WO2020189734A1 - 新規化合物、並びにかかる新規化合物を含む酵素阻害剤及びａｂｐ - Google Patents

新規化合物、並びにかかる新規化合物を含む酵素阻害剤及びａｂｐ Download PDF

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WO2020189734A1
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平井　剛
佑亮 木室
昌樹 森田
一毅 土井
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国立大学法人九州大学
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound, a glycosyl hydrolase containing such a novel compound, a glycosyltransferase inhibitor, and an ABP (Activity-Based Probes).
  • Glycohydrolases and glycosyltransferases are enzymes that decompose or synthesize sugar chains and complex carbohydrates, and are involved in the survival of pathogenic bacteria and various diseases. Therefore, this enzyme inhibitor can be used as a therapeutic agent for these diseases.
  • ⁇ -glucosidase which is one of sugar hydrolases, is an enzyme that cleaves ⁇ -glucoside bonds and is involved in diabetes, Pompe disease, etc., and is therefore a target for drug discovery.
  • Inhibitors of sugar hydrolases are also used as research tools.
  • Activity-Based Probe (ABP)
  • ABP Activity-Based Probe
  • the aziridine type for example, Non-Patent Document 1
  • cyclic sulfate type see, for example, Non-Patent Document 2
  • An object of the present invention is to provide an enzyme inhibitor that inhibits the action of a glycosyl hydrolase or a glycosyltransferase, and / or a novel compound that can be used as an ABP.
  • the 2-position exomethylene type compound in which the 2-position hydroxyl group of the substrate on which the glycosyl hydrolase or glycosyltransferase acts is replaced with an exomethylene group is remarkable for this glycosyl hydrolase or glycosyltransferase.
  • it exhibits a high inhibitory activity and have completed the present invention.
  • the 2-position exomethylene type compound having this substrate-like structure irreversibly binds to a sugar hydrolase or a glycosyltransferase.
  • R 1 represents -COOH or -CY 1 Y 2 OH (Y 1 and Y 2 represent hydrogen atoms or detectable labels, respectively),
  • a 1 represents sugar or aglycon, and
  • X is hydrogen. It represents an atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a halogen atom, and an OH group may be modified.
  • a compound or a salt thereof A compound or a salt thereof.
  • the detectable label represented by Y 1 and Y 2 of the formula (1) is a label containing an alkynyl group, a label containing biotin, a fluorescent label, a chemiluminescent label, or a radioisotope label.
  • the following formula (2) The following formula (2)
  • the enzyme inhibitor according to [5] or [6] which comprises the compound represented by (1) or a salt thereof and inhibits the action of ⁇ -glycosidase.
  • An ABP activity-based probe comprising the compound according to any one of [1] to [4] or a salt thereof.
  • the ABP according to [9] which comprises detecting an enzyme acting on a substrate compound represented by [9].
  • a method for detecting an enzyme which comprises detecting an enzyme acting on a substrate compound using the ABP according to [9] or [10].
  • the substrate compound is the following formula (2).
  • a method for detecting a substrate compound which comprises detecting a substrate compound on which an enzyme acts by using the ABP according to [13] or [10].
  • the substrate compound is the following formula (2).
  • novel compound of the present invention is useful as a glycosyl hydrolase, a glycosyltransferase inhibitor and / or ABP.
  • the compound of the present invention is a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof (hereinafter, may be referred to as a compound (1) of the present invention).
  • the OH group in the formula (1) may be modified.
  • the modification mode of the OH group the OH group moiety is, for example, etherified (-OR), carboxylic acid esterification (-OCOR), sulfated (-OSO 3 H), sulfate esterified (-OSO 2 (OR)). , Phosphorized (-OPO (OH) 2 ), phosphoric acid esterification (-OPO (OH) (OR), -OPO (OR) 2 ), etc.
  • the modification mode of each OH group can be mentioned. , The same or different.
  • the R shown here is an alkyl group, an aryl group, an aralkyl group, or the like, and when one group has two substituents R, they may be the same or different.
  • the alkyl group an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is preferable, as an aryl group, an aryl group having 6 to 12 carbon atoms is preferable, and as an aralkyl group, an aralkyl group having 7 to 16 carbon atoms is preferable. Is preferable.
  • R 1 represents -COOH or -CY 1 Y 2 OH.
  • Y 1 and Y 2 represent a hydrogen atom or a detectable label, respectively. When introducing a detectable label, it may usually be introduced in either Y 1 or Y 2 .
  • the detectable label is not particularly limited as long as it is a label that can be detected by a chemical method.
  • a label containing an alkynyl group, a label containing biotin, a fluorescent label, a chemical emission label, a radioisotope, etc. Signs and the like can be mentioned.
  • the alkynyl group refers to an alkyl group containing one or more triple bonds.
  • the label containing biotin is not particularly limited as long as it specifically binds to avidin, and may contain a derivative of biotin.
  • fluorescent label examples include fluorescein, coumarin, eosin, phenanthroline, pyrene, rhodamine, indocyanine, quinoxaline and their derivatives.
  • chemiluminescent label examples include luminol, isolminol, loffin, lucigenin, and peroxalate ester.
  • radioactive isotope examples include 3 H, 14 C, 13 N, 32 P, 33 P, 35 S and the like.
  • a 1 represents sugar or aglycone.
  • the sugar include monosaccharides such as glucose, galactose, glucuronic acid, N-acetylglucosamine, glucosamine, mannose, xylose, N-acetylgalactosamine, galactosamine, N-acetylmannosamine, and mannosamine, or these monosaccharides. Examples thereof include oligosaccharides and polysaccharides (sugar chains).
  • the position of the bond with the oxygen atom is preferably the same as the substrate of the target enzyme, and this bond is important when used as an inhibitor or ABP.
  • the sugar may be modified.
  • aglycones include various atomic groups, including aliphatic compounds, aromatic compounds, lipids, proteins, nucleic acids, nucleotides, and synthetic polymers. Of these, lipids and nucleotides are preferable.
  • the lipid include glycerolipid, sphingolipid, sterol and the like, and more specifically, ergosterol, ceramide, uridine diphosphate and the like.
  • the aglycone is ergosterol, it can be an inhibitor of the ergosteryl glucoside degrading enzyme (EGCrP2).
  • X represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a halogen atom.
  • alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an n-butyl group, a t-butyl group and the like, and a methyl group is preferable.
  • halogen atom include a chlorine atom, a fluorine atom, a bromine atom and an iodine atom, and a chlorine atom and a bromine atom are preferable, and a chlorine atom is particularly preferable.
  • Any of the above groups can be used as an inhibitor and ABP, but when X is a hydrogen atom, it is more useful as an ABP, and when X is a non-hydrogen atom, especially when it is a halogen atom. , More useful as an inhibitor.
  • the compound (1) of the present invention is a salt
  • it is preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, lysine salt and arginine salt can be mentioned.
  • the compound of the present invention also includes various isomers of compound (1), mixtures thereof, racemates and the like.
  • the compound (1) of the present invention can be used as a glycosyl hydrolase or a glycosyltransferase inhibitor. That is, the enzyme inhibitor of the present invention contains the compound (1) of the present invention, and acts on, for example, a compound represented by the following formula (2) (hereinafter, may be referred to as a substrate compound (2)). Inhibits the action of hydrolases and transferases.
  • the compound (1) of the present invention contained in the enzyme inhibitor of the present invention has a substrate-like structure in which the 2-position hydroxyl group of the substrate on which the sugar hydrolase and the glycosyltransferase act is replaced with an exomethylene group.
  • Various inhibitors can be produced by appropriately changing the substrate compound.
  • the compound (1) of the present invention has a seemingly simple structure in which an exomethylene group is introduced at the 2-position of the substrate compound, but a hydroxyl group is present at the 2-position of the substrate compound.
  • the idea of introducing a methylene group at a position is unprecedented.
  • R 2 represents -COOH or -CH 2 OH.
  • a 2 represents a sugar or an aglycone, and specific examples thereof include the same compounds as A 1 of the compound (1) of the present invention.
  • a 2 is preferably the same as A 1 .
  • the structure of the other portions of the substrate compound (2), (except where the 2-position of the exomethylene group, and a label Y 1 and Y 2) preferably is the same as compound (1).
  • the enzyme inhibitor containing the compound (1) of the present invention more effectively inhibits the enzyme acting on the substrate compound having a structure closer to that of the compound (1).
  • a sugar hydrolase inhibitor containing a maltose-type compound (1) more effectively inhibits the degrading action of an enzyme acting on a maltose-type substrate compound (2).
  • the sugar hydrolase inhibitor containing the isomaltose-type compound (1) more effectively inhibits the degrading action of the enzyme acting on the isomaltose-type substrate compound (2).
  • the enzyme inhibitor of the present invention is a substrate for a target enzyme, it forms a covalent bond with the active center or its vicinity and irreversibly inhibits the enzyme activity, and is a suicide substrate or mechanism-based. It is also called an inhibitor.
  • the sugar hydrolase inhibitor of the present invention containing the compound represented by (1) or a salt thereof can effectively inhibit the degrading action of ⁇ -glycosidase, preferably ⁇ -glucosidase.
  • the sugar hydrolase inhibitor of the present invention containing the compound represented by (1) or a salt thereof can effectively inhibit the degrading action of ⁇ -glycosidase, preferably ⁇ -glucosidase. That is, the compound (1) of the present invention can distinguish and inhibit the ⁇ -form and ⁇ -form of the substrate compound.
  • glycosyltransferase inhibitor of the present invention containing the compound represented by the formula (1-1) or (1-2) or a salt thereof effectively inhibits the sugar chain synthesizing action of glycosyltransferase, preferably glucosyltransferase. be able to.
  • the compound (1) of the present invention can be used as ABP. That is, the ABP of the present invention contains the compound (1) of the present invention, and for example, it detects an enzyme (oxygen active on the substrate compound (2)) that acts on the substrate compound (2). That is, the compound (1) of the present invention specifically acts on an enzyme corresponding to a substrate compound having a structure similar to that of the compound (1), and the enzyme irreversibly binds during the action. It is possible to identify (detect) the substrate compound on which the target enzyme acts. Similarly, an enzyme that acts on a substrate compound to be investigated can be identified (detected).
  • an enzyme oxygen active on the substrate compound (2)
  • the conventional ABP has a monosaccharide structure, and the relationship between the enzyme and the substrate (the specific structure of the substrate on which the enzyme acts) cannot be rigorously analyzed.
  • the ABP of the present invention contains the enzyme and the substrate. It is possible to strictly analyze the relationship of specific structures.
  • the compound (1) of the present invention forms a covalent bond with an enzyme that decomposes a substrate compound by a mechanism as shown in FIG. 1 and irreversibly binds to the enzyme. It should be noted that this mechanism is a mechanism considered by the inventor at this stage, and does not limit the scope of the present invention.
