1.25μlのBSA、0.5 Ampli1(商標) PCR Taq Polymerase、37.5μlのAmpli1(商標)水及び25ngのWGAにより精製されたDNA。
Ion Torrentアダプターが設けられたフラグメントライブラリーに対応するバーコード化再増幅したWGA産物を、2100 Bioanalyzer(商標)(Agilent)でAgilentのDNA 7500キットによって適格にし、Qubit(商標) dsDNA HSアッセイキットを用いて定量化し、最終プールを得た。
鋳型調製を、Ion PGM(商標) Hi−Q OT2キット−400bpのユーザーガイドに従って行った。
DRS−WGA後のIon Torrent ProtonでのLPWGSのプロトコル
1. 確定的制限部位全ゲノム増幅(DRS−WGA)
単一細胞DNAを、先の実施例に詳述されるようにAmpli1(商標) WGAキット(Menarini Silicon Biosystems)を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。
5μLのWGAにより増幅されたDNAを、Ampli1(商標) ReAmp/dsキットを用い、製造プロトコルに従って二本鎖DNA(dsDNA)へと変換した。このプロセスにより、一本鎖DNA(ssDNA)分子のdsDNA分子への変換が確実となる。
6μLのdsDNA合成産物を、44μLのNuclease−Free Waterを添加することで希釈し、結合していないオリゴヌクレオチド、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去するためにAgencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter)によって精製した。ビーズを用いたDNA精製を以下のプロトコルに従って行った。75μL(比率:サンプル体積の1.5倍)のAgencourt AMPure XPビーズを各50μlのサンプルに添加し、ボルテックスによって混合した。次いで、混合反応物を室温(RT)で15分間、マグネット外でインキュベートした後、溶液が透明になり、ペレットが形成されるまで(約5分間)マグネットプレート上に置いた。次いで、上清を除去し、ペレットをかき乱すことなく廃棄し(およそ5μlが残り得る)、チューブをマグネットプレート上に置いたままでビーズを150μLの新たに作製した70%EtOHで2回洗浄した。残留エタノール溶液を全てチューブの底から除去した後、ビーズペレットを短時間風乾した。22μLの10mM Tris Ultrapure(pH8.0)及び0.1mM EDTA(Low TE)バッファーを添加し、混合反応物を室温で2分間、マグネットプレート外でインキュベートし、続いてマグネットプレート上で5分間のインキュベーションを行った。20μLの溶出物を新たなチューブに移した。
SPRI選択は、次世代シークエンシングのためのフラグメントライブラリー調製の核酸サイズ選択を促進し、単純化するSPRIベースのケミストリーである。この工程を工程3に代替して行うことができた。6μLのdsDNA合成産物を、44μLのNuclease−Free Waterを添加することで希釈し、結合していないオリゴヌクレオチド、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去し、平均サイズ前後のフラグメントの一様な分布を生じさせるためにSPRI選択ビーズ(Beckman Coulter)によって精製した。SPRIによるDNA精製を以下のプロトコルに従って行った。37.5μL(比率:サンプル体積の0.75倍)のSPRI選択ビーズを各50μlのサンプルに添加し、ボルテックスによって混合した。次いで、混合反応物をRTで15分間、マグネット外でインキュベートした後、溶液が透明になり、ペレットが形成されるまで(約5分間)マグネットプレート上に置いた。次いで、上清を回収し、新たなチューブに移した。2回目の精製を、37.5μLのSPRI選択ビーズを上清に添加して行い、ボルテックスによって混合した。次いで、混合反応物をRTで15分間、マグネット外でインキュベートした後、溶液が透明になり、ペレットが形成されるまで(約5分間)マグネットプレート上に置いた。次いで、上清を除去し、ペレットをかき乱すことなく廃棄し(およそ5μlが残り得る)、チューブをマグネットプレート上に置いたままでビーズを150μLの新たに作製した80%EtOHで2回洗浄した。残留エタノール溶液を全てチューブの底から除去した後、ビーズペレットを短時間風乾した。22μLのLow TEバッファーを添加し、混合反応物を室温で2分間、マグネット外でインキュベートし、続いてマグネットプレート上で5分間のインキュベーションを行った。20μLの溶出物を新たなチューブに移した。
バーコード化再増幅を、Ampli1(商標) PCRキット(Menarini Silicon Biosystems)を用いて50μl容量で行った。各PCR反応物は、以下のもので構成される:5μlのAmpli1(商標) PCR Reaction Buffer(10倍)、1μlの配列番号1〜配列番号96の1つの25μMプライマー:
(1)(5’−CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG[BC]AGTGGGATTCCTGCTGTCAGT−3’)
(ここで、[BC]=バーコード配列である)、1μlの配列番号97の25μMプライマー:
