WO2017209122A1 - 標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質 - Google Patents

標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質 Download PDF

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WO2017209122A1
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fusion protein
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aspartic acid
ppr
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PCT/JP2017/020076
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崇裕 中村
祐介 八木
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国立大学法人九州大学
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein for improving the protein expression level from a target mRNA.
  • Zinc finger nuclease ZFN
  • TALEN TAL Effector Nuclease
  • Crispr-cas9 etc. are known as techniques using protein factors that act on DNA, but protein factors that act specifically on RNA were used. Technology development is still limited.
  • PPR protein protein having a pentatripeptide repeat (PPR) motif
  • PPR pentatripeptide repeat
  • Patent Document 1 an amino acid that functions when the PPR motif exerts RNA binding properties is identified, and the relationship between the structure of the PPR motif and the target base has been clarified. It was possible to construct a protein having a PPR motif capable of binding to the RNA having it. However, a method for actually controlling a target RNA using the technique described in Patent Document 1 has not been found so far.
  • the present inventors have found that a fusion protein of a predetermined functional domain and the PPR protein is capable of expressing the protein from the target mRNA.
  • the inventors have found that the amount can be improved and have completed the present invention.
  • the present invention in one embodiment, is a fusion protein for improving the protein expression level from the target mRNA
  • the fusion protein is (A) one or a plurality of functional domains that improve protein expression from mRNA, and (B) a polypeptide portion that can bind to a target mRNA in an RNA base-selective or RNA base sequence-specific manner, Including
  • the polypeptide part (B) is a polypeptide part comprising at least one PPR motif consisting of a 30-38 amino acid polypeptide represented by Formula 1 (Where: Helix A is a 12 amino acid long portion capable of forming an ⁇ -helix structure, and is represented by Formula 2.
  • a 1 to A 12 each independently represent an amino acid; X is absent or is a moiety consisting of 1 to 9 amino acids in length; Helix B is a part capable of forming an ⁇ -helix structure consisting of 11 to 13 amino acids in length; L is a moiety represented by Formula 3 that is 2 to 7 amino acids long;
  • each amino acid is numbered from the C-terminal side as “i” ( ⁇ 1), “ii” ( ⁇ 2), However, L iii to L vii may not exist.
  • a combination of three amino acids of A 1 , A 4 and L ii , or a combination of two amino acids of A 4 and L ii corresponds to the base or base sequence of the target mRNA, Fusion protein.
  • the polypeptide part (B) includes 2 to 30 PPR motifs, and the plurality of PPR motifs specifically bind to a base sequence of a target mRNA. It is characterized by being arranged in.
  • the polypeptide part (B) includes 5 to 25 PPR motifs.
  • the functional domain (A) is bound to the N-terminal side and / or the C-terminal side of the polypeptide part (B).
  • the functional domain of (A) is related to a domain that induces ribosomes to mRNA, a domain that is related to mRNA translation initiation or promotion, and mRNA transport to the nucleus. It is selected from the group consisting of a domain, a domain related to binding to the endoplasmic reticulum membrane, a domain containing an ER retention signal sequence, and a domain containing an endoplasmic reticulum signal sequence.
  • the domain that induces ribosomes to mRNA is a density-regulated protein (DENR), an MCT-1 (Malignant T-cell amplified sequence 1), or a TPT1 (Translationally-controlled).
  • DER density-regulated protein
  • MCT-1 Malignant T-cell amplified sequence 1
  • TPT1 Translationally-controlled
  • the domain involved in translation initiation or translation promotion of mRNA is a domain comprising all or a functional part of a polypeptide selected from the group consisting of eIF4E and eIF4G
  • the domain related to transport of the mRNA to the outside of the nucleus is a domain containing all or a functional part of SLBP (Stem-loop binding protein);
  • the domain related to the binding to the endoplasmic reticulum membrane is a polypeptide selected from the group consisting of SEC61B, TRAP-alpha (Translocator associated protein alpha), SR-alpha, Dia1 (Cytochrom b5 reductase 3), and p180.
  • the endoplasmic reticulum retention signal sequence is a signal sequence comprising a KDEL (KEEL) sequence, or
  • the endoplasmic reticulum signal sequence is a signal sequence containing MGWSCIILFLVATATGAHS (SEQ ID NO: 22).
  • a combination of three amino acids of A 1 , A 4 , and L ii in each of the above PPR motifs When bases targeted for PPR motif is A (adenine), a combination of three amino acids of A 1, A 4, and L ii is in the order of (A 1, A 4, L ii), ( valine , Threonine, asparagine), (phenylalanine, serine, asparagine), (phenylalanine, threonine, asparagine), (isoleucine, asparagine, aspartic acid), or (threonine, threonine, asparagine); When bases targeted for PPR motif is G (guanine), a combination of three amino acids of A 1, A 4, and L ii is in the order of (A 1, A 4, L ii), ( glutamic acid , Glycine, aspartic acid), (valine, threonine, aspartic acid), (lysine, threonine,
  • the combination of two amino acids of A 4 and L ii in each of the aforementioned PPR motifs is as follows: When bases targeted for PPR motif is A (adenine), a combination of two amino acids of A 4 and L ii is in the order of (A 4, L ii), (threonine, asparagine), (Serine, asparagine) or (glycine, asparagine); When the target base of the PPR motif is G (guanine), the combination of the two amino acids A 4 and L ii is (A 4 , L ii ) in the order (threonine, aspartic acid).
  • glycine, aspartic acid When bases targeted for PPR motif is U (uracil), a combination of two amino acids of A 4 and L ii is in the order of (A 4, L ii), (asparagine, aspartic acid), (proline , Aspartic acid), (methionine, aspartic acid), or (valine, threonine); When the target base of the PPR motif is C (cytosine), the combination of two amino acids of A 4 and L ii is (A 4 , L ii ) in the order (asparagine, asparagine), (Asparagine, serine) or (leucine, aspartic acid).
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention.
  • the present invention relates to a vector (preferably an expression vector) containing the nucleic acid of the present invention.
  • the present invention provides a method for improving the protein expression level from a target mRNA in a cell, Providing the fusion protein of the present invention as described above or the vector of the present invention as described above; and Introducing the fusion protein or vector into a cell, Method.
  • the cell is a eukaryotic cell.
  • the present invention is characterized in that the cell is an animal cell.
  • the animal cell is a human cell.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an effector plasmid and a reporter plasmid used in Examples, and a schematic diagram of an experimental outline.
  • FIG. 1A shows a schematic diagram of an effector plasmid and a reporter plasmid used in this Example. From the effector plasmid, a protein in which the PPR motif and eIF4G are fused is expressed. In this example, CRR4 protein, which has been well studied for target sequences, was used. From the reporter plasmid, Renilla luciferase (RLuc) and firefly luciferase (FLuc) are transcribed in the form of dicistronic mRNA.
  • RLuc Renilla luciferase
  • FLuc firefly luciferase
  • FIG. 1B shows a schematic diagram of the experimental outline of this example.
  • RLuc is translated at similar levels with or without PPR binding sequences. Therefore, the activity value of RLuc can be treated as a control for transfection with this reporter system.
  • Translation of Fluc is initiated only when PPR-eIF4G binds to the PPR binding sequence and the translation factor can be attracted by the effect of eIF4G.
  • FIG. 2 shows an experimental procedure for a reporter assay using HEK293T cells.
  • FIG. 3 shows the experimental results of Example 1.
  • FIG. 4 shows an outline of the experiment of Example 2.
  • FIG. 5 shows the results of the experiment of Example 2 and explanation of the function of each domain.
  • FIG. 6 shows the result of the experiment of Example 2 and the explanation of the function of each domain.
  • PPR motif refers to the case where the E value obtained with PF01535 in Pfam and PS51375 in Prosite is less than a predetermined value when the amino acid sequence is analyzed with a protein domain search program on the Web, unless otherwise specified.
  • the position number of the amino acid constituting the PPR motif defined in the present invention is almost the same as that of PF01535, but the number obtained by subtracting 2 from the amino acid position of PS51375 (eg, number 1 of the present invention ⁇ number 3 of PS51375) Equivalent to.
  • the conserved amino acid sequence of the PPR motif has low conservation at the amino acid level, but the two ⁇ -helices are well conserved on the secondary structure.
  • a typical PPR motif is composed of 35 amino acids, but its length is variable from 30 to 38 amino acids.
  • the PPR motif referred to in the present invention consists of a polypeptide having a length of 30 to 38 amino acids represented by Formula 1.
  • Helix A is a 12 amino acid long portion capable of forming an ⁇ -helix structure, and is represented by Formula 2.
  • a 1 to A 12 each independently represent an amino acid;
  • X is absent or is a moiety consisting of 1 to 9 amino acids in length;
  • Helix B is a part capable of forming an ⁇ -helix structure consisting of 11 to 13 amino acids in length;
  • L is a moiety represented by Formula 3 that is 2 to 7 amino acids long;
  • each amino acid is numbered from the C-terminal side as “i” ( ⁇ 1), “ii” ( ⁇ 2), However, L iii to L vii may not exist.
  • PPR protein refers to a PPR protein having one or more, preferably two or more PPR motifs, unless otherwise specified.