  • the compound (1) of the present invention is, for example, reacted in the presence of a gold catalyst by the reaction formula shown below to produce the compound (1'), deprotected if necessary, and further modified if necessary.
  • a gold catalyst by the reaction formula shown below to produce the compound (1'), deprotected if necessary, and further modified if necessary.
  • R 3 to R 5 represent protecting groups.
  • the protecting group include a benzyl ether protecting group such as a p-methoxybenzyl group (PMB), a silyl ether protecting group such as a picolinic acid group (Pico) and a trialkylsilyl group, and the like.
  • PMB p-methoxybenzyl group
  • Silyl ether protecting group such as a picolinic acid group (Pico) and a trialkylsilyl group
  • the ⁇ -form compound (1') it is preferable to protect the OH groups at the 3- and 4-positions with a p-methoxybenzyl group and the hydroxyl group at the 6-position with a picolinic acid group. ..
  • R 6 represents an organic group.
  • the organic group is not particularly limited, and examples thereof include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a butyl group and a cyclopropyl group are preferable.
  • an organic solvent in which compound (3) and compound (4) are dissolved for example, halogenation of dichloromethane or the like
  • a solution of an organic solvent (for example, a halogenated hydrocarbon solvent such as dichloromethane) in which a catalyst is dissolved is added to the solution of a hydrocarbon solvent.
  • a molecular sieve as a dehydrating agent to the organic solvent solution.
  • the catalyst used in the method for producing the compound (1) of the present invention is not particularly limited as long as it is a monovalent gold salt or complex (Au I ), for example, PPh 3 AuNTf 2, PPh 3 AuOTf and the like. Can be mentioned.
  • the reaction temperature is about ⁇ 78 to 30 ° C., preferably about 0 to 25 ° C.
  • the reaction time depends on other conditions such as the reaction temperature, but is, for example, about 0.5 to 48 hours, preferably about 1 to 24 hours, and more preferably about 1 to 12 hours.
  • Example 1 The ⁇ -maltose type compound of the present invention shown below was produced.
  • PMP is a p-methoxyphenyl group.
  • Ethyl vinyl ether (3.3 ml, 35 mmol) was added to a dichloromethane solution (30 ml) of compound 8 (1.70 g, 3.47 mmol) and pyridinium p-toluenesulfonate (0.44 g, 1.7 mmol) under a nitrogen atmosphere. .. The mixture was stirred at room temperature for 12 hours, and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added under ice-cooling to stop the reaction. The reaction mixture was extracted with dichloromethane, washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Example 2 The ⁇ -isomaltose type compound of the present invention shown below was produced.
  • PMP is a p-methoxyphenyl group.
  • Acetic anhydride (0.66 ml) was added to a pyridine solution (1.0 ml) of the obtained crude product. The mixture was stirred at room temperature for 19 hours, and the reaction solution was poured into an ice-cooled aqueous solution of ethyl acetate / saturated sodium hydrogen carbonate. The mixed solution was extracted with ethyl acetate, washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Example 3 The ⁇ -ergosterol glycoside of the present invention shown below was produced.
  • Gold complex PPh 3 AuNTf 2 (18 mg / ml dichloromethane solution, 66 ⁇ l) in a dichloromethane solution (0.24 ml) of molecular sieves 4 ⁇ , compound 22 (10.5 mg, 18.4 ⁇ mol) and compound 20 (10.8 mg, 15.3 ⁇ mol). ) was added. After 2 hours, the gold complex PPh 3 AuNTf 2 (18mg / ml dichloromethane solution, 66 [mu] l) was added, after a further 2 hours the gold complex PPh 3 AuNTf 2 (18mg / ml dichloromethane solution, 65 [mu] l) was added.
  • Example 4 The ⁇ -ceramide glycoside of the present invention shown below was produced.
  • Trimethylphosphine (1 M tetrahydrofuran solution, 28 ⁇ l) was added to a solution of compound 29 (3.9 mg, 8.1 ⁇ mol) in methanol (224 ⁇ l). After stirring at room temperature for 2 hours, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product.
  • Compound 30 (Santra, A .; Li, Y .; Yu, H .; Slack, TJ; Wangb, PG; Chen, X. Chem. Commun., 2017, 53) in a solution of the above crude product in tetrahydrofuran (225 ⁇ l). , 8280-8283) (7.2 mg, 19 ⁇ l) and triethylamine (7 ⁇ l, 50 ⁇ mol) were added.
  • Example 5 ⁇ Evaluation of inhibitory activity> Using yeast-derived ⁇ -glucosidase, the ⁇ -glucosidase inhibitory activity of the test compound was evaluated as follows.
  • As the test compound compound 12 (maltose type) and compound 16 (isomaltose type) of the present invention produced in Examples 1 and 2 above were used.
  • the fluorescence of the reaction solution (excitation wavelength 365 nm, fluorescence wavelength 450 nm) was measured, and the glucosidase inhibitory activity was evaluated by the fluorescence value at 7 minutes. (References Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.)
  • the results are shown in Fig. 2.
  • the residual activity of ⁇ -glucosidase is shown in a bar graph as a control in which 1 ⁇ l of DMSO is added instead of 1 ⁇ l of the test compound to the above conditions.
  • the inhibition rate was calculated by subtracting the ratio of activity and control when the compound was added from 1 when the control was 1.
  • Compound 16 of the present invention having an isomaltose structure showed 3% inhibitory activity, while compound 12 of the present invention having a maltose structure showed 99% inhibitory activity.
  • the compound of the present invention selectively inhibits an enzyme that acts on a substrate compound having a structure similar to that of itself, and the yeast-derived ⁇ -glucosidase used in this example selectively decomposes a maltose-type substrate. It turns out that it is an enzyme.
  • Example 6 ⁇ Reversible inhibition confirmation test> To ⁇ -glucosidase (Yeast-derived 46512003, Orient Industry, 0.1 U / ml buffer solution, 294 ⁇ l) was added 0.1 M test compound 12 (6 ⁇ l) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After adding 50 ⁇ l of the mixed solution to a 96-well plate, 4-methylumberiferryl- ⁇ -D-glucopyranoside (Nacalai Tesque, 11900-12, 400 ⁇ M aqueous solution, 50 ⁇ l) was added and fluorescence was detected at 37 ° C. (excitation wavelength 365 nm). , Fluorescence wavelength 450 nm).
  • Example 7 The ⁇ -glucoside type compound (compound having a vinyl halide structure) of the present invention shown below was produced.
  • reaction solution was added dropwise to a mixed solution of cooled ethyl acetate, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and 1M aqueous sodium thiosulfate solution to stop the reaction.
  • the solid was filtered off by Celite filtration and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and then dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Azobisisobutyluene solution of compound 33 (56.7 mg, 0.0743 mmol), tributyltin hydride (60 ⁇ l, 0.223 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (38.8 ⁇ l, 0.223 mmol) is heated under reflux.
  • Bisisobutyronitrile (12.2 mg / ml degassed toluene solution, 100 ⁇ l) was added.
  • azobisisobutyronitrile (12.2 mg / ml degassed toluene solution, 100 ⁇ l) was added.
  • a dichloromethane solution (XeF) of xenon difluoride and 2,6-di-tert-butyl-4-methylpyridine prepared separately in a dichloromethane solution (751 ⁇ l) of compound 34 (44.9 mg, 0.0476 mmol) under an argon atmosphere. 2 : 19.3 mg, DTBMP: 58.6 mg dissolved in 0.40 ml of dichloromethane) was added in an amount of 200 ⁇ l.
  • Silver trifluoromethanesulfonate (36.7 mg, 0.143 mmol) was added under ice-cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes, and then sodium chloride was added to stop the reaction.
  • the solid was filtered off by Celite filtration and extracted with dichloromethane.
  • the dichloromethane layer was washed with water and then dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Acetic anhydride (74 ⁇ l) was added to a pyridine solution (111 ⁇ l) of the obtained crude product, and the mixture was stirred at room temperature for 9 and a half hours.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate, and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added. After extraction with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Acetic anhydride (78 ⁇ l) was added to a pyridine solution (117 ⁇ l) of the obtained crude product, and the mixture was stirred at room temperature for 12 and a half hours.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate, and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to carry out the reaction. After extraction with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • N-Bromosuccinimide (2.7 mg, 15.1 ⁇ mol) was added to a tetrahydrofuran solution (101 ⁇ l) of Compound 34 (9.5 mg, 0.0101 mmol) under an argon atmosphere. After stirring for 30 minutes, the reaction solution was diluted with dichloromethane, and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to stop the reaction. The mixed solution was extracted with dichloromethane, the dichloromethane layer was washed with water and then dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Acetic anhydride 38 ⁇ l was added to a pyridine solution (57 ⁇ l) of the obtained crude product, and the mixture was stirred at room temperature for 11 hours.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate, and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added. After extraction with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Acetic anhydride (94 ⁇ l) was added to a pyridine solution (141 ⁇ l) of the obtained crude product, and the mixture was stirred at room temperature for 12 and a half hours.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate, and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added. After extraction with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with water and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Example 12 ⁇ Evaluation of inhibitory activity> Using yeast-derived ⁇ -glucosidase, the ⁇ -glucosidase inhibitory activity of the test compound was evaluated as follows. As the test compound, the compounds 37, 40, 43, 46 of the present invention produced in Example 7 above were used.
  • the fluorescence of the reaction solution (excitation wavelength 365 nm, fluorescence wavelength 450 nm) was measured, and the glucosidase inhibitory activity was evaluated by the fluorescence value at 4 minutes. (References Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.)
  • the results are shown in Fig. 4.
  • the residual activity of ⁇ -glucosidase is shown in a bar graph as a control in which 1 ⁇ l of DMSO is added instead of 1 ⁇ l of the test compound to the above conditions.
  • the inhibition rate was calculated by subtracting the ratio of activity and control when the compound was added from 1 when the control was 1.
  • FIG. 4 shows the activity of the compound of the present invention at a final concentration of 100 ⁇ M.
  • Compounds 37 and 46 having F atoms and I atoms had an inhibitory activity of only a few percent at this concentration.
  • the compound 43 having a Br atom was about 50%, and the compound 40 having a Cl atom almost completely inhibited the yeast-derived ⁇ -glucosidase activity used in this example.
  • Example 13 ⁇ Inhibitory activity evaluation (concentration dependence)> Using yeast-derived ⁇ -glucosidase, the ⁇ -glucosidase inhibitory activity of the test compound was evaluated as follows. As the test compound, the compound 43 of the present invention produced in Example 7 above was used.
  • the fluorescence of the reaction solution (excitation wavelength 365 nm, fluorescence wavelength 450 nm) was measured, and the glucosidase inhibitory activity was evaluated by the fluorescence value at 4 minutes. (References Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.)
  • the results are shown in Fig. 5.