(2)(5’−CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATAGTGGGATTCCTGCTGTCAGT−3’)
、1.75μlのAmpli1(商標) PCR dNTP(10mM)、1.25μlのBSA、0.5 Ampli1(商標) PCR Taq Polymerase(FAST start)、37.5μlのAmpli1(商標)水及び2μlのdsにより精製されたDNA。これらは、Ion Torrent PGMに使用される同じプライマーであり、上記に示したIon TorrentライブラリーのためのNGS再増幅プライマー(PGM/ProtonのためのDRS WGA)の対応する表に報告する。
バーコード化再増幅したdsDNA産物を、1.5倍(75μl)の比率のAMPure XPビーズを用い、上記の工程3に従って精製し、35μlのLow TEバッファー中で溶出させた。溶出物を新たなチューブに移し、続いてQubit(商標) 2.0 FluorometerでdsDNA HSアッセイによって定量化し、最終等モルサンプルプールを得た。異なるA−LIB−BC−Xアダプターを有する各々のライブラリーを同じ量で合わせることによって等モルプールを作製し、42μLの最終容量で34ng/μLの濃度の最終プールを得た。
Size Select 2%プレキャストアガロースゲル(Invitrogen)と組み合わせたE−Gel(商標) SizeSelect(商標)システムを、製造業者の使用説明書に従って対象のフラグメントのサイズ選択に使用した。
精製工程後の等モルプールを、2100 Bioanalyzer(商標)(Agilent)でAgilentのDNA高感度キットによって適格にし、Qubit(商標) dsDNA HSアッセイキットを用いて定量化した。最後に、等モルプールを100pMの最終濃度まで希釈した。
Illumina MiSeqでのローパス全ゲノムシークエンシングのプロトコル
プロトコル1
確定的制限部位全ゲノム増幅(DRS−WGA):
単一細胞DNAを、Ampli1(商標) WGAキット(Silicon Biosystems)を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。5μLのWGAにより増幅されたDNAを、5μLのNuclease−Free Waterの添加によって希釈し、Agencourt AMPure XPシステムを用いて精製した(比率1.8倍)。DNAを12.5μL中で溶出させ、Qubit(商標) 2.0 FluorometerでのdsDNA HSアッセイによって定量化した。
バーコード化再増幅を、50μlの容量でAmpli1(商標) PCRキット(Menarini Silicon Biosystems)を用いて図4に概略的に示されるように行った。各PCR反応物は、以下のもので構成される:5μlのAmpli1(商標) PCR Reaction Buffer(10倍)、1μlの配列番号195〜配列番号202の1つのプライマー(25μM)、1μlの配列番号203〜配列番号214の1つのプライマー(25μM)、1.75μlのAmpli1(商標) PCR dNTP(10mM)、1.25μlのBSA、0.5 Ampli1(商標) PCR Taq Polymerase、25ngのWGAにより精製されたDNA、及び50μlの最終容量に達するまでのAmpli1(商標)水。
次いで、ライブラリーを等モル濃度で合わせ、濃度28.6ng/μL及び最終容量100μLで得られるプールを、SPRIビーズを用いた二重精製によってサイズ選択した。簡潔に述べると、SPRIビーズをPCRグレード水で2倍希釈した。160μLの希釈SPRIビーズを100μlのプールに添加した。インキュベーション後に、25μLの上清を新たなバイアルに移し、30μLの希釈SPRIビーズを添加した。DNAを20μLのlow TE中で溶出させた。フラグメントサイズを2100 Bioanalyzer高感度チップ(Agilent Technologies)によって検証し、ライブラリー定量化を、Kapa Library定量化キットを用いるqPCRによって行った。
4nMのサイズ選択プールを、NaOH(0.1Nに等しいNaOH最終濃度)で5分間変性させた。次いで、変性させたサンプルをHT1で希釈して、1mM NaOH中の20pM変性ライブラリーを得た。570μLの20pM変性ライブラリー及び30μlの20pM変性PhiX対照をMiSeq(Illumina)でロードした。
以下の表に、Illuminaプラットホームに適合するプライマーDRS−WGAの構造(5’→3’方向の配列、5’及び3’を除外)を示す。
以下の表に、Illuminaプラットホームに適合するプライマーMALBAC−WGAの構造(5’→3’方向の配列、5’及び3’を除外)を示す。
Illuminaプロトコル1によって得られるライブラリーは、考え得る全てのP5/P7アダプター組合せ対を有する二本鎖pWGA libである。
本発明による第2のプロトコルを例として提示する。本プロトコルは、pWGAlibから両方のシークエンシングアダプター(P5/P7)を含むフラグメントのみを選択し、同種のシークエンシングアダプター(P5/P5rc、P7rc/P7)を有するフラグメントを切り捨てることによってIlluminaフローセルにおけるクラスターの品質を高めるために有利であり得る。