  • protein refers to all substances consisting of polypeptides (chains in which a plurality of amino acids are peptide-bound) unless otherwise specified, and includes those consisting of relatively low molecular weight polypeptides.
  • amino acid may refer to a normal amino acid molecule and may refer to an amino acid residue constituting a peptide chain. Which one is pointed out will be apparent to the skilled person from the context.
  • the binding property of the PPR motif to the RNA base when it is referred to as “selective”, the binding activity to any one of the RNA bases is higher than the binding activity to other bases unless otherwise specified. It's expensive. This selectivity can be determined by a person skilled in the art by planning an experiment, and can also be obtained by calculation by a person skilled in the art.
  • RNA base refers to a base of a ribonucleotide that constitutes RNA, unless otherwise specified.
  • adenine (A), guanine (G), cytosine (C), or uracil ( U) PPR protein may have selectivity for bases in RNA, but does not bind to nucleic acid monomers.
  • PPR protein is abundant in plants, and 500 proteins and about 5000 motifs can be found in Arabidopsis thaliana. There are also various PPR motifs and PPR proteins of various amino acid sequences in terrestrial plants such as rice, poplar, and flax.
  • a PPR motif and a PPR protein that exist in nature may be used, or a PPR motif and a PPR protein designed based on the method disclosed in, for example, WO2013 / 058404 may be used.
  • a desired PPR motif and PPR protein can be designed based on the following information disclosed in WO2013 / 058404.
  • the present invention can utilize the knowledge regarding the combination of three amino acids A1, A4 and Lii and / or the combination of two amino acids A4 and Lii disclosed in WO2013 / 058404.
  • the combination of the three amino acids A1, A4, and Lii is, in order, valine, asparagine, and aspartic acid.
  • the PPR motif has a selective RNA base binding ability of binding strongly to U, then to C, and then to A or G.
  • the combination of three amino acids A1, A4, and Lii is, in order, valine, threonine, and asparagine, the PPR motif binds strongly to A, then to G, then to C It has a selective RNA base binding ability that binds to but does not bind to U.
  • PPR motif and PPR protein Identification and design: One PPR motif can recognize a specific base of RNA. Based on the present invention, it is possible to select or design a PPR motif selective for each of A, U, G, and C by making the amino acid at a specific position appropriate. A protein containing the appropriate sequence of can recognize the corresponding specific sequence. Furthermore, based on the above findings, a protein having a PPR motif that can selectively bind to a desired RNA base and a plurality of PPR motifs that can bind to a desired RNA in a sequence-specific manner can be designed. At the time of design, the sequence information of the natural PPR motif may be referred to for portions other than the amino acid at an important position in the PPR motif.
  • the amino acid may be designed by substituting only the amino acids at the important positions.
  • the number of repetitions of the PPR motif can be appropriately determined depending on the target sequence, but can be 2 or more, for example, 2 to 30.
  • the PPR motif or PPR protein designed as described above can be prepared by methods well known to those skilled in the art. For example, from the designed PPR motif or PPR protein amino acid sequence, the nucleic acid sequence encoding it is determined and cloned to produce a transformant (expression vector, etc.) that produces the desired PPR motif or PPR protein. be able to.
  • the present invention relates to the above-described PPR motif or PPR protein (that is, a polypeptide capable of binding to a target mRNA in an RNA base-selective or RNA base sequence-specific manner) and the protein expression level from the mRNA. It relates to a fusion protein with one or more functional domains to be improved.
  • the “functional domain that improves the protein expression level from mRNA” that can be used in the present invention is, for example, all or a functional domain of a protein that is known to directly or indirectly promote translation of mRNA. It may be a functional part. More specifically, functional domains that can be used in the present invention include, for example, a domain that induces ribosomes to mRNA, a domain that is related to mRNA translation initiation or translation promotion, and a domain that is related to mRNA export to the nucleus. , A domain associated with binding to the endoplasmic reticulum membrane, a domain containing an ER retention signal sequence, or a domain containing an endoplasmic reticulum signal sequence.
  • the domains for inducing ribosomes into the above mRNAs are: DENR (Density-regulated protein), MCT-1 (Malignant T-cell amplified sequence 1), TPT1 (Translationally-controlled pilot, and TPT1).
  • DENR Density-regulated protein
  • MCT-1 Malignant T-cell amplified sequence 1
  • TPT1 Translationally-controlled pilot
  • TPT1 Translationally-controlled pilot
  • TPT1 Translationally-controlled pilot
  • the domain related to the transport of mRNA to the outside of the nucleus may be a domain including all or a functional part of SLBP (Stem-loop binding protein).
  • the domain related to the binding to the endoplasmic reticulum membrane is selected from the group consisting of SEC61B, TRAP-alpha (Translocated protein alpha), SR-alpha, Dia1 (Cytochrome b5 reductase 3), and p180. It may be a domain that contains all or part of a polypeptide.
  • the endoplasmic reticulum retention signal (ER retention signal) sequence may be a signal sequence including a KDEL (KEEL) sequence.
  • the endoplasmic reticulum signal sequence may be a signal sequence including MGWSCIILFLVATATGAHS (SEQ ID NO: 22).
  • the functional domain may be fused to the N-terminal side of the PPR protein, may be fused to the C-terminal side, or may be fused to both the N-terminal side and the C-terminal side.
  • the fusion protein of the present invention may contain a plurality of functional domains (for example, 2 to 5 functional domains).
  • the functional domain and the PPR protein may be indirectly fused via a linker or the like.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the fusion protein described above and a vector (for example, an expression vector) containing the nucleic acid.
  • an expression vector means, for example, a vector comprising a DNA having a promoter sequence, a DNA encoding a desired protein, and a DNA having a terminator sequence from upstream, as long as the desired function is exhibited. They are not necessarily arranged in this order.
  • various expression vectors commonly used by those skilled in the art can be used.
  • the fusion protein of the present invention utilizes the eukaryotic RNA translation mechanism, it can function in cells of eukaryotes (eg, animals, plants, microorganisms (yeasts, etc.), protists).
  • the fusion protein of the present invention can particularly function in an animal cell (in vitro or in vivo).
  • animal cells into which the fusion protein of the present invention or a vector expressing the fusion protein of the present invention can be introduced include cells derived from humans, monkeys, pigs, cows, horses, dogs, cats, mice, and rats. be able to.
  • cultured cells into which the fusion protein of the present invention or a vector expressing the fusion protein of the present invention can be introduced include, for example, Chinese hamster ovary (CHO) cells, COS-1 cells, COS-7 cells, VERO ( ATCC CCL-81) cells, BHK cells, canine kidney-derived MDCK cells, hamster AV-12-664 cells, HeLa cells, WI38 cells, 293 cells, 293T cells, PER. C6 cells can be mentioned, but are not limited thereto.
  • Example 1 Improvement of protein expression level from target mRNA by fusion protein of PPR motif and eIF4G
  • Cell culture HEK293T cell line
  • Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM, high glucose
  • FBS Fetal bovine serum
  • EDTA-NaCl solution 10 mM EDTA and 0.85% (w / v) NaCl, pH adjusted to 7.2-7.4, autoclaved, stored at room temperature 100 ⁇ 20 mm cell culture petri dish (Greiner bio one, Frickenhausen , Germany) ⁇ 10mL disposable sterile pipette ⁇ 15mL and 50mL plastic centrifuge tube ⁇ 1.8mL cryotube (Nunc; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ⁇ Freeze container (Nalgene; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ⁇ Banbanker (Lymphotec, Tokyo, Japan)
  • the luciferase gene is inserted into the expression cassette, and the PPR binding sequence is inserted into its 5′-UTR (100 ng / ⁇ L) Poly-L-lysine coated 96-well plate (AGC Techno glass, Shizuoka, Japan) 1 ⁇ phosphate-buffered saline, PBS ( ⁇ ): 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , 137 mM NaCl, and 2.7 mM KCl.
  • the reporter assay requires an effector plasmid and a reporter plasmid, both of which are constructed based on pcDNA3.1.
  • the effector plasmid side contains a PPR protein and a fusion gene encoding a partial domain (SEQ ID NO: 1) of human eIF4G (FIG. 1A).
  • CPR4 SEQ ID NO: 2 was used as the PPR protein portion.
  • the reporter plasmid contains two open reading frames (ORF), Renilla luciferase (RLuc) and firefly luciferase (FLuc), which are transcribed dicistronically (FIG. 1A).
  • the RLuc gene is located 5 ′ of the FLuc gene and was used as a control for gene expression.
  • the PPR binding region is inserted into the 5'UTR of the FLuc ORF and from 3 repeats of the CRR4 recognition sequence (5'-UAUCUUGUCUUA-3 ') (SEQ ID NO: 3) interrupted by the 4-base sequence (ATCG and GATC) Obviously.
  • the cytomegalovirus promoter (CMV) and the bovine growth hormone gene-derived polyadenylation signal were used for gene expression.
  • an effector plasmid without eIF4G was constructed by fusing a FLAG epitope tag to PPR.
  • a control reporter plasmid having no PPR binding region was constructed.
  • FIG. 1 The outline of the procedure from cell culture to reporter assay in this example is depicted in FIG.