  • the residual activity of ⁇ -glucosidase is shown in a bar graph as a control in which 1 ⁇ l of DMSO is added instead of 1 ⁇ l of the test compound to the above conditions.
  • the inhibition rate was calculated by subtracting the ratio of activity and control when the compound was added from 1 when the control was 1.
  • Compound 43 having a Br atom inhibited the yeast-derived ⁇ -glucosidase activity used in this example in a concentration-dependent manner.
  • Example 14 ⁇ Inhibitory activity evaluation (concentration dependence)> Using yeast-derived ⁇ -glucosidase, the ⁇ -glucosidase inhibitory activity of the test compound was evaluated as follows. As the test compound, the compound 40 of the present invention produced in Example 7 above was used.
  • the fluorescence of the reaction solution (excitation wavelength 365 nm, fluorescence wavelength 450 nm) was measured, and the glucosidase inhibitory activity was evaluated by the fluorescence value at 4 minutes. (References Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.)
  • the results are shown in Fig. 6.
  • the residual activity of ⁇ -glucosidase is shown in a bar graph as a control in which 1 ⁇ l of DMSO is added instead of 1 ⁇ l of the test compound to the above conditions.
  • the inhibition rate was calculated by subtracting the ratio of activity and control when the compound was added from 1 when the control was 1.
  • the compounds of the present invention are industrially useful because they can be used as enzyme inhibitors and / or ABPs.

Abstract

下記式（１）［Ｒ１は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＹ１Ｙ２ＯＨ（Ｙ１及びＹ２は、それぞれ水素原子又は検出可能な標識を表す）を表し、Ａ１は、糖又はアグリコンを表し、Ｘは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基又はハロゲン原子を表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物又はその塩である。

Description

新規化合物、並びにかかる新規化合物を含む酵素阻害剤及びＡＢＰ
　本発明は、新規化合物、並びにかかる新規化合物を含む糖加水分解酵素、糖転移酵素阻害剤及びＡＢＰ（Activity-Based Probes：アクティビティベースドプローブ）に関する。
　糖加水分解酵素と糖転移酵素は、糖鎖や複合糖質を分解又は合成する酵素であり、病原性細菌の生存や様々な疾患に関わっている。したがって、この酵素阻害剤は、これら疾患の治療薬として利用可能である。例えば、糖加水分解酵素の１つであるα－グルコシダーゼは、α－グルコシド結合を切断する酵素であり、糖尿病やポンペ病などに関与することから、創薬対象となっている。
　また、糖加水分解酵素の阻害剤は、研究ツールとしても利用されている。例えば、α－グルコシダーゼの解析ツールとして、酵素活性依存的に共有結合を形成するＡｃｔｉｖｉｔｙ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｂｅ（ＡＢＰ）が有効であり、これまでにα－グルコシダーゼのＡＢＰとしてアジリジンタイプ（例えば、非特許文献１参照）、環状硫酸エステルタイプ（例えば、非特許文献２参照）が報告されている。
Overkleeft, H. S. et al. ACS Cent. Sci. 2016, 2, 351 Overkleeft, H. S. et al. ACS Cent. Sci. 2017, 3, 784
　本発明の課題は、糖加水分解酵素又は糖転移酵素の作用を阻害する酵素阻害剤、及び／又はＡＢＰとして利用可能な新規化合物を提供することにある。
　本発明者らは、糖加水分解酵素又は糖転移酵素が作用する基質の２位水酸基をエキソメチレン基で置き換えた２位エキソメチレン型化合物が、この糖加水分解酵素又は糖転移酵素に対して顕著な阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。また、この基質類似構造を有する２位エキソメチレン型化合物は、糖加水分解酵素又は糖転移酵素と不可逆的に結合することを知見した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］下記式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［Ｒ１は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＹ１Ｙ２ＯＨ（Ｙ１及びＹ２は、それぞれ水素原子又は検出可能な標識を表す）を表し、Ａ１は、糖又はアグリコンを表し、Ｘは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基又はハロゲン原子を表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物又はその塩。
［２］式（１）のＯＨ基の修飾が、エーテル化、カルボン酸エステル化、硫酸化、硫酸エステル化、リン酸化、又はリン酸エステル化であることを特徴とする［１］記載の化合物又はその塩。
［３］式（１）のＡ１で表されるアグリコンが、脂質又はヌクレオチドであることを特徴とする［１］又は［２］記載の化合物又はその塩。
［４］式（１）のＹ１及びＹ２で表される検出可能な標識が、アルキニル基を含む標識、ビオチンを含む標識、蛍光標識、化学発光標識、又は放射性同位体標識であることを特徴とする［１］～［３］のいずれか記載の化合物又はその塩。
［５］［１］～［４］のいずれか記載の化合物又はその塩を含み、糖加水分解酵素又は糖転移酵素の作用を阻害することを特徴とする酵素阻害剤。
［６］下記式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される基質化合物に作用する糖加水分解酵素又は糖転移酵素の作用を阻害することを特徴とする［５］記載の酵素阻害剤。
［７］下記式（１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で示される化合物又はその塩を含み、α－グリコシダーゼの作用を阻害することを特徴とする［５］又は［６］記載の酵素阻害剤。
［８］下記式（１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
で示される化合物又はその塩を含み、β－グリコシダーゼの作用を阻害することを特徴とする［５］又は［６］記載の酵素阻害剤。
［９］［１］～［４］のいずれか記載の化合物又はその塩を含むことを特徴とするＡＢＰ（アクティビティベースドプローブ）。
［１０］下記式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される基質化合物に作用する酵素を検知することを特徴とする［９］記載のＡＢＰ。
［１１］［９］又は［１０］記載のＡＢＰを用いて、基質化合物に作用する酵素を検知することを特徴とする酵素の検知方法。
［１２］基質化合物が、下記式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物であることを特徴とする［１１］記載の酵素の検知方法。
［１３］［９］又は［１０］記載のＡＢＰを用いて、酵素が作用する基質化合物を検知することを特徴とする基質化合物の検知方法。
［１４］基質化合物が、下記式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物であることを特徴とする［１３］記載の基質化合物の検知方法。
　本発明の新規化合物は、糖加水分解酵素、糖転移酵素阻害剤及び／又はＡＢＰとして有用である。
本発明の化合物が、糖加水分解酵素（β‐グルコシダーゼ）と共有結合形成するメカニズムを説明する図である。 酵母由来のα－グルコシダーゼに対する本発明の化合物の阻害活性を示す図である。 酵母由来のα－グルコシダーゼに対する本発明の化合物の不可逆的阻害活性（透析前後）を示す図である。 酵母由来のα－グルコシダーゼに対する本発明のビニルハライド構造をもつ化合物の阻害活性を示す図である。 酵母由来のα－グルコシダーゼに対する本発明のビニルハライド構造（Ｂｒ）をもつ化合物の阻害活性（濃度依存性）を示す図である。 酵母由来のα－グルコシダーゼに対する本発明のビニルハライド構造（Ｃｌ）をもつ化合物の阻害活性（濃度依存性）を示す図である。
　本発明の化合物は、下記式（１）示される化合物又はその塩である（以下、本発明の化合物（１）ということがある）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　式（１）中のＯＨ基（Ｒ１及びＡ１に含まれるＯＨ基を含む）は、修飾されていてもよい。ＯＨ基の修飾態様としては、ＯＨ基部分が、例えば、エーテル化（－ＯＲ）、カルボン酸エステル化（－ＯＣＯＲ）、硫酸化（－ＯＳＯ３Ｈ）、硫酸エステル化（－ＯＳＯ２（ＯＲ）、リン酸化（－ＯＰＯ（ＯＨ）２）、リン酸エステル化（－ＯＰＯ（ＯＨ）（ＯＲ）、－ＯＰＯ（ＯＲ）２）等されたものを挙げることができる。各ＯＨ基の修飾態様は、同一でも異なっていてもよい。なお、ここで示されるＲは、アルキル基、アリール基、アラルキル基等であり、１つの基に２つの置換基Ｒを有する場合は、同一であっても異なっていてもよい。アルキル基としては、炭素数１～４のアルキル基が好ましく、アリール基としては、炭素数６～１２のアリール基が好ましく、アラルキル基としては、炭素数７～１６のアラルキル基が好ましい。
　式（１）中、Ｒ１は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＹ１Ｙ２ＯＨを表す。Ｙ１及びＹ２は、それぞれ水素原子又は検出可能な標識を表す。検出可能な標識を導入する場合は、通常、Ｙ１及びＹ２のいずれか一方に導入すればよい。
　検出可能な標識はとしては、化学的な手法で検出できる標識であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルキニル基を含む標識、ビオチンを含む標識、蛍光標識、化学発光標識、放射性同位体標識等を挙げることができる。ここで、アルキニル基とは、１つ以上の三重結合を含むアルキル基をいう。
　ビオチンを含む標識としては、アビジンと特異的に結合するものであれば特に制限されるものではなく、ビオチンの誘導体を含むものであってもよい。
　蛍光標識としては、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミン、インドシアニン、キノキサリン等やそれらの誘導体を挙げることができる。
　化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、ルシゲニン、過シュウ酸エステル等を挙げることができる。
　放射性同位体としては、３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ等を挙げることができる。
　Ａ１は、糖又はアグリコンを表す。
　糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルクロン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、グルコサミン、マンノース、キシロース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルマンノサミン、マンノサミン等の単糖、又はこれら単糖から構成されるオリゴ糖若しくは多糖（糖鎖）等を挙げることができる。酸素原子との結合の位置は、標的とする酵素の基質と同一であることが好ましく、阻害剤やＡＢＰとして用いる場合にはこの結合が重要となる。なお、糖は、修飾されていてもよい。
　アグリコンとしては、種々の原子団を挙げることができ、脂肪族化合物、芳香族化合物、脂質、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、合成高分子等を挙げることができる。この中でも、脂質、ヌクレオチドが好ましい。脂質としては、例えば、グリセロ脂質、スフィンゴ脂質、ステロール等を挙げることができ、より具体的には、エルゴステロール、セラミド、ウリジン二リン酸を挙げることができる。例えば、アグリコンがエルゴステロールの場合、エルゴステリルグルコシド分解酵素（ＥＧＣｒＰ２）の阻害剤となり得る。
　式（１）中、Ｘは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基又はハロゲン原子を表す。炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基等を挙げることができ、メチル基が好ましい。また、ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子等を挙げることができ、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が特に好ましい。Ｘが上記のいずれの基であっても阻害剤及びＡＢＰとして用いることができるが、Ｘが水素原子の場合、ＡＢＰとしてより有用であり、Ｘが水素原子以外の場合、特にハロゲン原子の場合に、阻害剤としてより有用である。
　本発明の化合物（１）が塩の場合、薬学的に許容される塩であることが好ましい。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リジン塩、アルギニン塩を挙げることができる。
　本発明の化合物には、化合物（１）の各種異性体、その混合物、ラセミ体等も含まれる。
　本発明の化合物（１）は、糖加水分解酵素又は糖転移酵素阻害剤として用いることができる。
　すなわち、本発明の酵素阻害剤は、本発明の化合物（１）を含むものであり、例えば、下記式（２）で示される化合物（以下、基質化合物（２）ということがある）に作用する加水分解酵素、転移酵素の作用を阻害する。本発明の酵素阻害剤に含まれる本発明の化合物（１）は、糖加水分解酵素、糖転移酵素の作用する基質の２位水酸基をエキソメチレン基で置き換えた基質類似構造を有するものであり、基質化合物に応じて適宜変更することにより各種阻害剤を製造することができる。なお、本発明の化合物（１）は、基質化合物の２位にエキソメチレン基が導入された一見すると単純な構造であるが、基質化合物の２位の位置には水酸基が存在しており、この位置にメチレン基を導入しようとするとの発想は今までにないものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　式（２）中、Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表す。
　Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、具体的には、上記本発明の化合物（１）のＡ１と同様のものを挙げることができる。ここで、Ａ２は、好ましくはＡ１と同一である。さらに、基質化合物（２）のその他の部分の構造も、好ましくは化合物（１）と同一である（ただし、２位のエキソメチレン基、並びに標識Ｙ１及びＹ２を除く）。
　すなわち、本発明の化合物（１）を含む酵素阻害剤は、化合物（１）により近い構造の基質化合物に作用する酵素をより有効に阻害する。例えば、マルトース型化合物（１）含む糖加水分解酵素阻害剤は、マルトース型基質化合物（２）に作用する酵素の分解作用をより有効に阻害する。一方、イソマルトース型化合物（１）含む糖加水分解酵素阻害剤は、イソマルトース型基質化合物（２）に作用する酵素の分解作用をより有効に阻害する。
　本発明の酵素阻害剤は、標的酵素の基質でありながら、活性中心もしくはその近傍と共有結合を形成し、酵素活性を不可逆的に阻害するものであり、自殺基質（suicide substrate）又はmechanism-based inhibitorとも称されるものである。
　なお、式（２）中のＯＨ基（Ｒ２及びＡ２に含まれるＯＨ基を含む）は、本発明の化合物（１）と同様に、修飾されていてもよい。
　下記式（１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
で示される化合物又はその塩を含む本発明の糖加水分解酵素阻害剤は、α－グリコシダーゼ、好ましくはα－グルコシダーゼの分解作用を有効に阻害することができる。
　一方、下記式（１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
で示される化合物又はその塩を含む本発明の糖加水分解酵素阻害剤は、β－グリコシダーゼ、好ましくはβ－グルコシダーゼの分解作用を有効に阻害することができる。
　すなわち、本発明の化合物（１）は、基質化合物のα体、β体を区別して阻害することができる。
　また、式（１－１）又は（１－２）で示される化合物又はその塩を含む本発明の糖転移酵素阻害剤は、グリコシルトランスフェラーゼ、好ましくはグルコシルトランスフェラーゼの糖鎖合成作用を有効に阻害することができる。