WGAにより増幅されたDNA産物は全て、長さが異なり、特定のタグ:個々のssDNA分子の各々の5’末端のLIB配列及び3’末端の相補的なLIB配列(図面中に青色で示される)を有する分子によって構成される。
5’−P5−i5−LIB−挿入断片−LIB相補鎖−i7−P7−3’
をストレプトアビジンビーズにより選択する。
(1PR)5’−P5−i5−LIB−3’、及び、
(2PR)ビオチン−5’−P7rc−i7rc−LIB−3’(以下ではビオチンを説明の単純化のために省略するが、P7rcで始まるフラグメントの全てに、5’末端にのみ存在することが明らかである)。
開始:(WGA ssDNAフラグメントは全て、5’−LIB−nnn−LIBrc−3’として形成される)
伸長サイクルn=1):
1.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−3’、
1.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−3’
2^nのフラグメント(0%シークエンシング可能)
サイクルn=2):
2.5.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’
2.5.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’
2.7.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’
2.7.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’
2^n=4のフラグメント(25%のシークエンシング可能なフラグメント)
サイクルn=3):
2.5.5.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’=2.5.5
2.5.5.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’=2.5.7
2.5.7.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’=2.7.5
2.5.7.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’=2.7.7
2.7.5.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’=2.5.5
2.7.5.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’=2.5.7
2.7.7.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’=2.7.5
2.7.7.7 5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’=2.7.7
2^n=8のフラグメント(25%のシークエンシング可能なフラグメント) シークエンシング可能なフラグメント=2^n/4=2^n/2^2=2^(n−2)
サイクルm) ... 2^(m−2) シークエンシング可能
2.5.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’(→全てのビオチン化フラグメントが常磁性ビーズ上に保持される一方で第1の液体除去時に洗い流されるか、又は洗い流されない場合には、フローセル内の唯一の結合部位に連結するが、架橋増幅が起こらないことからシークエンシングクラスターを生成しない)
2.5.7 ビオチン−5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i5rc−P5rc−3’(→ストレプトアビジンコーティングビーズによって除去される)
2.7.5 5’−P5−i5−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’(→シークエンシング可能)
2.7.7 ビオチン−5’−P7rc−i7rc−LIB−nnn−LIBrc−i7−P7−3’(→ストレプトアビジンコーティングビーズによって除去される)。
1.確定的制限部位全ゲノム増幅(DRS−WGA)
単一細胞DNAを、Ampli1(商標) WGAキット(Silicon Biosystems)を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。
5μLのWGAにより増幅されたDNAを、5μLのNuclease−Free Waterを添加することによって希釈し、結合していないオリゴ、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去するためにAgencourt AMPure XPシステム(Beckman Coulter)を用いて精製する。
(3)5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]GCTCTCCGTAGTGGGATTCCTGCTGTCAGTTAA3’)
1μLの配列番号243〜配列番号254の1つの25μMプライマー:
(4)(5’/Biosg/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GCTCACCGAAGTGGGATTCCTGCTGTCAGTTAA3’)