  • Cell culture from frozen stock This process is performed aseptically. In advance, all instruments are disinfected with 70% ethanol. 1. Place 9 mL of DMEM medium in a 15 mL centrifuge tube (sterilized). 2. Thaw rapidly by incubating 1 mL of HEK293T frozen cells in a cryotube in a 37 ° C. water bath. 3. The cells are added to a 15 mL centrifuge tube containing 9 mL DMEM. 4). Centrifuge at 1100 ⁇ g for 2 minutes at room temperature and remove the supernatant. 5. The cells are resuspended in 10 mL DMEM (FBS added to a final concentration of 10%). 6).
  • the suspended cells were transferred to a 100 mm petri dish.
  • the petri dish was allowed to stand in an incubator under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cultured cells were passaged after 24 hours.
  • the cell density on the petri dish surface is maintained between 10% and 80%. Passaging is basically performed every 3 days (twice a week) or according to the cell growth rate. In addition, cells are re-cultured from frozen stock once a month to keep passage times low. Keeping passage times low and keeping cells healthy is important for efficient DNA transfection.
  • Cell cryopreservation Frozen stocks are made using Bambanker reagent and ⁇ 50% cell density cultured cells in logarithmic growth. By using Bambanker, a high recovery rate and long-term storage can be easily performed. 1. The cells on the second day after passage are detached according to the passage procedure. Add 5-10 mL of DMEM and collect cells in a 50 mL centrifuge tube. 2. Centrifuge at 1100 ⁇ g for 2 minutes at room temperature and remove the supernatant. 3. Add 1 mL of Bambanker per petri dish and suspend. 4). Dispense the suspended cells quickly into a cryotube and close the lid. 5. Place in a special freeze container and let stand at -80 ° C for 12 hours (see note 7 ). 6). Transfer to a normal sample box and store at -80 ° C or in liquid nitrogen.
  • Transient gene transfer Transfection
  • 1. Before starting, prepare the required number of petri dishes containing the cells on the second day after passage and check whether the cells are healthy (see note 8 ). With a rough estimate, 96 assays can be performed in one dish. 2.
  • the cells on the second day after passage are detached according to the passage procedure, and the suspended cells are transferred to a 50 mL centrifuge tube. 3. Centrifuge at 1100 ⁇ g for 2 minutes at room temperature and remove the supernatant. 4. Disperse the cell mass completely in 10 mL DMEM (FBS added to a final concentration of 10%). 5. The number of cells is counted using a hemocytometer and an inverted microscope.
  • the dual luciferase assay is performed using the Dual-Glo Luciferase Assay System, following the manufacturer's instructions with minor modifications. 1. 24 hours after transfection, the medium of each well is replaced with 40 ⁇ L of 1 ⁇ PBS ( ⁇ ). 2. Add 40 ⁇ L of Dual-Glo luciferase reagent to each well and mix well by pipetting. 3. Allow to stand at room temperature for 10 minutes and transfer the entire volume to a 96-well luminometer plate. 4). Luminescence by firefly luciferase for FLuc gene expression is measured with a plate reader. 5. Dilute the Stop & Glo substrate 100-fold with Dual-Glo Stop & Glo buffer. Add 40 ⁇ L of the diluted solution to each well. 6). Let stand for at least 10 minutes at room temperature, then measure luminescence by Renilla luciferase for RLuc gene expression.
  • FIG. 3 The results of the luciferase assay are shown in FIG. As shown in FIG. 3, a 2.75-fold translational activity was specifically observed in the presence of both PPR-eIF4G and a PPR binding sequence. That is, it was shown that a fusion protein of a PPR protein and a functional domain that improves the protein expression level from mRNA improves the protein expression level from the target mRNA.
  • HEK293T is a human fetal kidney cell line expressing SV40 large T antigen. This cell line is easy to culture and can be transfected efficiently with various methods. HEK293T cells are available at RIKEN BRC (ja.brc.riken.jp) or ATCC (www.atcc.org).
  • DMEM adds 1 ⁇ penicillin-streptomycin solution to avoid microbial contamination.
  • the FBS is immobilized at 56 ° C for 30 minutes and stored at 4 ° C.
  • Plasmid purity is critical to transfection efficiency. Plasmids should be isolated using transfection grade kits.
  • the dedicated freeze container is a box with adjustable freezing speed (at -80 ° C, -1 ° C per minute), and can be stored frozen in a non-programmed -80 ° C freezer. is there. (Note 8) Use cells at a culture density of 50-80% for transfection. However, the appropriate cell density depends on the transfection reagent.
  • transfection reagent ⁇ L
  • plasmid DNA ⁇ g
  • Example 2 Improvement of protein expression from target mRNA by fusion protein of PPR and other functional domains
  • the final protein synthesis amount is determined by gene insertion position, mRNA transcription amount, post-transcriptional control (control at the RNA level), post-translational modification, and the like. Therefore, a method for enhancing translation of mRNA using the fact that PPR protein binds to a target RNA molecule in a sequence-specific manner was devised (FIG. 4).
  • translation of mRNA is initiated by the translation initiation factor (eIF) intervening in the mRNA, and as a result, ribosomes are recruited near the translation initiation point.
  • eIF translation initiation factor
  • a reporter assay system using cultured animal cells was created (except that the functional domains used were different, and the experiment was performed in the same manner as described in Example 1). Performed).
  • a system was constructed using a CRR4 protein (one of the Arabidopsis PPR proteins) known to bind to a specific RNA sequence (UAUCUUGUCUUUA) (SEQ ID NO: 3).
  • CRR4 protein one of the Arabidopsis PPR proteins
  • UAUCUUGUCUUUA SEQ ID NO: 3
  • Candidate domains include (a) eIF proteins (eIF4E, eIF4G), (b) ribosome binding proteins (DENR, MCT-1, TPT1, Lelepo4), (c) Histon that facilitates transport of transcribed mRNA from the nucleus to the cytoplasm (DBP), (d) ER anchor protein (SEC61B, TRAP-alpha, SR-alpha, Dia1, p180), (e) ER retention signal (KDEL), (f) ER signal peptide .
  • the fusion protein was cloned to be expressed in the form of HA-CRR4-XX or XX-CRR4-HA (HA: epitope tag (SEQ ID NO: 4); XX: candidate domain).
  • the reporter plasmid was loaded with an expression cassette in which Renilla luciferase (RLuc) and firefly luciferase (Fluc) are transcribed in the form of dicistronic mRNA under the control of the CMV promoter.
  • RLuc Renilla luciferase
  • Fluc firefly luciferase
  • Three PPR binding sequences UAUCUUGUCUUUA) (SEQ ID NO: 3) are inserted on the 5 ′ side of Fluc.
  • the effector plasmid and the reporter plasmid were transfected into HEK293T cells, and the luminescence levels of RLUC and FLUC were measured.
  • the RLUC luminescence amount was treated as a transfection control, and the FLUC luminescence amount / RLUC luminescence amount value was treated as a translational activity amount.