　さらに、本発明の化合物（１）は、ＡＢＰとして用いることができる。
　すなわち、本発明のＡＢＰは、本発明の化合物（１）を含むものであり、例えば、基質化合物（２）に作用する酵素（基質化合物（２）に活性な酸素）を検知する。すなわち、本発明の化合物（１）は、化合物（１）と類似構造の基質化合物に対応する酵素に特異的に作用すると共に、その作用の際に酵素が不可逆的に結合することから、ある調査対象の酵素が作用する基質化合物を特定（検知）することができる。同様に、ある調査対象の基質化合物に作用する酵素を特定（検知）することができる。
　従来のＡＢＰは単糖構造であり、酵素と基質との関係（酵素が作用する基質の具体的な構造）を厳密に解析することができなかったが、本発明のＡＢＰは、酵素と基質の具体的な構造の関係を厳密に解析することができる。
　本発明の化合物（１）は、基質化合物を分解する酵素と、図１に示すようなメカニズムで共有結合形成し、不可逆的に結合していると考えられる。なお、このメカニズムは、現段階で発明者が考えているメカニズムであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　次に、本発明の化合物（１）の製造方法について説明する。
　本発明の化合物（１）は、例えば、金触媒の存在下、以下に示す反応式により反応させて化合物（１’）を製造し、必要に応じて脱保護、さらに必要に応じて修飾することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記Ｒ３～Ｒ５は保護基を表す。保護基としては、ｐ‐メトキシベンジル基（ＰＭＢ）などのベンジルエーテル系保護基、ピコリン酸基（Ｐｉｃｏ）、トリアルキルシリル基などのシリルエーテル系保護基等を挙げることができる。例えば、α体の化合物（１’）を製造する場合には、３位、４位及び６位のＯＨ基をｐ‐メトキシベンジル基で保護することが好ましい。また、β体の化合物（１’）を製造する場合には、３位及び４位のＯＨ基をｐ‐メトキシベンジル基で保護すると共に、６位の水酸基をピコリン酸基で保護することが好ましい。
　Ｒ６は、有機基を表す。有機基としては、特に制限はなく、例えば炭素数１～６のアルキル基を挙げることができ、ブチル基、シクロプロピル基が好ましい。
　具体的に、化合物（１’）を製造するには、例えば、アルゴンガス等の不活性ガスの雰囲気下、化合物（３）及び化合物（４）を溶解した有機溶媒（例えば、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒）溶液に、触媒を溶解した有機溶媒（例えば、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒）溶液を加える。なお、有機溶媒溶液には、脱水剤として、例えばモレキュラーシーブを添加することが好ましい。
　本発明の化合物（１）の製造方法に用いる触媒としては、１価の金の塩又は錯体（ＡｕＩ）であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２、ＰＰｈ３ＡｕＯＴｆ等を挙げることができる。
　反応温度としては、－７８～３０℃程度であり、０～２５℃程度が好ましい。反応時間としては、反応温度等の他の条件にもよるが、例えば、０．５～４８時間程度であり、１～２４時間程度が好ましく、１～１２時間程度がさらに好ましい。
　以下、本発明の具体的な実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの例に制限されるものではない。
［実施例１］
　下記に示す本発明のα－マルトース型化合物を製造した。なお、ＰＭＰは、ｐ－メトキシフェニル基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（α体製造用ドナーの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　窒素雰囲気下、化合物１（３．３９ｇ，６．６９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４２ｍｌ）を氷冷下、塩化ホスホリル（１．９ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）を滴下した。０℃から室温までゆっくり昇温しながら、１８時間半攪拌した後、反応溶液を冷やしたジエチルエーテルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の混合溶液に流し込んだ。ジエチルエーテルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物２（１．５２ｇ，４３％、Roudias, M.; Vallee, F.; Martel, J.; Paquin, J.-F. J. Org. Chem. 2018, 83, 8731に記載の化合物）を黄色油状物質として得た。
（化合物２）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.39 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.18 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 7.18 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 7.14 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.86 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.85 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.83 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 4.66 (ddt, J = 7.9, 4.3, 2.0 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.381 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.378 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 2.4, 2.0 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 6H), 3.76 (dd, J = 2.4, 2.0 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 10.8, 7.9 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 10.8, 4.3 Hz, 1H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　化合物２（１．５２ｇ，２．８５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３５ｍｌ）に水素化ホウ素ナトリウム（０．１２ｇ，３．２ｍｍｏｌ）の水溶液（９ｍｌ）を加えた。室温で２時間攪拌した後、水を加え反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物３（１．２２ｇ，８０％）を無色油状物質として得た。
（化合物３）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.24 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 7.21 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 7.18 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.87 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.86 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.85 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.46 (s, 1H), 4.64 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.53 (d, J =11.3 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.18-4.13 (m, 2H), 4.02 (dd, J = 12.1, 8.5 Hz, 1H), 3.97 (dd, J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 7.0, 5.2 Hz), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.74 (dd, J = 10.5, 5.8 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 10.5, 3.7 Hz, 1H), 1.94 (dd, J = 8.5, 2.8 Hz, 1H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　化合物３（１．０２ｇ，１．８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２１ｍｌ）にｏ－ヘキシル安息香酸（０．５７ｇ，２．８ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（０．５８ｇ，３．０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（０．２３ｇ，１．９ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．６ｍｌ，３．４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１２時間攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルで抽出、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物４（１．２２ｇ，９０％）を無色状物質として得た。
（化合物４）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.74 (dd, J = 7.9, 1.2 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 7.40 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.26-7.22 (m, 3H), 7.18 (brd, J = 8.9 Hz, 2H),7.17 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.87 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.84 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.78 (br d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.65 (s, 1H), 4.95 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.21-4.19 (m, 2H), 3.92 (dd, J = 6.7, 5.2 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.80-3.76 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.69 (dd, J = 10.7, 3.7 Hz, 1H), 2.46 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.63-1.58 (m, 2H), 1.51-1.44 (m, 2H), 0.94 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
（アクセプターの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　化合物５（１．０２ｇ，３．５５ｍｍｏｌ）とｐ－トルエンスルホン酸一水和物（６８ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２３ｍｌ）にｐ－アニスアルデヒドジメチルアセタール（６．０ｍｌ，３６ｍｍｏｌ）を加えた。４０℃で３時間加熱し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルで抽出、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝５００／１）で精製し、化合物６（１．４３ｇ，１００％）を白色非結晶質固体として得た。
（化合物６）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.42 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 7.02 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.90 (brd, J = 8.5 Hz, 2H) , 6.84 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.52 (s, 1H), 4.90 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 10.4, 4.9 Hz, 1H), 3.89 (td, J = 9.2, 1.8 Hz, 1H), 3.82-3.74 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.62 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.53 (td, J = 9.2, 4.9 Hz, 1H), 2.87 (d, J = 1.8 Hz, 1H, OH), 2.77 (d, J = 2.4 Hz, 1H, OH).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　化合物６（１．４３ｇ，３．５５ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２１ｍｌ）に無水酢酸（１４ｍｌ）を加えた。室温で１４時間半攪拌し、反応溶液をトルエンで共沸した（２回）。得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム）で精製し、化合物７（１．７１ｇ，９９％）を白色固体として得た。
（化合物７）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.37 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.95 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.88 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.83 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.49 (s, 1H), 5.38 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 9.5, 7.6 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.37 (dd, J = 10.5, 4.8 Hz, 1H), 3.85-3.67 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.60 (td, J = 9.8, 4.8 Hz, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.07 (s, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　モレキュラーシーブス４Å存在下、化合物７（１．７１ｇ，３．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３４ｍｌ）とジクロロメタン溶液（６０ｍｌ）にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２．２ｇ，３５．０ｍｍｏｌ）を加え、トリフルオロ酢酸（５．４ｍｌ，７０ｍｍｏｌ）を滴下した。３０℃で２時間加熱した後、ジクロロメタンで希釈し、セライトろ過により固形物をろ別した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／２）で精製し、化合物８（１．７０ｇ，９９％、シアノ水素化ホウ素ナトリウム由来の不純物込み）を白色固体として得た。
　続いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウム由来の不純物を除去するため下記の処理を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　窒素雰囲気下、化合物８（１．７０ｇ，３．４７ｍｍｏｌ）とｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム（０．４４ｇ，１．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍｌ）にエチルビニルエーテル（３．３ｍｌ，３５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１２時間攪拌し、氷冷下、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、エトキシエチル保護体９（１．４３ｇ）を無色油状物質として得た。ＥＳＩ－Ｍａｓｓによって目的物の生成を確認した。
HRMS-ESI (m/z): calcd for C29H38O11 (M+ Na)+ 585.2306, found 585.2301.