、1.75μlのAmpli1(商標) PCR dNTP(10mM)、1.25μlのBSA、0.5 Ampli1(商標) PCR Taq Polymerase、及び25ngのWGAにより精製されたDNA、及び37.5μlのAmpli1(商標)水。
Illuminaアダプターが設けられたフラグメントライブラリーに対応するバーコード化再増幅したWGA産物を、2100 Bioanalyzer(商標)(Agilent)でAgilentのDNA 7500キットによって適格にし、Qubit(商標) dsDNA HSアッセイキットを用いて定量化し、最終プールを得た。
フラグメント選択を、P5/P7アダプターを含有する非ビオチン化DNAのみを解離させるためにDynabeads(商標) MyOne(商標) Streptavidin C1システムを用いて行ったが、これは熱又はNaOHをそれぞれ用いて得ることができた。2つの方法を下記に説明する。
4nMの最終プールをNaOH(0.1Nに等しいNaOH最終濃度)で5分間変性させた。次いで、変性サンプルをHT1で希釈し、1mM NaOH中の20pM変性ライブラリーを得た。570μLの20pM変性ライブラリー及び30μlの20pM変性PhiX対照をMiSeq(Illumina)でロードした。
以下の表に、Illuminaプロトコル2の最終プライマー配列を報告する。
以下の表に、出発物質がWGA−MALBACライブラリーに由来する場合に適合したIllumina最終プライマー配列を報告する。
シークエンシングリードを、BWA MEMアルゴリズム(Li H. and Durbin R., 2010)を用いてhg19ヒト参照ゲノムにアラインメントした。PCR重複、二次/補助/QC不合格(not-passing-QC)アラインメント及びmultimapperリードを、Picard MarkDuplicates(http://broadinstitute.github.io/picard/)及びsamtools(Li H. et al, 2009)を用いてフィルタリングした。カバレッジ分析を、BEDTools(Quinlan A. et al, 2010)を用いて行った。
Claims (27)
- 超並列シークエンシングライブラリーを生成する方法であって、
a. 既知の5’配列セクション(5SS)と、中央配列セクション(MSS)と、該既知の5’配列セクションに逆相補的な既知の3’配列セクション(3SS)とを含むフラグメントを含む一次WGA DNAライブラリー(pWGAlib)を準備する工程であって、前記既知の5’配列セクション(5SS)がWGAライブラリー汎用配列アダプターを含み、前記中央配列セクション(MSS)が、WGA前の元の非増幅DNAのDNA配列に対応する挿入セクション(IS)を少なくとも含み、前記中央配列セクションが任意に、隣接5’中間セクション(F5)及び/又は隣接3’中間セクション(F3)を更に含む、工程と、
b. 前記一次WGA DNAライブラリーを、少なくとも1つの第1プライマー(1PR)及び少なくとも1つの第2プライマー(2PR)を用いて再増幅する工程と、
を含み、
前記少なくとも1つの第1プライマー(1PR)が、第1プライマー5’セクション(1PR5S)と第1プライマー3’セクション(1PR3S)とを含み、該第1プライマー5’セクション(1PR5S)が、少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)と、該少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)の3’位かつ前記第1プライマー3’セクション(1PR3S)の5’位に少なくとも1つの第1シークエンシングバーコード(1PR5BC)とを含み、前記第1プライマー3’セクション(1PR3S)が、前記既知の5’配列セクション(5SS)又は前記既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズし、
前記少なくとも1つの第2プライマー(2PR)が、第2プライマー5’セクション(2PR5S)と第2プライマー3’セクション(2PR3S)とを含み、該第2プライマー5’セクション(2PR5S)が、前記少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)とは異なる少なくとも1つの第2シークエンシングアダプター(2PR5SA)を含み、前記第2プライマー3’セクション(2PR3S)が、前記既知の5’配列セクション(5SS)又は前記既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズする、方法。 - 前記第2プライマー(2PR)が、前記少なくとも1つの第2シークエンシングアダプター(2PR5SA)の3’位かつ前記第2プライマー3’セクション(2PR3S)の5’位に少なくとも1つの第2シークエンシングバーコード(2PR5BC)を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記WGAライブラリー汎用配列アダプターが、DRS−WGAライブラリー汎用配列アダプター又はMALBACライブラリー汎用配列アダプターである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記WGAライブラリー汎用配列アダプターがDRS−WGAライブラリー汎用配列アダプターである、請求項3に記載の方法。
- 前記DRS−WGAライブラリー汎用配列アダプターが配列番号282であり、前記MALBACライブラリー汎用配列アダプターが配列番号283(MALBAC)である、請求項3又は4に記載の方法。