Abstract

【課題】本発明は、標的ＲＮＡを制御する方法を開発することを課題とした。　【解決手段】ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる機能ドメインと、標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ塩基選択的に、または、ＲＮＡ塩基配列特異的に結合可能なＰＰＲタンパク質との融合タンパク質を提供する。

Description

標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質
　本発明は、標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための、融合タンパク質に関する。
　近年、様々な解析より明らかになった核酸結合性のタンパク質因子を用いて、意図する配列に結合する技術が確立、利用されている。この配列特異的な結合を利用することで、標的とするＤＮＡ配列の除去、またはその下流に存在するタンパク質コード遺伝子の発現の制御（活性化、又は不活化）が可能になりつつある。
　ＤＮＡに作用するタンパク質因子を利用した技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ９等が知られているが、ＲＮＡに特異的に作用するタンパク質因子を利用した技術の開発はいまだ限定されている。
　本発明者らは、主に植物が有するタンパク質であるＰＰＲタンパク質（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＰＰＲ）モチーフを有するタンパク質）の特性を利用して、標的ＲＮＡの配列に対して特異的に結合することができるタンパク質の設計方法を提案してきた（特許文献１）。
ＷＯ２０１３／０５８４０４
　特許文献１の開示においては、ＰＰＲモチーフがＲＮＡ結合特性を発揮する際に機能するアミノ酸を同定し、ＰＰＲモチーフの構造と標的塩基との関係が明らかにしたことで、任意の配列、長さを有するＲＮＡに結合可能な、ＰＰＲモチーフを有するタンパク質の構築を可能とした。しかし、特許文献１に記載の技術を利用して、実際に標的ＲＮＡを制御する方法は、これまで見出されていなかった。
　本発明者らは、ＰＰＲタンパク質を利用し、標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための方法を鋭意検討した結果、所定の機能ドメインとＰＰＲタンパク質との融合タンパク質が、標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させ得ることを見出し、本発明を完成させるに到った。
　すなわち本発明は、一実施形態において、標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質であって、
　前記融合タンパク質は、
　（Ａ）ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる、１または複数の機能ドメイン、および
　（Ｂ）標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ塩基選択的に、または、ＲＮＡ塩基配列特異的に結合可能なポリペプチド部分、
を含み、
　前記（Ｂ）のポリペプチド部分が、式１で表される３０～３８アミノ酸長のポリペプチドからなるＰＰＲモチーフを１個以上含む、ポリペプチド部分であり
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中：
　Ｈｅｌｉｘ　Ａは、１２アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式２で表され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　　式２中、Ａ１～Ａ１２はそれぞれ独立にアミノ酸を表し；
　Ｘは、存在しないか、または、１～９アミノ酸長からなる部分であり；
　Ｈｅｌｉｘ　Ｂは、１１～１３アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり；
　Ｌは、２～７アミノ酸長の、式３で表される部分であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　　式３中、各アミノ酸は、“ｉ”（－１）、“ｉｉ”（－２）、とＣ末端側からナンバリングされ、
　　ただし、Ｌｉｉｉ～Ｌｖｉｉは存在しない場合がある。）
　Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせ、又はＡ４、Ｌｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、標的ｍＲＮＡの塩基または塩基配列に対応したものとなっている、
融合タンパク質、に関する。
　また、本発明は、一実施形態において、前記（Ｂ）のポリペプチド部分は、前記ＰＰＲモチーフを２～３０個含み、前記複数のＰＰＲモチーフが、標的ｍＲＮＡの塩基配列に特異的に結合するように配置されていることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記（Ｂ）のポリペプチド部分が、前記ＰＰＲモチーフを５～２５個含むことを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記（Ａ）の機能ドメインが、前記（Ｂ）のポリペプチド部分のＮ末端側および／またはＣ末端側に結合されていることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記（Ａ）の機能ドメインが、ｍＲＮＡへリボソームを誘導するドメイン、ｍＲＮＡの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメイン、ｍＲＮＡの核外への輸送に関連するドメイン、小胞体膜への結合に関連するドメイン、小胞体保留シグナル（ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列を含むドメイン、および、小胞体シグナル配列を含むドメイン、からなる群から選択されることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記ｍＲＮＡへリボソームを誘導するドメインが、ＤＥＮＲ（Ｄｅｎｓｉｔｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＣＴ－１（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１）、ＴＰＴ１（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、および、Ｌｅｒｅｐｏ４（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ＣＣＣＨ－ｄｏｍａｉｎ）からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
　前記ｍＲＮＡの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメインが、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇからなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
　前記ｍＲＮＡの核外への輸送に関連するドメインが、ＳＬＢＰ（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の全部または機能的な一部を含むドメインであり、
　前記小胞体膜への結合に関連するドメインが、ＳＥＣ６１Ｂ、ＴＲＡＰ－ａｌｐｈａ(Ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｐｈａ)、ＳＲ－ａｌｐｈａ、Ｄｉａ１（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　３）、および、ｐ１８０からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
　前記小胞体保留シグナル（ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列は、ＫＤＥＬ（ＫＥＥＬ）配列を含むシグナル配列であり、または、
　前記小胞体シグナル配列は、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ（配列番号２２）を含むシグナル配列である、ことを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＡ（アデニン）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（バリン、トレオニン、アスパラギン）、（フェニルアラニン、セリン、アスパラギン）、（フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、または（トレオニン、トレオニン、アスパラギン）であり；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸）、（バリン、トレオニン、アスパラギン酸）、（リジン、トレオニン、アスパラギン酸）、または（ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸）であり；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）、（フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸）、または（チロシン、プロリン、アスパラギン酸）であり；または、
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（バリン、アスパラギン、セリン）、または（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）である、ことを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＡ（アデニン）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン）、
（セリン、アスパラギン）、または（グリシン、アスパラギン）であり；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン酸）
または（グリシン、アスパラギン酸）であり；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン酸）、（プロリン、アスパラギン酸）、（メチオニン、アスパラギン酸）、または（バリン、トレオニン）であり；
　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン）、
（アスパラギン、セリン）、または（ロイシン、アスパラギン酸）である、ことを特徴とする。
　また、本発明は、他の実施形態において、上記の本発明の融合タンパク質をコードする、核酸に関する。
　また、本発明は、他の実施形態において、上記の本発明の核酸を含む、ベクター（好ましくは発現ベクター）に関する。
　また、本発明は、他の実施態様において、細胞内で標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる方法であって、
　上記の本発明の融合タンパク質、または、上記の本発明のベクターを準備するステップ、および、
　前記融合タンパク質、または、ベクターを細胞内へ導入するステップ、を含む、
方法、に関する。
　また、本発明は、一実施態様において、前記細胞が、真核生物の細胞であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施態様において、前記細胞が、動物細胞であることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施態様において、前記動物細胞が、ヒト細胞であることを特徴とする。
　上記に述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
図１は、実施例において用いたエフェクタープラスミドおよびレポータープラスミドの模式図、および、実験概要の模式図を示す。図１Ａは、本実施例において用いたエフェクタープラスミドとレポータープラスミドの模式図を示す。エフェクタープラスミドからは、ＰＰＲモチーフとｅＩＦ４Ｇを融合したタンパク質が発現する。本実施例では、標的配列に関してよく研究が進んでいるＣＲＲ４タンパク質を使用した。レポータープラスミドからは、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）がジシストロニックｍＲＮＡの形で転写される。ＰＰＲ結合配列（ここではＣＲＲ４結合配列）は、ＦＬｕｃの５’側に挿入した。図１Ｂは、本実施例の実験概要の模式図を示す。ＰＰＲ結合配列の有無に関係なくＲＬｕｃは同様のレベルで翻訳される。そのためＲＬｕｃの活性値は、このレポーターシステムでのトランスフェクションのコントロールとして扱うことができる。Ｆｌｕｃの翻訳は、ＰＰＲ－ｅＩＦ４ＧがＰＰＲ結合配列へ結合し、ｅＩＦ４Ｇの効果によって翻訳因子を引き寄せることが出来た時のみ開始される。一方、ＰＰＲ結合配列が存在せず、ＰＰＲ－ｅＩＦ４Ｇが結合できない場合はＦＬｕｃの翻訳は低レベルのままである。 図２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたレポーターアッセイの実験手順を示す。 図３は、実施例１の実験結果を示す。配列特異的な翻訳活性化は、ＣＲＲ４－ｅＩＦ４ＧとＰＰＲ結合配列に依存する。この実験では、ＣＲＲ４－Ｆｌａｇ（翻訳活性化因子なし、白色）もしくはＣＲＲ４－ｅＩＦ４Ｇ（翻訳活性化因子あり、灰色）を挿入したエフェクタープラスミドと、ＰＰＲ結合配列を挿入、もしくは非挿入のレポーターベクターを使って行われた。結果は、ＰＰＲ－ｅＩＦ４ＧとＰＰＲ結合配列の両方の存在下で特異的に２．７５倍の翻訳活性が認められた。値は平均と標準偏差を示す（Ｎ＝３）。 図４は、実施例２の実験の概要を示す。 図５は、実施例２の実験の結果、および、それぞれのドメインの機能の説明を示す。 図６は、実施例２の実験の結果、および、それぞれのドメインの機能の説明を示す。