　上記のエトキシエチル保護体９（０．６９ｇ）のメタノール溶液（１５ｍｌ）にｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム（３５．７ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）加えた。室温で３時間３０分攪拌し、反応溶液をジクロロメタンで希釈後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を氷冷した酢酸エチル／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の混合溶液に流し込み、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／２）で精製し、化合物８（０．５０ｇ，２段階収率５８％）を無色油状物質として得た。
（化合物８）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.25 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.96 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.88 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.82 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.15 (dd, J = 9.6, 7.6 Hz, 1H), 5.11 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 3.84-3.77 (m, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.62 (dt, J = 9.6, 4.9 Hz, 1H), 3.26 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.07 (s, 3H).
（マルトース類縁体合成：ドナーとアクセプターの結合）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（４．５ｍｇ，２．９μｍｏｌ）とモレキュラーシーブス４Åにアクセプター８（３４．０ｍｇ，６９．３μｍｏｌ）と化合物４（３９．５ｍｇ，５４．８μｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１．２ｍｌ）を加えた。室温で１時間半攪拌後、ジクロロメタンで希釈し、セライトろ過により固形物をろ別した。溶媒で減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）と高速液体クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５０／５０）で精製し、化合物１０（１２．９ｍｇ，２３％）を無色油状物質として得た。（ＲＯＥＳＹ測定により１’位と３’位のＲＯＥ相関が観察されなかったことから立体化学を決定した。）
（化合物１０）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.29 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 7.22-7.19 (m, 4H), 7.03 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.96 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.87 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.83-6.77 (m, 8H), 5.30 (s, 1H), 5.25 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.20 (brs, 1H), 5.13 (dd, J = 9.5, 7.8 Hz, 1H), 5.01 (brs, 1H), 4.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.62 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.35 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.33(d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.25 (brd, J = 8.5 Hz, 1H), 3.94 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.99-3.70 (m 3H), 3.64-3.57 (m, 2H), 3.51-3.47 (m, 2H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　化合物１０（２２．２ｍｇ，４２．０μｍｏｌ）のジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）＝１０／１（１ｍｌ）混合溶液に氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（５１．０ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、１時間攪拌した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液クロロホルム／メタノール＝１０／１）で粗精製し、粗生成物を得た。
　得られた粗生成物のピリジン溶液（０．５１ｍｌ）に無水酢酸（０．３４ｍｌ）を加えた。室温で２時間攪拌し、反応溶液を氷冷した酢酸エチル／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。混合溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）と中圧分取液体クロマトグラフィー（カラム：山善ＵＬＴＲＡＰＡＣＫＳｉｌｉｃａ－３０Ａ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１０／９０）で精製し、化合物１１（９．８ｍｇ，２段階収率２８％）を無色油状物質として得た。
（化合物１１）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.94 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.82 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.78 (brd, J = 8.9 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 5.27 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.12 (dd, J = 9.5, 7.6 Hz, 1H), 5.11 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 5.07 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 9.8, 8.9 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 11.9, 2.1 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 12.5, 4.6 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 11.9, 5.8 Hz, 1H), 4.17 (ddd, J = 9.8, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 12.5, 2.1 Hz, 1H) 3.96 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.74 (ddd, J = 9.5, 5.8, 2.1 Hz, 1H), 2.10 (s, 6H), 2.07 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.03 (s, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　化合物１１（９．８ｍｇ，１４μｍｏｌ）のメタノール溶液（３．４ｍｌ）に氷冷下、ナトリウムメトキシド（５Ｍメタノール溶液，２８μｌ）を加えた。室温で３時間半攪拌後、溶媒を減圧留去して得た残渣をＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）（溶離液：水／メタノール＝６／１）で精製し、化合物１２（４．５ｍｇ，７２％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物１２）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.04 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.83 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.86 (s, 1H), 5.23 (t, J = 1.8 Hz, 1H),5.15 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.24 (dt, J = 9.5, 1.8 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 11.6, 2.1 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 12.1, 2.1 Hz, 1H), 3.84-3.77 (m, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.65 (dd, J = 12.2, 6.4 Hz, 1H), 3.64 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.47 (ddd, J = 9.5, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 3.43 (dd, J = 9.2, 7.9 Hz, 1H), 3.19 (t, J = 9.5 Hz, 1H).
［実施例２］
　下記に示す本発明のα－イソマルトース型化合物を製造した。なお、PMPは、p-メトキシフェニル基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（イソマルトース類縁体合成：ドナーとアクセプターの結合）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（３４．７ｍｇ，２２．１μｍｏｌ）とモレキュラーシーブス４Åに化合物１３（Shuihong, C.; Yuguo, D.; Feihong, B.; Guobin, Z. Carbohydrate Research, 2008, 343, 462-469に記載の化合物）（２２２ｍｇ，０．５３７ｍｍｏｌ）と化合物４（３２０ｍｇ，０．４４３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（９．０ｍｌ）を加えた。室温で２時間攪拌後、ジクロロメタンで希釈し、セライトろ過により固形物をろ別した。溶媒で減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／２）と中圧分取液体クロマトグラフィー（カラム：山善ＵＬＴＲＡＰＡＣＫ Ｓｉｌｉｃａ－４０Ｂ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝４０／６０）で精製し、化合物１４（２３８ｍｇ，５８％）を無色非結晶固体として得た。（ＲＯＥＳＹ測定により１’位と３’位のＲＯＥ相関が観察されなかったことから立体化学を決定した。）
（化合物１４）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.30 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 7.22 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 7.03 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.94 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.87 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.82 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.78 (brd, J = 8.9 Hz, 2H), 6.75 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.28 (brs, 1H), 5.26 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.19 (dd, J = 9.5, 7.8 Hz, 1H), 5.14 (s, 1H), 5.13 (brs, 1H), 5.08 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.39 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.38 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.32 (dt, J = 9.2, 1.8 Hz, 1H), 3.90 (ddd, J = 9.2, 4.0, 2.1 Hz, 1H), 3.82-3.77 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.64 (m, 1H), 3.61 (s, 3H), 3.66-3.57 (m, 2H), 3.50 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.00 (s, 3H). 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　化合物１４（９７．７ｍｇ，０．１０５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）＝１０／１（２．０９ｍｌ）混合溶液に氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（８３．０ｍｇ，０．３６６ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、２時間半攪拌した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液クロロホルム／メタノール＝１０／１）で粗精製し、不純物を含む、赤色固体として得た。（４７．８ｍｇ）
　得られた粗生成物のピリジン溶液（１．０ｍｌ）に無水酢酸（０．６６ｍｌ）を加えた。室温で１９時間攪拌し、反応溶液を氷冷した酢酸エチル／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に流し込んだ。混合溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）と中圧分取液体クロマトグラフィー（カラム：山善ＵＬＴＲＡＰＡＣＫＳｉｌｉｃａ－３０Ａ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝６０／４０）で精製し、化合物１５（２５．８ｍｇ，２段階収率３５％）を無色油状物質として得た。
（化合物１５）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.95 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.89 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.79 (dt, J = 9.5, 2.1 Hz, 1H), 5.29 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 9.8, 7.8 Hz, 1H), 5.18 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 5.14 (s, 1H), 5.09 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.93 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 4.16-4.09 (m, 2H), 3.97-3.93 (m, 1H), 3.87-3.79 (m, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.56 (dd, J = 10.1, 2.1 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.92 (s, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　化合物１５（１６．９ｍｇ，２４．３μｍｏｌ）のメタノール溶液（６．０ｍｌ）に氷冷下、ナトリウムメトキシド（１３．３ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間４５分攪拌後、溶媒を減圧留去して得た残渣をＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）（溶離液：水／メタノール＝４／１）で精製し、化合物１６（８．６ｍｇ，８０％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物１６）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD/D2O = 1/2) δ 7.07 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 6.90 (brd, J = 9.2 Hz, 2H), 5.22 (brt, J = 1.8 Hz, 1H), 5.20 (s, 1H), 5.09 (brt, J = 1.8 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.32 (dt, J = 9.2, 1.8 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 11.1, 6.1 Hz, 1H),3.83-3.78 (m, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.66 (dd, J = 11.9, 5.5 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 1H), 3.54-3.37 (m, 3H), 3.25 (t, J = 9.2 Hz, 1H).