- ローパス全ゲノムシークエンシングの方法であって、
c. 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によって得られる複数のバーコード化された超並列シークエンシングライブラリーを準備すると共に、種々のシークエンシングバーコード(BC)を用いて得られるサンプルをプールする工程と、
d. プールしたライブラリーをシークエンシングする工程と、
を含む、方法。 - 種々のシークエンシングバーコード(BC)を用いたサンプルをプールする工程が、
e)前記バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの各々におけるDNAを定量化する工程と、
f)バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの量を正規化する工程と、
を更に含む、請求項6に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。 - 種々のシークエンシングバーコード(BC)を用いたサンプルをプールする工程が、少なくとも1つの選択塩基対範囲を有するDNAフラグメントを選択する工程を更に含む、請求項7に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記塩基対範囲が650bpを中心とする、請求項8に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記塩基対範囲が400bpを中心とする、請求項8に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記塩基対範囲が200bpを中心とする、請求項8に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記塩基対範囲が150bpを中心とする、請求項8に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記塩基対範囲が100bpを中心とする、請求項8に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記塩基対範囲が50bpを中心とする、請求項8に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 第1シークエンシングアダプターと第2シークエンシングアダプターとを含むDNAフラグメントを選択する工程を更に含む、請求項8〜14のいずれか一項に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記第1シークエンシングアダプター及び前記第2シークエンシングアダプターを含むDNAフラグメントを選択する工程を、前記超並列シークエンシングライブラリーを少なくとも1つの固相に接触させることによって行う、請求項15に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記少なくとも1つの固相が官能化常磁性ビーズを含む、請求項16に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記常磁性ビーズがストレプトアビジンコーティングで官能化される、請求項17に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 少なくとも1つの第1プライマー(1PR)及び少なくとも1つの第2プライマー(2PR)の一方が5’末端でビオチン化され、選択フラグメントが前記ビーズから非ビオチン化ssDNAフラグメントを溶出させることで得られる、請求項18に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- 前記少なくとも1つの第2プライマーが5’末端でビオチン化される、請求項19に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
- g)再増幅されたWGA dsDNAライブラリーを前記官能化常磁性ビーズと共に設計条件下でインキュベートすることにより、ビオチンと該官能化常磁性ビーズに割り当てられたストレプトアビジンとの間に共有結合を生じさせる工程と、
h)結合していない非ビオチン化dsDNAフラグメントを洗い流す工程と、
i)前記官能化常磁性ビーズから残留ssDNAフラグメントを溶出させる工程と、
の更なる工程を更に含む、請求項18〜20のいずれか一項に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。 - 超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