［ＰＰＲモチーフ及びＰＰＲタンパク質］
　本発明で「ＰＰＲモチーフ」というときは、特に記載した場合を除き、Ｗｅｂ上のタンパク質ドメイン検索プログラムでアミノ酸配列を解析した際に、ＰｆａｍにおいてＰＦ０１５３５、ＰｒｏｓｉｔｅにおいてＰＳ５１３７５で得られるＥ値が所定値以下（望ましくはＥ－０３）のアミノ酸配列をもつ３０～３８アミノ酸で構成されるポリペプチドをいう。本発明で定義するＰＰＲモチーフを構成するアミノ酸の位置番号は、ＰＦ０１５３５とほぼ同義である一方で、ＰＳ５１３７５のアミノ酸の場所から２引いた数（例；本発明の１番→ＰＳ５１３７５の３番）に相当する。ただし、“ｉｉ”（－２）番のアミノ酸というときは、ＰＰＲモチーフを構成するアミノ酸の後ろ（Ｃ末端側）から２番目のアミノ酸、又は次のＰＰＲモチーフの１番アミノ酸に対して２コＮ末端側、すなわち－２番目のアミノ酸とする。次のＰＰＲモチーフが明確に同定されない場合、次のヘリックス構造の１番目のアミノ酸に対して、２コ前のアミノ酸を“ｉｉ”とする。Ｐｆａｍについてはｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／、Ｐｒｏｓｉｔｅについては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／を参照することができる。
　ＰＰＲモチーフの保存アミノ酸配列は、アミノ酸レベルでの保存性は低いが、２次構造上で２つのαへリックスはよく保存されている。典型的なＰＰＲモチーフは３５アミノ酸で構成されるが、その長さは３０～３８アミノ酸と可変的である。
　本発明でいうＰＰＲモチーフは、より具体的には、式１で表される、３０～３８アミノ酸長のポリペプチドからなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中：
　Ｈｅｌｉｘ　Ａは、１２アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式２で表され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　　式２中、Ａ１～Ａ１２はそれぞれ独立にアミノ酸を表し；
　Ｘは、存在しないか、または、１～９アミノ酸長からなる部分であり；
　Ｈｅｌｉｘ　Ｂは、１１～１３アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり；
　Ｌは、２～７アミノ酸長の、式３で表される部分であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　　式３中、各アミノ酸は、“ｉ”（－１）、“ｉｉ”（－２）、とＣ末端側からナンバリングされ、
　　ただし、Ｌｉｉｉ～Ｌｖｉｉは存在しない場合がある。
　本発明で「ＰＰＲタンパク質」というときは、特に記載した場合を除き、上述のＰＰＲモチーフを、１個以上、好ましくは２個以上有するＰＰＲタンパク質をいう。本明細書で「タンパク質」というときは、特に記載した場合を除き、ポリペプチド（複数のアミノ酸がペプチド結合した鎖）からなる物質全般をいい、比較的低分子のポリペプチドからなるものも含まれる。本発明で「アミノ酸」という場合、通常のアミノ酸分子を指すことがあるほか、ペプチド鎖を構成しているアミノ酸残基を指すことがある。いずれを指しているかは、文脈から、当業者には明らかである。
　本発明で、ＰＰＲモチーフのＲＮＡ塩基との結合性に関し、「選択的」というときは、特に記載した場合を除き、ＲＮＡ塩基のいずれか一つの塩基に対する結合活性が、他の塩基に対する結合活性より高いことをいう。この選択性は、当業者であれば実験を企画し、確認することができるほか、当業者が計算により求めることもできる。
　本発明でＲＮＡ塩基というときは、特に記載した場合を除き、ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの塩基を指し、具体的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、又はウラシル（Ｕ）のいずれかをいう。なおＰＰＲタンパク質は、ＲＮＡ中の塩基に対して選択性を有しうるが、核酸モノマーに結合するわけではない。
　ＰＰＲタンパク質は植物に多く存在し、シロイヌナズナでは５００タンパク質、約５０００モチーフが見いだせる。イネ、ポプラ、イワヒバ等、多くの陸上植物にも多様なアミノ酸配列のＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質が存在する。本発明においては、自然界に存在するＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質を用いてもよいし、例えばＷＯ２０１３／０５８４０４に開示された方法に基づいて設計されたＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質を利用してもよい。具体的には、ＷＯ２０１３／０５８４０４に開示された以下の情報に基づいて、所望のＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質を設計することができる。
（Ｉ）選択的結合のために重要なアミノ酸の位置に関する情報
　ＰＰＲモチーフの、１、４、“ｉｉ”（－１）番の３つのアミノ酸の組み合わせ（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）、又は４、“ｉｉ”（－１）番の２つのアミノ酸の組み合わせ（Ａ４、Ｌｉｉ）が、ＲＮＡ塩基との選択的な結合のために重要であり、これらの組み合わせにより、結合するＲＮＡ塩基がいずれであるかを決定できる。
　本発明は、ＷＯ２０１３／０５８４０４に開示された、Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせ、および／またはＡ４、及びＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせに関する知見を利用することができる。
（ＩＩ）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせとＲＮＡ塩基との対応に関する情報
（３－１）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン及びアスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣに、その次にＡ又はＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－２）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧに、その次にＣに対して結合するが、Ｕには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－３）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＡ又はＵに対して結合するが、Ｇには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－４）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合するが、Ａ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－５）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵに、その次にＡに対して結合するが、Ｇには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－６）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＵに対して結合するが、ＡとＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－７）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、リジン、トレオニン、アスパラギン酸、の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＡに対して結合するが、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－８）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＣに、その次にＧ及びＵに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－９）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、セリンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵに対して結合するが、Ａ及びＧには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１０）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合するが、Ｇ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１１）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＡに対して結合するが、Ｇ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１２）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、トレオニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合するが、Ｇ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１３）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣに対して結合するが、Ａ及びＧには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１４）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸の場合ＰＰＲ、そのモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣに対して結合するが、Ａ及びＧには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１５）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合するが、Ａ、Ｇ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１６）Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合するが、Ａ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（ＩＩ）Ａ４、及びＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせとＲＮＡ塩基との対応に関する情報
（２－１）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣ、その次にＡ及びＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－２）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵ、その次にＡ及びＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－３）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧ、Ｕ及びＣに対して弱く結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－４）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＡ、Ｕ及びＣに対して弱く結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－５）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、セリン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧ、Ｕ及びＣに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－６）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＵ、その次にＡと結合するが、Ｃに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－７）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、アスパラギン、セリンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵ、その次にＡ及びＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－８）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＧ、Ｃ及びＣに対して結合するが、Ａに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－９）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、グリシン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧに対して結合するが、Ｃ及びＵに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－１０）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＡ、Ｇ及びＣに対して弱く結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－１１）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、ロイシン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵに対して結合するが、Ａ及びＧに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－１２）Ａ４、Ｌｉｉが、順に、バリン、トレオニンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＡに対して結合するが、Ｇ及びＣに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
［ＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質の利用］
同定および設計：
　一のＰＰＲモチーフは、ＲＮＡの特定の塩基を認識しうる。そして、本発明に基づけば、特定の位置のアミノ酸を適切にすることで、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃそれぞれに選択的なＰＰＲモチーフを選択または設計することができ、さらにはそのようなＰＰＲモチーフの適切な連続を含むタンパク質は、対応する特異的な配列を認識しうる。さらに、上述の知見により、所望のＲＮＡ塩基に選択的に結合可能なＰＰＲモチーフ、および所望のＲＮＡに配列特異的に結合可能な、複数個のＰＰＲモチーフを有するタンパク質を設計することができる。設計に際し、ＰＰＲモチーフ中の重要な位置のアミノ酸以外の部分は、天然型のＰＰＲモチーフの配列情報を参考にしてもよい。また、全体として天然型を用い、前記の重要な位置のアミノ酸だけを置換することにより、設計してもよい。ＰＰＲモチーフの繰り返し数は、標的配列に応じ、適宜とすることができるが、例えば２個以上とすることができ、２～３０個とすることができる。
　上記のように設計されたＰＰＲモチーフまたはＰＰＲタンパク質は、当業者にはよく知られた方法により調製することができる。例えば、設計されたＰＰＲモチーフまたはＰＰＲタンパク質のアミノ酸配列から、それをコードする核酸配列を決定し、クローニングし、所望のＰＰＲモチーフまたはＰＰＲタンパク質を生産する形質転換体（発現ベクター、等）を作製することができる。
融合タンパク質の調製およびその利用：
　本発明は、上記に説明したＰＰＲモチーフまたはＰＰＲタンパク質（すなわち、標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ塩基選択的に、または、ＲＮＡ塩基配列特異的に結合可能なポリペプチド）と、ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる、１または複数の機能ドメインとの融合タンパク質に関する。
　本発明において利用可能である、「ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる機能ドメイン」は、例えば、ｍＲＮＡの翻訳を直接的または間接的に促進することが知られているタンパク質の機能ドメインの全部または機能的な一部であってよい。より具体的には、本発明において利用可能である機能ドメインは、例えば、ｍＲＮＡへリボソームを誘導するドメイン、ｍＲＮＡの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメイン、ｍＲＮＡの核外への輸送に関連するドメイン、小胞体膜への結合に関連するドメイン、小胞体保留シグナル（ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列を含むドメイン、または、小胞体シグナル配列を含むドメイン、であってよい。
　さらに具体的には、上記のｍＲＮＡへリボソームを誘導するドメインは、ＤＥＮＲ（Ｄｅｎｓｉｔｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＣＴ－１（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１）、ＴＰＴ１（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、および、Ｌｅｒｅｐｏ４（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ＣＣＣＨ－ｄｏｍａｉｎ）からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであってよい。また、上記のｍＲＮＡの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメインは、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇからなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであってよい。また、上記のｍＲＮＡの核外への輸送に関連するドメインは、ＳＬＢＰ（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の全部または機能的な一部を含むドメインであってよい。また、上記の小胞体膜への結合に関連するドメインは、ＳＥＣ６１Ｂ、ＴＲＡＰ－ａｌｐｈａ(Ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｐｈａ)、ＳＲ－ａｌｐｈａ、Ｄｉａ１（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　３）、および、ｐ１８０からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであってよい。また、上記の小胞体保留シグナル（ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列は、ＫＤＥＬ（ＫＥＥＬ）配列を含むシグナル配列であってよい。また、前記小胞体シグナル配列は、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ（配列番号２２）を含むシグナル配列であってよい。
　本発明の融合タンパク質において、機能ドメインは、ＰＰＲタンパク質のＮ末端側に融合されてよく、Ｃ末端側に融合されてもよく、Ｎ末端側とＣ末端側の両方に融合されてもよい。また、本発明の融合タンパク質は、複数の機能ドメイン（例えば、２～５個の機能ドメイン）を含んでよい。さらに、本発明の融合タンパク質は、機能ドメインとＰＰＲタンパク質とがリンカー等を介して間接的に融合されていてもよい。
　本発明は、上記に説明した融合タンパク質をコードする核酸、および、当該核酸を含むベクター（例えば発現ベクター）にも関する。本明細書において、発現ベクターとは、例えば上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、およびターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターを意味するが、所望の機能を発揮する限り、必ずしもこの順に配列されている必要はない。本発明においては、当業者が通常使用し得る様々な発現ベクターを使用することができる。
　本発明の融合タンパク質は、真核生物のＲＮＡ翻訳機構を利用していることから、真核生物（例えば、動物、植物、微生物（酵母、等）、原生生物）の細胞で機能し得る。本発明の融合タンパク質は、特に、動物細胞内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ）で機能し得る。本発明の融合タンパク質、または、本発明の融合タンパク質を発現するベクターを導入し得る動物細胞としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の細胞を挙げることができる。また、本発明の融合タンパク質、または、本発明の融合タンパク質を発現するベクターを導入し得る培養細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ－１２－６６４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
実施例１：ＰＰＲモチーフとｅＩＦ４Ｇとの融合タンパク質による標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量の向上
材料
（装置）
・分子生物学実験のための基本的な施設（プラスミド構築のためなど）
・倒立顕微鏡（ＤＭ　ＩＬ　Ｓ４０，Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
・ＣＯ２インキュベーター（ＫＭ－ＣＣ１７ＲＨ２，Ｐａｎａｓｏｎｉｃ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
・クリーンベンチ（ＭＨＥ－Ｓ１３００Ａ２，Ｐａｎａｓｏｎｉｃ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
・アスピレーター（ＳＰ－３０，Ａｉｒ　Ｌｉｑｕｉｄｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｖｅｚｚｏ　ＢＳ，Ｉｔａｌｙ）
・遠心機（スイングローター）（ＬＣ－２００，Ｔｏｍｙ　Ｓｅｉｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
・超低温フリーザー（－８０°Ｃ）（ＭＤＦ－Ｃ８Ｖ，Ｐａｎａｓｏｎｉｃ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
・ｐｌａｔｅリーダー（ＥｎＳｉｇｈｔ　Ｋａｌｅｉｄｏ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）
（細胞培養）
・ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（注釈１参照）
・Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ，高グルコース）（注釈２参照）
・１００×ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液
・Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（注釈３参照）
・ＥＤＴＡ－ＮａＣｌ溶液：１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ａｎｄ　０．８５％（ｗ／ｖ）　ＮａＣｌ、ｐＨを７．２－７．４に調整、オートクレーブ滅菌、室温保存
・１００×２０ｍｍ細胞培養シャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ　ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
・１０ｍＬ使い捨て滅菌ピペット
・１５ｍＬ　ａｎｄ　５０ｍＬ　プラスチック遠沈管
・１．８ｍＬクライオチューブ（Ｎｕｎｃ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）
・フリーズコンテナ（Ｎａｌｇｅｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）
・Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
（トランスフェクション）
・エフェクタープラスミド：ｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を基本ベクターとして使用した。ＰＰＲとｅＩＦ４Ｇの融合遺伝子が発現カセットに挿入されている（１００ｎｇ／μＬ）（注釈４参照）
・レポータープラスミド：ｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を基本ベクターとして使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現カセットに挿入され、その５′－ＵＴＲにＰＰＲ結合配列が挿入されている（１００ｎｇ／μＬ）
・Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅコーティングされた９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＡＧＣ　Ｔｅｃｈｎｏ　ｇｌａｓｓ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）
・１×ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ（－）：１．４７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，８．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，ａｎｄ　２．７ｍＭ　ＫＣｌ．ｐＨを７．４に調整、オートクレーブ滅菌、室温保存
・血球計算盤（細胞数カウントのため）（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｎｅｕｂａｕｅｒ　Ｔｙｐｅ　Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｅｒ　ｐｌａｔｅ，Ｗａｔｓｏｎ，Ｈｙｏｇｏ，Ｊａｐａｎ）
・トランスフェクション試薬（ＨｉｌｙＭａｘ，Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）
（ルシフェラーゼアッセイ）
・Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ．）