［実施例３］
　下記に示す本発明のβ－エルゴステロール配糖体を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（β体製造用ドナー合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　化合物１７（１．５１ｇ，３．０８ｍｍｏｌ）、ピコリン酸（０．４７１ｍｇ，３．８３ｍｍｏｌ）、縮合剤ＣＯＭＵ（１．７１ｇ，４．００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３３ｍｌ）にＮ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（０．０３９２ｇ，０．３２１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．６ｍｌ，９．２ｍｍｏｌ）を加えた。室温３５時間半攪拌し、氷冷下、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応を停止した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／２）と中圧分取液体クロマトグラフィー（カラム：山善ＵＬＴＲＡＰＡＣＫＳｉｌｉｃａ－４０Ｂ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１５／８５）で精製し、化合物１８（１．４６ｇ，９７％）を黄色油状物質として得た。
（化合物１８）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.77-8.76 (m, 1H), 8.03 (brd, J = 7.8 Hz, 1H), 7.81 (td, J = 7.8, 2.0 Hz, 1H), 7.46 (ddd, J = 7.8, 4.6, 2.0 Hz, 1H), 7.28 (brd, J = 8.8 Hz, 2H), 7.22 (brd, J = 8.8 Hz, 2H), 6.88 (brd, J = 8.8 Hz, 2H), 6.81 (brd, J = 8.8 Hz, 2H), 6.40 (dd, J = 5.9, 1.0 Hz, 1H), 4.92 (dd, J = 5.9, 2.4 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 11.2 Hz. 1H),4.71 (dd, J = 12.2, 5,9 Hz, 1H), 4.64-4.60 (m, 3H), 4.50 (d J = 11.2 Hz, 1H), 4.27 (ddd, J = 8.3, 5.9, 2.4 Hz, 1H), 4.19 (ddd, J = 5.4, 2.4, 1.0 Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 8.3, 5.4 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.75 (s, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　化合物１８（１．９４ｇ，３．９５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド／ジエチルエーテル＝１／１（４．０ｍｌ）混合溶液に２１℃で、ＸｔａｌＦｌｏｕｒ－Ｅ（２．７２ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）を加えた。２１℃から２６℃付近で１１時間攪拌後、反応溶液を酢酸エチルで希釈した。混合溶液を飽和食塩水と水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液ヘキサン／酢酸エチル＝１／３）で粗精製し、無色油状物質を得た。
　得られた粗生成物のメタノール溶液（１８ｍｌ）に氷冷下、水素化ホウ素ナトリウム（５４．６ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ）の水溶液（１．３ｍｌ）を加えた。氷冷下、で３０分攪拌し、反応溶液を氷冷した酢酸エチル／水混合溶液に流し込んだ。混合溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／４）で精製し、化合物１９（０．４８ｇ，２段階収率２３％）を無色油状物質として得た。
（化合物１９）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.78 (ddd, J = 4.7, 1.5, 0.9 Hz, 1H), 8.07 (brd, J = 7.9 Hz, 1H), 7.83 (brt, J = 7.9 Hz, 1H), 7.48 (ddd, J = 7.9, 4.7, 1.5 Hz, 1H), 7.27-7.23 (m, 4H), 6.87 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.86 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.48 (s, 1H), 4.72 (dd, J = 12.1, 6.7 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 11.3 Hz, 1H),4.63 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 12.1, 3.1 Hz, 1H), 4.47-4.44 (m, 1H), 4.18 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 11.9, 8.5 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 11.9, 3.4 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 5.8, 4.6 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 1.76 (dd, J = 8.5, 3.4 Hz, 1H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　化合物１９（１１２ｍｇ，０．２１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０ｍｌ）にｏ－ヘキシル安息香酸（６４．９ｍｇ，０．３３１ｍｍｏｌ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（６１．８ｍｇ，０．３３２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（２．１ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６７μｌ，０．３８６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間半攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物２０（８３ｍｇ，５５％）を黄色油状物質として得た。
（化合物２０）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.78-8.77 (m, 1H), 8.06 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.82 (td, J = 7.3, 2.0 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 7.8, 1.0 Hz, 1H), 7.50 (brd, J = 7.8 Hz, 1H), 7.47 (brddd, J = 7.3, 4.9, 1.0 Hz, 1H), 7.40 (td, J = 7.8, 1.0 Hz, 1H), 7.26-7.19 (m, 5H), 6.82 (brd, J = 8.8 Hz, 2H), 6.78 (brd, J = 8.8 Hz, 2H), 6.64 (s, 1H), 4.95 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.75-4.67 (m, 3H), 4.62-4.53 (m, 3H), 4.54 (d, J = 11.2 Hz, 1H) 4.49-4.46 (m, 1H), 4.19 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 5.4, 4.4 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 2.45 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.60 (quin, J = 7.3 Hz, 2H), 1.47 (quin, J = 7.3 Hz, 2H), 0.93 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
（アクセプターの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（４０２ｍｇ，２．３０ｍｍｏｌ）のアセトン／ジクロロメタン＝１．５／１混合溶液（３０ｍｌ）にエルゴステロール２１（３２１ｍｇ，０．８０９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間半攪拌した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）と中圧分取液体クロマトグラフィー（カラム：山善ＵＬＴＲＡＰＡＣＫ Ｓｉｌｉｃａ－４０Ｂ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１０／９０）で精製し、化合物２２（２９９ｍｇ，６９％）を黄色油状物質として得た。（ＲＯＥＳＹ測定によりオレフィン部位の６位と１９位、７位と１８位にそれぞれＲＯＥ相関が観測されたことから立体化学を決定した。）
（化合物２２）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.44-7.38 (m, 4H), 7.29 (brt, J = 7.3 Hz, 1H), 6.38 (brd, J = 8.2 Hz, 1H), 6.20 (brd, J = 8.2 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 15.3, 7.3 Hz, 1H), 5.17 (dd, J = 15.3, 7.9 Hz, 1H), 4.41 (br, 1H), 3.14 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 2.50-2.45 (m, 1H), 2.33 (dd, J = 12.2, 6.4 Hz, 1H), 2.10-1.99 (m, 3H), 1.87-1.82 (m, 3H), 1.74-1.65 (m, 4H), 1.58-1.43 (m, 3H), 1.40-1.24 (m, 4H), 1.02 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.94 (br, 3H), 0.90 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.83-0.80 (m, 9H).
（β－エルゴステロール配糖体の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　モレキュラーシーブス４Å、化合物２２（１０．５ｍｇ，１８．４μｍｏｌ）と化合物２０（１０．８ｍｇ，１５．３μｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（０．２４ｍｌ）に金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（１８ｍｇ／ｍｌジクロロメタン溶液，６６μｌ）を加えた。２時間後、金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（１８ｍｇ／ｍｌジクロロメタン溶液，６６μｌ）を加え、さらに２時間後に金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（１８ｍｇ／ｍｌジクロロメタン溶液，６５μｌ）を加えた。１時間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、セライトろ過により固形物をろ別した。溶媒で減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）と高速液体クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５４／４６）で精製し、化合物２３（２．９ｍｇ，１８％）を無色油状物質として得た。（ＲＯＥＳＹ測定により１’位と３’位のＲＯＥ相関が観察されたことから立体化学を決定した。）
（化合物２３）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.73, (brd, J = 4.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.74 (td, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 5H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.32 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 7.18 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.87 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.78 (brd, J = 8.5 Hz, 2H), 6.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.45 (brs, 1H), 5.30 (brs, 1H), 5.23 (dd, J = 15.3, 7.0 Hz, 1H), 5.17 (dd, J = 15.3, 7.0 Hz, 1H), 5.05 (s, 1H), 4.82 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.56-4.52 (m, 3H), 4.48-4.42 (m, 1H), 4.05 (brd, J = 8.9 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.80-3.76 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.49 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 13.9, 4.3 Hz, 1H), 2.51-2.46 (m, 1H), 2.33 (dd, J = 12.2, 6.4 Hz, 1H), 2.13-2.02 (m, 4H), 1.89-1.82 (m, 2H), 1.79-1.68 (m, 4H), 1.58-1.26 (m, 8H), 1.03 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.90 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.80 (s, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　化合物２３（９．３ｍｇ，８．６３μｍｏｌ）のジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）＝１０／１（１７６μｌ）混合溶液に氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（４．６ｍｇ，２０．３μｍｏｌ）を加えた。室温で２時間半攪拌後２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（０．８ｍｇ，４．０μｍｏｌ）を加えた。さらに室温で３０分間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して粗生成物を得た。（７．５ｍｇ）
　得られた粗生成物のピリジン溶液（１２０μｌ）に無水酢酸（８０μｌ）を加えた。室温で１８時間半攪拌した。反応溶液をトルエンで共沸後、（３回）残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、化合物２４（６．０ｍｇ，２段階収率７６％）を白色固体として得た。
（化合物２４）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.73 (brd, J = 4.9 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.79 (td, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.45 (ddd, J = 7.8, 4.9, 1.5 Hz, 1H), 7.47-7.41 (m, 4H), 7.33-7.30 (m, 1H), 6.40 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.53 (brd, J = 9.3 Hz, 1H), 5.48 (br, 1H), 5.25-5.15 (m, 3H), 5.08-5.06 (m, 2H), 4.56-4.50 (m, 3H), 3.99 (td, J = 9.3, 3.9 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 14.2, 3.9 Hz, 1H), 2.53-2.46 (m, 1H), 2.33 (dd, J = 12.2, 6.3 Hz, 1H), 2.11-2.02 (m, 9H), 1.88-1.66 (m, 6H), 1.52-1.24 (m, 8H), 1.03 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.95 (s, 3H),0.90 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83-0.80 (m 9H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　化合物２４（３．７ｍｇ，６．７μｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１３５μｌ）を氷冷下、水素化ジイソブチルアルミニウム（１．０１Ｍトルエン溶液，９９μｌ）加えた。３時間半後に３３μｌ加えた。さらに６時間０℃で攪拌後、－４０℃まで冷却し、酢酸エチルでクエンチした。反応混合物に１Ｍ酒石酸ナトリウムカリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出後、水で洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝５０／１）と高速液体クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９５／５）で精製し、化合物２５（０．６０ｍｇ，１６％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物２５）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.57 (brdd, J = 6.9, 2.4 Hz, 1H), 5.48 (br, 1H), 5.39 (m, 1H), 5.29 (br, 1H), 5.23 (dd, J = 15.4, 7.0 Hz, 1H), 5.17 (dd, J = 15.4, 7.6 Hz, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.11-4.09 (m, 1H), 3.93-3.89 (m, 1H), 3.85-3.81 (m. 1H), 3.75-3.70 (m, 1H), 3.51-3.45 (m, 2H), 2.71 (brs, 1H), 2.52 (ddd, J = 13.4, 4.4, 2.4 Hz, 1H), 2.36 (brt, J = 13.4 Hz, 1H), 2.28 (brd, J = 4.6 Hz, 1H), 2.11-1.84 (m, 8H), 1.78-1.20 (m, 11H), 1.04 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.92 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.63 (s, 3H). 