第1プライマー5’セクション(1PR5S)と第1プライマー3’セクション(1PR3S)とを含み、該第1プライマー5’セクション(1PR5S)が、少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)と、該少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)の3’位かつ前記第1プライマー3’セクション(1PR3S)の5’位に少なくとも1つの第1シークエンシングバーコード(1PR5BC)とを含み、前記第1プライマー3’セクション(1PR3S)が、一次WGA DNAライブラリー(pWGAlib)のフラグメントのWGAライブラリー汎用配列アダプターを含む既知の5’配列セクション(5SS)又は該既知の5’配列セクションに逆相補的な既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズし、前記フラグメントが前記既知の5’配列セクション(5SS)の3’かつ前記既知の3’配列セクション(3SS)の5’の中央配列セクション(MSS)を更に含む、1つの第1プライマー(1PR)、
第2プライマー5’セクション(2PR5S)と第2 3’セクション(2PR3S)とを含み、該第2プライマー5’セクション(2PR5S)が、前記少なくとも1つの第1シークエンシングアダプター(1PR5SA)とは異なる少なくとも1つの第2シークエンシングアダプター(2PR5SA)を含み、前記第2 3’セクションが、前記フラグメントの前記既知の5’配列セクション(5SS)又は前記既知の3’配列セクション(3SS)のいずれかにハイブリダイズする、1つの第2プライマー(2PR)、
を少なくとも含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。 - 超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
a. 配列番号97(表2)のプライマー及び配列番号1〜配列番号96(表2)からなる群から選択される1つ以上のプライマー、又は、
b)配列番号194(表2)のプライマー及び配列番号98〜配列番号193(表2)からなる群から選択される1つ以上のプライマー、又は、
c)配列番号195〜配列番号202(表4)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号203〜配列番号214(表4)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、又は、
d)配列番号215〜配列番号222(表6)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号223〜配列番号234(表6)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、又は、
e)配列番号235〜配列番号242(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号243〜配列番号254(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、又は、
f)配列番号259〜配列番号266(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー及び配列番号267〜配列番号278(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、
を含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。 - 超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
最適なシングルリードシークエンシングプロセスが行われるように設計された、
配列番号235〜配列番号242(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、配列番号243〜配列番号254(表7)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、配列番号255のカスタムシークエンシングプライマー、及び配列番号256若しくは配列番号258のプライマー、又は、
配列番号259〜配列番号266(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、配列番号267〜配列番号278(表8)からなる群から選択される少なくとも1つのプライマー、並びに配列番号279及び配列番号280のプライマー、
を含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。 - 選択シークエンシングプラットホームにおいて最適なペアエンドシークエンシングプロセスが行われるように設計された、配列番号257(表7)及び配列番号281(表8)から選択されるプライマーを更に含む、請求項24に記載の超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
- 熱安定性DNAポリメラーゼを更に含む、請求項22〜25のいずれか一項に記載の超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
- ゲノムワイドコピー数プロファイリングの方法であって、
a. 請求項22又は23に記載のシークエンシングライブラリー調製キットを用いて開発されたDNAライブラリーをシークエンシングする工程と、
b. ゲノムの異なる領域にわたるシークエンシングリード密度を分析する工程と、
c. 前記ゲノムの領域についてのコピー数の値を、該領域におけるリード数を参照ゲノムの同じ領域において予測されたリード数に対して比較することによって決定する工程と、
を含む、方法。
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