・９６－ｗｅｌｌ　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ　ｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）．
実験方法
（ベクター構築）
　レポーターアッセイには、エフェクタープラスミドとレポータープラスミドが必要であり、両プラスミドともｐｃＤＮＡ３．１をもとに構築されている。エフェクタープラスミド側はＰＰＲタンパク質と、ヒトｅＩＦ４Ｇの部分的なドメイン（配列番号１）をコードする融合遺伝子を含む（図１Ａ）。ＰＰＲタンパク質部分は、ＣＲＲ４（配列番号２）を用いた。レポータープラスミド側には、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）という２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでおり、これらはジシストロニックに転写される（図１Ａ）。ＲＬｕｃ遺伝子はＦＬｕｃ遺伝子の５’側に位置しており、遺伝子発現のコントロールとして用いた。ＰＰＲ結合領域はＦＬｕｃのＯＲＦの５’ＵＴＲに挿入され、４塩基配列（ＡＴＣＧとＧＡＴＣ）によって中断されるＣＲＲ４認識配列（５’－ＵＡＵＣＵＵＧＵＣＵＵＵＡ－３’）（配列番号３）の３回の繰り返しからなる。エフェクター融合遺伝子、レポーター遺伝子ともに、それら遺伝子発現には、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）とウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニレーションシグナルが使用した。コントロール実験のために、ｅＩＦ４Ｇを有しないエフェクタープラスミドを、ＰＰＲにＦＬＡＧエピトープタグを融合することで構築した。また、ＰＰＲ結合領域を持たないコントロール用のレポータープラスミドを構築した。
　本実施例における、細胞培養からレポーターアッセイまでの手順の概略を図２に描写した。
（凍結ストックからの細胞培養）
　本工程は無菌的に実施する。あらかじめ、全ての器具は７０％エタノールで消毒する。
１．１５ｍＬ遠沈管（滅菌済）に９ｍＬのＤＭＥＭ培地を入れる。
２．クライオチューブ内の１ｍＬのＨＥＫ２９３Ｔ凍結細胞を３７℃ウォーターバスでインキュベートすることによって、素早く融解する。
３．その細胞を９ｍＬのＤＭＥＭを含んだ１５ｍＬ遠沈管に加える。
４．室温で、１１００×ｇ　、２分間の遠心を行い、上清を取り除く。
５．その細胞を、１０ｍＬのＤＭＥＭ（最終濃度が１０％になるようにＦＢＳ　を添加）に再懸濁する。
６．懸濁された細胞を１００ｍｍシャーレに移した。そのシャーレを３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに静置した。凍結ストックから培養を始めた時は、その培養細胞は２４時間後に継代した。
　健全な細胞状態を維持するために（注釈５参照）、シャーレ表面での細胞密度を１０％から８０％の間に維持する。継代は、基本的に３日毎に行い（週に２回）、もしくは細胞の成長率に応じて行う。さらに、継代回数を低く保つために、細胞は１ヶ月に１回、凍結ストックから、培養しなおす。継代回数を低く保ち、細胞の健全な状態を保つことが効率的なＤＮＡトランスフェクションにとって重要である。
（細胞維持のための継代）
１．必要枚数の新しい１００ｍｍシャーレを準備する。８ｍＬのＤＭＥＭと１ｍＬのＦＢＳを各シャーレにあらかじめ添加する。
２．培養細胞を含むシャーレ上の培地をアスピレーターで取り除く（注釈６参照）。
３．２ｍＬのＥＤＴＡ－ＮａＣｌ溶液を、シャーレ内の表面の接着細胞上に、細胞を剥がさないように、優しく加える。シャーレを旋回させて溶液を満遍なく全体に行き渡らせる。ＥＤＴＡ－ＮａＣｌ溶液をアスピレーターで取り除く。シャーレをタッピングして細胞を剥がす。
４．ＤＭＥＭ１０ｍＬをシャーレ内の細胞に加え、緩やかにピペッティングして懸濁する。
５．事前に準備された９ｍＬの培地を含むシャーレに、各１ｍＬの懸濁細胞（１０％の培養細胞）を加える。シャーレを旋回させ、全体に細胞を行き渡らせる。
（細胞の凍結保存）
　凍結ストックはＢａｍｂａｎｋｅｒ試薬と、対数増殖中の～５０％細胞密度の培養細胞を用いて作る。Ｂａｍｂａｎｋｅｒの使用により、高回収率かつ長期保存が容易に可能となる。
１．継代後２日目の細胞を継代時の手順に従い、細胞を剥がす。５－１０ｍＬのＤＭＥＭを加え、５０ｍＬの遠沈管に細胞を回収する。
２．室温で、１１００×ｇ、２分間の遠心を行い、上清を取り除く。
３．１枚のシャーレあたり１ｍＬのＢａｍｂａｎｋｅｒを加えて懸濁する。
４．懸濁細胞を素早くクライオチューブに分注し、蓋を閉める。
５．専用フリーズコンテナに入れ、－８０℃で１２時間静置する（注釈７参照）。
６．普通のサンプルボックスに移し、－８０℃もしくは液体窒素内で保存する。
（一過的な遺伝子導入（トランスフェクション））
１．始める前に、継代後２日目の細胞を含むシャーレを、必要とされる枚数を準備し、その細胞が健全（正常）であるかを確かめる（注釈８参照）。おおよその見積りで、１枚のシャーレで９６アッセイを行うことができる。
２．継代後２日目の細胞を継代時の手順に従い、細胞を剥がし、懸濁細胞を５０ｍＬの遠沈管に移す。
３．室温で、１１００×ｇ、２分間の遠心を行い、上清を取り除く。
４．１０ｍＬのＤＭＥＭ（最終濃度が１０％になるようにＦＢＳを添加）内で、細胞塊を完全に分散させる。
５．血球計算盤と倒立顕微鏡を用いて、細胞数をカウントする。１－２×１０５個／ｍＬになるように適量のＤＭＥＭ（最終濃度が１０％になるようにＦＢＳを添加）内に懸濁する。
６．９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用意し、各ｗｅｌｌあたり２００μＬ（２－４×１０４個／ｍＬ）の懸濁培養細胞を加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で一晩静置する。１ｗｅｌｌが１アッセイに使用される。
７．翌日、各ｗｅｌｌから慎重に培地を取り除き、１００μＬの新しいＤＭＥＭ（最終濃度が１０％になるようにＦＢＳを添加）と交換する。
８．４００ｎｇのエフェクタープラスミド（１００ｎｇ／μＬを４μＬ）と１００ｎｇのレポータープラスミド（１００ｎｇ／μＬを１μＬ）を、新しい９６－ｗｅｌｌ　ＰＣＲ　ｐｌａｔｅ（もしくは０．２ｍＬチューブ）上の単一ｗｅｌｌ内に加える。
９．１アッセイあたり、１μＬのＨｉｌｙＭＡＸを１０μＬの無血清ＤＭＥＭで希釈する。
１０．１１μＬの希釈溶液を、プラスミドを含む全てのｗｅｌｌに加える。ピペッティングでよく混合する。
１１．室温で１５分間静置する。培養細胞を含むｗｅｌｌに、全量の混合物を加える。３７℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーター内で２４時間静置する。
（ルシフェラーゼアッセイ）
　デュアルルシフェラーゼアッセイは、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを使用して行われ、少しの変更点を除きメーカーの使用説明書に従って行う。
１．トランスフェクション２４時間後、各ｗｅｌｌの培地を、４０μＬの１×ＰＢＳ（－）に交換する。
２．Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬を、各ｗｅｌｌに４０μＬずつ加え、ピペッティングでよく混合する。
３．室温で１０分間静置し、全量を９６－ｗｅｌｌ　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ　ｐｌａｔｅに移す。
４．ＦＬｕｃ遺伝子発現に関するホタルルシフェラーゼによる発光をプレートリーダーで測定する。
５．Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏバッファーでＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質を１００倍希釈する。その希釈された溶液４０μＬを各ｗｅｌｌに加える。
６．少なくとも室温で１０分間静置し、それからＲＬｕｃ遺伝子発現に関するウミシイタケルシフェラーゼによる発光を測定する。
（データ分析）
１．アッセイ間のトランスフェクション効率の違いや実験誤差を補正するためにＦＬｕｃ／ＲＬｕｃ値を計算する。
２．レポーター遺伝子発現の活性上昇を、ＰＰＲ結合領域存在下、非存在下のそれぞれにおいて、本発明に係るプラスミド（ＣＲＲ４と翻訳活性化ドメインｅＩＦ４Ｇとの融合タンパク質をコードするプラスミド）を用いて得られた実験値を、コントロールプラスミド（ＣＲＲ４とＦＬＡＧ－ｔａｇとの融合タンパク質をコードするプラスミド）を用いて得られた実験値で割り算することによって求める。
実験結果
　ルシフェラーゼアッセイの結果を図３に示した。図３に示すとおり、ＰＰＲ－ｅＩＦ４ＧとＰＰＲ結合配列の両方の存在下で特異的に２．７５倍の翻訳活性が認められた。すなわち、ＰＰＲタンパク質と、ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる機能ドメインとの融合タンパク質は、標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させることが示された。
注釈
（注釈１）ＨＥＫ２９３Ｔは、ＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ　を発現しているヒト胎児由来腎臓細胞株である。この細胞株は培養が容易であり、様々な方法で高効率のトランスフェクションが可能である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ（ｊａ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ）もしくはＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）で入手可能である。
（注釈２）ＤＭＥＭは、微生物コンタミネーションを避けるために、１×　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液を添加する。
（注釈３）使用前に、ＦＢＳは５６℃、３０分間の非動化が行われ、４℃で保存する。
（注釈４）プラスミドの純度は、トランスフェクション効率に極めて重要である。プラスミドはトランスフェクショングレードのキットを用いることで単離すること。
（注釈５）日々の成長率が健全な細胞であることの指標となる。細胞の成長が抑制されることを回避するために、細胞は、常に十分なスペースと栄養条件下で培養すること。
（注釈６）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は容易に培養シャーレから剥がれるので、培地を交換する際には、優しく扱うこと。
（注釈７）専用フリーズコンテナは凍結スピードを調節できる箱であり（－８０℃で、およそ１分あたり－１℃）、そしてこれにより、非プログラム式の－８０℃フリーザーでの凍結保存が可能である。
（注釈８）トランスフェクションに関して５０－８０％の培養密度での細胞を使用する。しかしながら、適切な細胞密度はトランスフェクション試薬に依存する。加えて、トランスフェクション試薬（μＬ）とプラスミドＤＮＡ（μｇ）の比率もメーカーの使用説明書に応じて、最適化するべきである。ここで記述された手順は、９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、トランスフェクション試薬としてＨｉｌｙＭＡＸを用いた条件で最適化されている。
実施例２：ＰＰＲとその他の機能ドメインとの融合タンパク質による標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量の向上
　細胞を用いて有用物質生産を行う場合、内在・外来遺伝子のタンパク質合成量を精密に制御する必要がある。最終タンパク質合成量は、遺伝子の挿入位置、ｍＲＮＡ転写量、転写後制御（ＲＮＡレベルでの制御）、翻訳後修飾などによって決定される。そこで、ＰＰＲタンパク質が標的ＲＮＡ分子と配列特異的に結合することを利用した、ｍＲＮＡの翻訳増強方法を考案した（図４）。真核生物では、ｍＲＮＡの翻訳は、翻訳開始因子（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ｅＩＦ）がｍＲＮＡに介在し、その結果、リボソームが翻訳開始点付近にリクルートされることで開始する。つまり、ｍＲＮＡ上にリボソームを寄せることさえ出来れば翻訳の人為的な増強が可能であると考えた。また、タンパク質翻訳は、一般的にＥＲで行われている。そこで、ＥＲへ目的ｍＲＮＡを積極的に局在させることで、翻訳増強できると考えた。
検証実験
　上記のアイデアを検証するために、動物培養細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を使ったレポーターアッセイシステムを作成した（用いた機能ドメインが異なること以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法で実験を行った）。特定のＲＮＡ配列（ＵＡＵＣＵＵＧＵＣＵＵＵＡ）（配列番号３）に結合することが分かっているＣＲＲ４タンパク質（シロイヌナズナＰＰＲタンパク質の一つ）を使って系を構築した。まず、ＣＲＲ４と候補タンパク質機能ドメインとの融合タンパク質発現ベクター（エフェクタープラスミド）を作成した。候補ドメインは、（ａ）ｅＩＦタンパク質（ｅＩＦ４Ｅ，ｅＩＦ４Ｇ）、（ｂ）リボソーム結合タンパク質（ＤＥＮＲ，ＭＣＴ－１，ＴＰＴ１，Ｌｅｒｅｐｏ４）、（ｃ）転写されたｍＲＮＡの核から細胞質への輸送促進するＨｉｓｔｏｎの翻訳制御因子（ＳＬＢＰ）、（ｄ）ＥＲアンカータンパク質（ＳＥＣ６１Ｂ，ＴＲＡＰ－ａｌｐｈａ，ＳＲ－ａｌｐｈａ，Ｄｉａ１，ｐ１８０）、（ｅ）ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ（ＫＤＥＬ）、（ｆ）ＥＲ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ、を選んだ。融合タンパク質は、ＨＡ－ＣＲＲ４－ＸＸもしくは、ＸＸ－ＣＲＲ４－ＨＡの形で発現するようにクローニングした（ＨＡ：エピトープタグ（配列番号４）；ＸＸ：候補ドメイン）。