［実施例４］
　下記に示す本発明のβ－セラミド配糖体を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
（β－セラミド配糖体の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　モレキュラーシーブス４Å、化合物２６（Santra, A.; Li, Y.; Yu, H.; Slack, T. J.; Wangb, P. G.; Chen, X. Chem. Commun., 2017, 53, 8280-8283に記載の化合物）（１３９ｍｇ，０．３２４ｍｍｏｌ）と化合物２０（１９０ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．０ｍｌ）に金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（５６ｍｇ／ｍｌジクロロメタン溶液，０．３８ｍｌ）を加えた。１時間後、金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（５６ｍｇ／ｍｌジクロロメタン溶液，０．３８ｍｌ）を加え、さらに２時間後に金錯体ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（５６ｍｇ／ｍｌジクロロメタン溶液，０．３８ｍｌ）を加えた。１時間半攪拌した後、セライトろ過により固形物をろ別した。溶媒で減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）と高速液体クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝６６／３４）で精製し、化合物２７（３９．１ｍｇ，１６％）を無色油状物質として得た。（ＲＯＥＳＹ測定により１’位と３’位のＲＯＥ相関が観察されたことから立体化学を決定した。）
（化合物２７）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.72 (brd, J = 4.4 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.04-8.03 (m, 2H), 7.80 (brt, J = 6.8 Hz, 1H), 7.56 (brt, J = 7.8 Hz, 1H), 7.47 (brdd, J = 6.8, 3.9 Hz, 1H) 7.43 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 5.92 (td, J = 15.6, 6.3 Hz, 1H), 5.67 (dd, J = 8.1, 3.9 Hz, 1H), 5.58 (brdd, J = 15.6, 8.1 Hz, 1H), 5.45 (brs, 1H), 5.37 (brs, 1H), 4.88 (s, 1H), 4.85 (dd, J = 11.7, 4.4 Hz, 1H), 4.53 (dd, J = 11.7, 3.9 Hz, 1H), 4.12 (brd, J = 8.8 Hz, 1H), 4.04-4.00 (m, 2H), 3.73-3.66 (m, 2H), 3.46 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 2.82 (brs, 1H), 2.06 (m, 2H), 1.48-1.18 (m, 22H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　化合物２７（１０．７ｍｇ，１１．５μｍｏｌ）のジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）＝１０／１（２３１μｌ）混合溶液に氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（７．５ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝８０／１）で精製し、化合物２８（６．９ｍｇ，８７％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物２８）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.72 (brd, J = 4.4 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.04-8.03 (m, 2H), 7.80 (brt, J = 6.8 Hz, 1H), 7.56 (brt, J = 7.8 Hz, 1H), 7.47 (brdd, J = 6.8, 3.9 Hz, 1H) 7.43 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 5.92 (td, J = 15.6, 6.3 Hz, 1H), 5.67 (dd, J = 8.1, 3.9 Hz, 1H), 5.58 (brdd, J = 15.6, 8.1 Hz, 1H), 5.45 (brs, 1H), 5.37 (brs, 1H), 4.88 (s, 1H), 4.85 (dd, J = 11.7, 4.4 Hz, 1H), 4.53 (dd, J = 11.7, 3.9 Hz, 1H), 4.12 (brd, J = 8.8 Hz, 1H), 4.04-4.00 (m, 2H), 3.73-3.66 (m, 2H), 3.46 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 2.82 (brs, 1H), 2.06 (m, 2H), 1.48-1.18 (m, 22H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　化合物２８（６．９ｍｇ，１０μｍｏｌ）のテトラヒドロフラン／メタノール＝２．３／１（２５０μｌ）混合溶媒に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００μｌ）を加えた。室温で４０時間攪拌した後、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、化合物２９（３．９ｍｇ，８１％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物２９）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 5.75 (dt, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 5.53 (brdd, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 5.36-5.34 (m, 1H), 5.26-5.25 (m, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.18 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 10.5, 7.0 Hz, 1H), 3.98 (brd, J = 9.0 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 11.7, 2.3 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 10.5, 4.3 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 11.7, 5.9 Hz, 1H), 3.58-3.53 (m, 1H), 3.39 (ddd, J = 9.0, 5.9, 2.3 Hz, 1H), 3.21 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 2.11-2.05 (m, 2H), 1.43-1.29 (m, 22H), 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 3H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　化合物２９（３．９ｍｇ，８．１μｍｏｌ）のメタノール（２２４μｌ）溶液にトリメチルホスフィン（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，２８μｌ）を加えた。室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去して粗生成物を得た。
　上記の粗生成物のテトラヒドロフラン溶液（２２５μｌ）に化合物３０（Santra, A.; Li, Y.; Yu, H.; Slack, T. J.; Wangb, P. G.; Chen, X. Chem. Commun., 2017, 53, 8280-8283に記載の化合物）（７．２ｍｇ，１９μｌ）とトリエチルアミン（７μｌ，５０μｍｏｌ）を加えた。室温で２時間半攪拌し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝３０／１）と高速液体クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９４／６）で精製し、化合物３１（１．８ｍｇ，３１％）を白色非結晶固体として得た。
（化合物３１）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD = 10/1) δ 6.47 (brd, J = 7.6 Hz, 1H), 5.65 (brdt, J = 15.6, 6.4 Hz, 1H), 5.39 (brdd, J = 15.6, 6.7 Hz, 1H), 5.25-5.24 (brm, 2H), 4.75 (brs, 1H), 4.11-4.09 (brm, 1H), 4.03-3.98 (brm, 2H), 3.82-3.79 (brm, 1H), 3.69-3.65 (brm, 1H), 3.36-3.28 (m, 1H), 3.23 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 2.11 (brt, J = 7.0 Hz, 2H), 1.97-1.93 (brm, 2H), 1.53-1.50 (brm, 2H), 1.12 (br, 50H), 0.80 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
［実施例５］
＜阻害活性評価＞
　酵母由来α－グルコシダーゼを用いて、被検化合物のα－グルコシダーゼ阻害活性を以下のようにして評価した。被検化合物としては、上記実施例１及び２で製造した本発明の化合物１２（マルトース型）及び化合物１６（イソマルトース型）を用いた。
　９６ウェルプレートを用いて実施した。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８（２４μｌ）、α－グルコシダーゼ（Ｙｅａｓｔ由来４６５１２００３、オリエント工業、０．１Ｕ／ｍｌ緩衝溶液，２５μｌ）、０．１Ｍ被検化合物（１μｌ）の混合溶液に、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ナカライテスク、１１９００－１２、４００μＭ水溶液，５０μｌ）を加えて３７℃でインキュベートした。反応溶液の蛍光（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定し、７分時点での蛍光値によってグルコシダーゼ阻害活性を評価した。（参考文献 Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.）
　結果を図２に示す。上記条件に被検化合物１μｌの代わりにＤＭＳＯを１μｌ加えたコントロールとしてα－グルコシダーゼの残存活性を棒グラフで表している。阻害率はコントロールを１としたとき、化合物を加えた時の活性とコントロールの割合を１から引いて算出した。
　イソマルトース構造を有する本発明の化合物１６は３％の阻害活性を示した一方、マルトース構造を有する本発明の化合物１２は、９９％の阻害活性を示した。本発明の化合物は、自身に近似する構造の基質化合物に作用する酵素を選択的に阻害するものであり、本実施例で用いた酵母由来α－グルコシダーゼは、マルトース型基質を選択的に分解する酵素であることがわかる。
［実施例６］
＜不可逆的阻害確認試験＞
　α－グルコシダーゼ（Ｙｅａｓｔ由来４６５１２００３、オリエント工業、０．１Ｕ／ｍｌ緩衝溶液，２９４μｌ）に０．１Ｍ被検化合物１２（６μｌ）を加え３７℃で３０分間インキュベートした。混合溶液を５０μｌずつ、９６ウェルプレートに加えた後、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ナカライテスク、１１９００－１２、４００μＭ水溶液，５０μｌ）を加え３７℃で蛍光検出（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）した。残りの混合溶液１５０μｌをＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（６９５６０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に加え４℃で３時間透析した。その後、９６ウェルプレートに５０μｌずつ加えた後、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ナカライテスク、１１９００－１２、４００μＭ水溶液，５０μｌ）を加え３７℃で蛍光検出（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）した。
　結果を図３に示す。透析前と後でα－グルコシダーゼ阻害活性がそれぞれ６９％と７９％でほとんど活性が変化していない。したがって、マルトース構造を有する化合物１２は、α‐グルコシダーゼを不可逆的に阻害していることが示された。
［実施例７］
　下記に示す本発明のα－グルコシド型化合物（ビニルハライド構造をもつ化合物）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
＜化合物３７の製造＞
（α体製造用ドナーの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　アルゴン雰囲気下、化合物２（１．００ｇ，１．８７ｍｍｏｌ）とフェニルチオトリメチルシラン（０．７１ｍｌ，３．７４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１８．７ｍｌ）に、－６０℃でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１６．９μｌ，９３．５μｍｏｌ）を加えた。－６０℃で７時間攪拌した後、酢酸エチルで希釈したのち、氷冷下、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を停止した。酢酸エチルで抽出し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物３２（６００ｍｇ，３２Ａ：３２Ｂ＝１．３：１，４４％）を黄色油状物質として得た。
（化合物３２Ａ）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.45-7.41 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 6H), 7.23-7.15 (m, 8H), 6.88-6.80 (m, 6H), 6.55 (s, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.64 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.62 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.39 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.38 (brd, J = 4.3 Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.89 (dd, J = 5.8, 4.3 Hz, 1H), 3.804 (s, 3H), 3.799 (s, 3H), 3.795 (s, 3H), 3.66 (dd, J = 10.7, 5.8 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 10.7, 4.0 Hz, 1H).
（化合物３２Ｂ）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.56-7.54 (m, 2H), 7.31-7.23 (m, 12H), 7.09 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.86-6.81 (m, 6H), 6.48 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 6.46 (brs, 1H), 4.78 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.44 (ddd, J = 9.5, 3.7, 2.1 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.39 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.66 (dd, J = 9.5, 9.2 Hz, 1H), 3.64 (dd, J = 10.7, 2.1 Hz, 1H).