　レポータープラスミドは、ＣＭＶプロモーター制御下で、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）とホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）がジシストロニックｍＲＮＡの形で転写される発現カセットを搭載した。Ｆｌｕｃの５´側に、ＰＰＲ結合配列（ＵＡＵＣＵＵＧＵＣＵＵＵＡ）（配列番号３）が３つ挿入されている。
　エフェクタープラスミドとレポータープラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ＲＬＵＣ，ＦＬＵＣの発光量を測定した。ＲＬＵＣ発光量は、トランスフェクションコントロールとして扱い、ＦＬＵＣ発光量／ＲＬＵＣ発光量の値を翻訳活性量として扱った。
結果
　以下の（Ａ）、（Ｂ）の指標を用いて、図５および図６に示す結果を検討した。
（Ａ）標的非存在下と存在下との比較
　配列特異的にどれくらい翻訳量変化があったのかが分かる。
（Ｂ）標的存在下、エフェクターなし（ｅｍｐｔｙ）と比較（黒色破線）
　ドメイン付加による翻訳量変化が分かる。
１．ＣＲＲ４のＣ末側にｅＩＦ４Ｅを融合
（Ａ）２．７倍
（Ｂ）１．６倍
２．ＣＲＲ４のＣ末側にｅＩＦ４Ｇを融合
（Ａ）４．５倍
（Ｂ）３．３倍
３．ＣＲＲ４のＮ末側にＤＥＮＲを融合
（Ａ）１．７倍
（Ｂ）１．３倍
４．ＣＲＲ４のＣ末側にＤＥＮＲを融合
（Ａ）２．４倍
（Ｂ）１．７倍
５．ＣＲＲ４のＮ末側にＭＣＴ－１を融合
（Ａ）１．３倍
（Ｂ）１．０倍
６．ＣＲＲ４のＣ末側にＭＣＴ－１を融合
（Ａ）２．０倍
（Ｂ）１．２倍
７．ＣＲＲ４のＮ末側にＴＰＴ－１を融合
（Ａ）１．４倍
（Ｂ）１．０倍
８．ＣＲＲ４のＣ末側にＴＰＴ－１を融合
（Ａ）２．４倍
（Ｂ）１．９倍
９．ＣＲＲ４のＮ末側にＬｅｒｅｐｏ　４を融合
（Ａ）３．０倍
（Ｂ）１．８倍
１０．ＣＲＲ４のＣ末側にＬｅｒｅｐｏ　４を融合
（Ａ）３．３倍
（Ｂ）２．６倍
１１．ＣＲＲ４のＣ末側にＳＬＢＰを融合
（Ａ）４．１倍
（Ｂ）３．３倍
１２．ＣＲＲ４のＣ末側にＳｅｃ６１Ｂを融合
（Ａ）１．６倍
（Ｂ）１．６倍
１３．ＣＲＲ４のＣ末側にＳｅｃ６１ＢＴＭを融合
（Ａ）２．４倍
（Ｂ）１．９倍
１４．ＣＲＲ４のＣ末側にＴＲＡＰ‐ａｌｐｈａを融合
（Ａ）３．５倍
（Ｂ）４．５倍
１５．ＣＲＲ４のＣ末側にＴＲＡＰＴＭを融合
（Ａ）２．３倍
（Ｂ）１．６倍
１６．ＣＲＲ４のＮ末側にＳＲ‐ａｌｐｈａを融合
（Ａ）１．７倍
（Ｂ）１．５倍
１７．ＣＲＲ４のＮ末側にＤｉａ１ＴＭを融合
（Ａ）１．８倍
（Ｂ）１．２倍
１８．ＣＲＲ４のＮ末側にＰ１８０ＴＭ２Ｒを融合
（Ａ）２．１倍
（Ｂ）１．５倍
１９．ＣＲＲ４のＮ末側にＰ１８０ＴＭＨを融合
（Ａ）２．３倍
（Ｂ）２．５倍
２０．ＣＲＲ４のＮ末側にＰ１８０ＴＭ２を融合
（Ａ）３．０倍
（Ｂ）２．１倍
２１．ＣＲＲ４のＣ末側にＫＤＥＬを融合
（Ａ）１．８倍
（Ｂ）１．４倍
２２．ＣＲＲ４のＣ末側にＫＥＥＬを融合
（Ａ）２．３倍
（Ｂ）２．１倍
２３．ＣＲＲ４のＮ末側にＳｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ（ＳＰ）を融合
（Ａ）１．４倍
（Ｂ）２．０倍
　上記のとおり、指標（Ａ）および標的（Ｂ）のいずれにおいても、すべての機能ドメインで翻訳上昇が認められた。すなわち、本発明の融合タンパク質によって、標的ｍＲＮＡの翻訳を増強させることが可能であることが明確に示された。
　本実施例において使用した機能ドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012

Claims (15)

  1. 　標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させるための融合タンパク質であって、
    　前記融合タンパク質は、
    　（Ａ）ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる、１または複数の機能ドメイン、および
    　（Ｂ）標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ塩基選択的に、または、ＲＮＡ塩基配列特異的に結合可能なポリペプチド部分、
    を含み、
    　前記（Ｂ）のポリペプチド部分が、式１で表される３０～３８アミノ酸長のポリペプチドからなるＰＰＲモチーフを１個以上含む、ポリペプチド部分であり
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中：
    　Ｈｅｌｉｘ　Ａは、１２アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式２で表され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　　式２中、Ａ１～Ａ１２はそれぞれ独立にアミノ酸を表し；
    　Ｘは、存在しないか、または、１～９アミノ酸長からなる部分であり；
    　Ｈｅｌｉｘ　Ｂは、１１～１３アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり；
    　Ｌは、２～７アミノ酸長の、式３で表される部分であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　　式３中、各アミノ酸は、“ｉ”（－１）、“ｉｉ”（－２）、とＣ末端側からナンバリングされ、
    　　ただし、Ｌｉｉｉ～Ｌｖｉｉは存在しない場合がある。）
    　Ａ１、Ａ４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせ、又はＡ４、Ｌｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、標的ｍＲＮＡの塩基または塩基配列に対応したものとなっている、
    融合タンパク質。
  2. 　請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記（Ｂ）のポリペプチド部分は、前記ＰＰＲモチーフを２～３０個含み、前記複数のＰＰＲモチーフが、標的ｍＲＮＡの塩基配列に特異的に結合するように配置されている、
    融合タンパク質。
  3. 　請求項２に記載の融合タンパク質であって、前記（Ｂ）のポリペプチド部分は、前記ＰＰＲモチーフを５～２５個含む、
    融合タンパク質。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記（Ａ）の機能ドメインは、前記（Ｂ）のポリペプチド部分のＮ末端側および／またはＣ末端側に結合されている、
    融合タンパク質。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記（Ａ）の機能ドメインが、ｍＲＮＡへリボソームを誘導するドメイン、ｍＲＮＡの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメイン、ｍＲＮＡの核外への輸送に関連するドメイン、小胞体膜への結合に関連するドメイン、小胞体保留シグナル（ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列を含むドメイン、および、小胞体シグナル配列を含むドメイン、からなる群から選択される、
    融合タンパク質。
  6. 　請求項５に記載の融合タンパク質であって、
    　前記ｍＲＮＡへリボソームを誘導するドメインは、ＤＥＮＲ（Ｄｅｎｓｉｔｙ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＣＴ－１（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１）、ＴＰＴ１（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、および、Ｌｅｒｅｐｏ４（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ＣＣＣＨ－ｄｏｍａｉｎ）からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
    　前記ｍＲＮＡの翻訳開始または翻訳促進に関連するドメインは、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇからなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
    　前記ｍＲＮＡの核外への輸送に関連するドメインは、ＳＬＢＰ（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の全部または機能的な一部を含むドメインであり、
    　前記小胞体膜への結合に関連するドメインは、ＳＥＣ６１Ｂ、ＴＲＡＰ－ａｌｐｈａ(Ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｐｈａ)、ＳＲ－ａｌｐｈａ、Ｄｉａ１（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　３）、および、ｐ１８０からなる群から選択されるポリペプチドの全部または機能的な一部を含むドメインであり、
    　前記小胞体保留シグナル（ＥＲ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）配列は、ＫＤＥＬ（ＫＥＥＬ）配列を含むシグナル配列であり、または、
    　前記小胞体シグナル配列は、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳを含むシグナル配列である、
    融合タンパク質。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＡ（アデニン）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（バリン、トレオニン、アスパラギン）、（フェニルアラニン、セリン、アスパラギン）、（フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、または（トレオニン、トレオニン、アスパラギン）であり；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸）、（バリン、トレオニン、アスパラギン酸）、（リジン、トレオニン、アスパラギン酸）、または（ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸）であり；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）、（フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸）、または（チロシン、プロリン、アスパラギン酸）であり；または、
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ１、Ａ４、およびＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ１、Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（バリン、アスパラギン、セリン）、または（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）である、
    融合タンパク質。
  8. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＡ（アデニン）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン）、
    （セリン、アスパラギン）、または（グリシン、アスパラギン）であり；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン酸）
    または（グリシン、アスパラギン酸）であり；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン酸）、（プロリン、アスパラギン酸）、（メチオニン、アスパラギン酸）、または（バリン、トレオニン）であり；
    　ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ４およびＬｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ４、Ｌｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン）、
    （アスパラギン、セリン）、または（ロイシン、アスパラギン酸）である、
    融合タンパク質。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  10. 　請求項９に記載の核酸を含む、ベクター。
  11. 　ベクターが発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
  12. 　細胞内で標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現量を向上させる方法であって、
    　請求項１～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または、請求項１０または１１に記載のベクターを準備するステップ、および、
    　前記融合タンパク質、または、ベクターを細胞内へ導入するステップ、を含む、
    方法。
  13. 　請求項１２に記載の方法であって、
    　前記細胞が、真核生物の細胞である、
    方法。
  14. 　請求項１３に記載の方法であって、
    　前記細胞が、動物細胞である、
    方法。
  15. 　請求項１４に記載の発明であって、
    　前記動物細胞が、ヒト細胞である、
    方法。
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