（ドナーとアクセプターの結合）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　モレキュラーシーブス４Åと３－フェニル－１－プロパノール（６３．５μｌ，０．４６６ｍｍｏｌ）と化合物３２Ａと３２Ｂの混合物（２８６ｍｇ，０．３８８ｍｍｏｌ，１．３：１）のジクロロメタン溶液（３．９ｍｌ）に－１０℃で、トリフルオロメタンスルホン酸（３４５μｌ／ｍｌジクロロメタン溶液，１０μｌ，３８．８μｍｏｌ）とＮ－ヨードスクシンイミド（９６．１ｍｇ，０．４２７ｍｍｏｌ）を加えた。－１０℃で１時間攪拌後、反応溶液を冷やした酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と１Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液の混合溶液に滴下し反応を停止した。セライトろ過により固形物をろ別し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒で減圧留去して得た残渣を中圧分取液体クロマトグラフィー（カラム：山善ＵＬＴＲＡＰＡＣＫＳｉｌｉｃａ－３０Ｂ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物３３（１５０ｍｇ，５０％）を無色油状物質として得た。
（化合物３３）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.34-7.22 (m, 11H), 7.21-7.15 (m, 3H), 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.87-6.81 (m, 6H), 6.48 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.72 (s, 1H), 4.77 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 3.96 (ddd, J = 9.8, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.779 (s, 3H), 3.778 (s, 3H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.62 (dd, J = 10.7, 2.1 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 9.8, 8.9 Hz, 1H), 3.52 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 2.76-2.64 (m, 2H), 1.97-1.91 (m, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　化合物３３（５６．７ｍｇ，０．０７４３ｍｍｏｌ）と水素化トリブチルスズ（６０μｌ，０．２２３ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３８．８μｌ，０．２２３ｍｍｏｌ）の脱気トルエン溶液を、加熱還流しながらアゾビスイソブチロニトリル（１２．２ｍｇ／ｍｌ脱気トルエン溶液，１００μｌ）を加えた。１時間後、アゾビスイソブチロニトリル（１２．２ｍｇ／ｍｌ脱気トルエン溶液，１００μｌ）を追加した。１時間攪拌した後、溶媒を減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７／１）で精製し、化合物３４（５１．５ｍｇ，７３％）を白色油状物質として得た。
（化合物３４）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.34-7.31 (m, 2H), 7.28-7.21 (m, 4H), 7.20-7.14 (m, 3H), 7.10-7.06 (m, 2H), 6.88-6.80 (m, 6H), 6.16 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.78 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.62 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.44 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.94 (ddd, J = 9.8, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.787 (s, 3H), 3.773 (s, 3H), 3.71 (dt, J = 9.5, 7.0 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 10.7, 4.6 Hz, 1H), 3.63 (dd, J = 10.7, 2.1 Hz, 1H), 3.46-3.39 (m, 2H), 2.74-2.63 (m, 2H), 1.98-1.88 (m, 2H), 1.55-1.46 (m, 6H), 1.35-1.24 (m, 6H), 0.95-0.91 (m, 6H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 9H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　アルゴン雰囲気下、化合物３４（４４．９ｍｇ，０．０４７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７５１μｌ）に、別途調製した二フッ化キセノンと２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルピリジンのジクロロメタン溶液（ＸｅＦ２：１９．３ｍｇ，ＤＴＢＭＰ：５８．６ｍｇを０．４０ｍｌのジクロロメタンに溶解）を２００μｌ加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホン酸銀（３６．７ｍｇ，０．１４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分攪拌後、塩化ナトリウムを入れて反応を停止した。セライトろ過により固形物をろ別し、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒で減圧留去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）で精製し、化合物３５（９．４ｍｇ，２９％）を無色油状物質として得た。
（化合物３５）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.24 (m, 6H), 7.19-7.16 (m, 3H), 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.58 (dd, J = 83.9, 2.1 Hz, 1H), 5.64 (s, 1H), 4.74 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.38 (m, 1H), 3.85 (ddd, J = 9.8, 3.7, 1.8 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.71 (dd, J = 10.7, 3.7 Hz, 1H), 3.69 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz), 3.60 (dd, J = 9.8, 9.5 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 10.7, 1.8 Hz, 1H), 3.47 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 2.73-2.61 (m, 2H), 1.94-1.88 (m, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　化合物３５（８．５ｍｇ，１２．６μｍｏｌ）をジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）（３７６μｌ，１０／１）混合液に溶解させた。氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（１０．０ｍｇ，４４．２μｍｏｌ）を加えた。室温に昇温し、４時間攪拌した後、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（２．９ｍｇ，１２．７μｍｏｌ）を再度加え、さらに３０分間攪拌した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝５０／１）で粗精製し、粗生成物を得た。
　得た粗生成物のピリジン溶液（１１１μｌ）に無水酢酸（７４μｌ）を加え、室温で９時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。酢酸エチルで抽出した後、酢酸エチル層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）と高速液体クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物３６（１．１ｍｇ，２段階収率２０％）を無色油状物質として得た。
（化合物３６）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.31-7.26 (m, 2H), 7.21-7.18 (m, 3H), 6.47 (dd, J = 81.8, 2.1 Hz, 1H), 5.86 (ddd, J = 9.5, 5.2, 2.1 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 4.99 (dd, J = 9.8, 9.5 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 12.2, 4.3 Hz, 1H), 4.08 (ddd, J = 9.8, 4.3, 2.1 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 12.2, 2.1 Hz, 1H), 3.70 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.50 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 2.73 (dt, J = 14.0, 7.6 Hz, 1H), 2.70 (dt, J = 14.0, 7.6 Hz, 1H), 2.09 (s,3H), 2.054 (s, 3H), 2.045 (s, 3H), 1.96 (tt, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　化合物３６（１．１ｍｇ，２．５１μｍｏｌ）のメタノール溶液（７８．６μｌ）に、ナトリウムメトキシド（０．４ｍｇ，７．５３μｍｏｌ）を加えた。室温で３０分攪拌後、溶媒を減圧留去して得た残渣をＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）（溶離液：水／メタノール＝１／４）で精製し、化合物３７（１．０ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物３７）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.25 (dd, J = 7.6, 7.3 Hz, 2H), 7.19 (brd, J = 7.6 Hz, 2H), 7.15 (tt, J = 7.3, 1.2 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 85.1, 2.4 Hz, 1H), 5.58 (s, 1H), 4.29 (ddd, J = 9.2, 5.8, 2.4 Hz, 1H), 3.79 (m, 1H), 3.75 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.45 (dt, 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.28 (dd, J = 9.5, 9.2 Hz, 1H), 2.72 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.68 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 1.91 (tt, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H).
＜化合物４０の製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　アルゴン雰囲気下、化合物３４（９．６ｍｇ，０．０１０２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０３μｌ）に塩化銅（ＩＩ）（１７．１ｍｇ／ｍｌテトラヒドロフラン溶液，２００μｌ）を加え、室温で攪拌した。３時間４５分後、塩化銅（ＩＩ）（１７．１ｍｇ／ｍｌテトラヒドロフラン溶液，１００μｌ）を再度加えた。１４時間半攪拌した後、反応溶液をジエチルエーテルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を入れて反応を停止した。混合溶液をジエチルエーテルで抽出し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製し、化合物３８（８．２ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を無色油状物質として得た。
（化合物３８）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.28-7.24 (m, 6H), 7.19-7.16 (m, 3H), 7.04 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.20 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 5.71 (s, 1H), 4.74 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 10.4, 1H), 4.39 (dd, J = 9.2, 2.1 Hz, 1H), 3.89 (ddd, J = 9.8, 4.0, 1.8, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.70 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 10.7, 4.0 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 10.7, 1.8 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 9.8, 9.2 Hz, 1H), 3.51 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 2.70 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.65 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 1.92 (tt, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　化合物３８（５．０ｍｇ，７．２５μｍｏｌ）をジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）（２１７μｌ，１０／１）混合液に溶解させた。氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（４．９ｍｇ，２１．８μｍｏｌ）を加えた。室温に昇温し、３時間半攪拌した後２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（２．５ｍｇ，１１．０μｍｏｌ）を再度加え、さらに１時間半攪拌した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝５０／１）で粗精製し、粗生成物を得た。
　得た粗生成物のピリジン溶液（１１７μｌ）に無水酢酸（７８μｌ）を加え、室温で１２時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を入れて反応を加えた。酢酸エチルで抽出した後、酢酸エチル層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）と高速液体クロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物３９（３．４ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を無色油状物質として得た。
（化合物３９）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.31-7.24 (m, 2H), 7.21-7.17 (m, 3H), 6.08 (brd, J = 2.1, 1H), 5.87 (dd, J = 9.5, 2.1 Hz, 1H), 5.74 (s, 1H), 4.97 (dd, J = 10.1, 9.5 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1H), 4.13 (ddd, J = 10.1, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 12.2, 2.1 Hz, 1H), 3.72 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.54 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 2.74 (dt, J = 13.7, 7.3 Hz, 1H), 2.70 (dt, J = 13.7, 7.3 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.97 (tt, J = 7.3, 6.4 Hz, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　化合物３９（３．４ｍｇ，７．４７μｍｏｌ）のメタノール溶液（１１７μｌ）に、ナトリウムメトキシド（１．２ｍｇ，２２．４μｍｏｌ）を加えた。室温で３０分攪拌後、溶媒を減圧留去して得た残渣をＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）（溶離液：水／メタノール＝１／４）で精製し、化合物４０（１．１ｍｇ，５７％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物４０）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.25 (t, J = 7.3, 2H), 7.20 (brd, J = 7.3 Hz, 2H), 7.15 (tt, J = 7.3, 1.5 Hz, 1H), 6.25 (brd, J = 2.4 Hz, 1H), 5.67 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 11.6, 2.1 Hz, 1H), 3.77 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.73 (ddd, J = 9.5, 5.5, 2.1 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 11.6, 5.5 Hz, 1H), 3.48 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 9.5, 9.2 Hz, 1H), 2.74 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.69 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 1.92 (tt, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H).
＜化合物４３の製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　アルゴン雰囲気下、化合物３４（９．５ｍｇ，０．０１０１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０１μｌ）にＮ－ブロモスクシンイミド（２．７ｍｇ，１５．１μｍｏｌ）を加えた。３０分攪拌した後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を入れて反応を停止した。混合溶液をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７／１）で精製し、化合物４１（４．８ｍｇ，６５％）を無色油状物質として得た。
（化合物４１）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.23 (m, 6H), 7.19-7.16 (m, 3H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.33 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.68 (brs, 1H), 4.74 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 10.3, 1H), 4.36 (dd, J = 9.3, 2.4 Hz, 1H), 3.91 (ddd, J = 9.8, 3.9, 2.0 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.71 (dt, J = 9.8, 6.3, 1H), 3.69 (dd, J = 10.7, 3.9 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 10.7, 2.0 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 9.8, 9.3 Hz, 1H), 3.52 (dt, J = 9.8, 6.3 Hz, 1H), 2.71 (dt, J = 14.2, 7.3 Hz, 1H), 2.66 (dt, J = 14.2, 7.3 Hz, 1H), 1.93 (tt, J = 7.3, 6.3 Hz, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　化合物４１（４．８ｍｇ，６．５４μｍｏｌ）をジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）（１８０μｌ，１０／１）混合液に溶解させた。氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（４．８ｍｇ，２１．２μｍｏｌ）を加えた。室温に昇温し、４時間攪拌した後２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（１．４ｍｇ，６．０６μｍｏｌ）を再度加え、さらに１時間攪拌した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で粗精製し、粗生成物を得た。
　得た粗生成物のピリジン溶液（５７μｌ）に無水酢酸（３８μｌ）を加え、室温で１１時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。酢酸エチルで抽出した後、酢酸エチル層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）と高速液体クロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物４２（１．５ｍｇ，二段階収率４６％）を無色油状物質として得た。
（化合物４２）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.31-7.26 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 3H), 6.22 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.82 (dd, J = 9.8, 2.1 Hz, 1H), 5.71 (brs, 1H), 4.98 (dd, J = 10.1. 9.8 Hz, 1H),4.29 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1H), 4.14 (ddd, J = 10.1, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 12.2, 2.1 Hz, 1H), 3.73 (dt, J = 9.8, 6.1 Hz, 1H), 3.56 (dt, J = 9.8, 6.1 Hz, 1H), 2.74 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.71 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.054 (s, 3H), 2.045 (s, 3H), 1.97 (tt, J = 7.6, 6.1 Hz, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　化合物４２（１．５ｍｇ，１．８０μｍｏｌ）のメタノール溶液（６０μｌ）に、ナトリウムメトキシド（０．３ｍｇ，５．４１μｍｏｌ）を加えた。室温で５時間攪拌後、溶媒を減圧留去して得た残渣をＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）（溶離液：水／メタノール＝１／２）で精製し、化合物４３（１．４ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物４３）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.25 (t, J = 7.0 Hz,2H), 7.20 (brd, J = 7.0 Hz, 2H), 7.15 (tt, J = 7.0, 1.5 Hz, 1H), 6.37 (brd, J = 2.4 Hz, 1H), 5.64 (s, 1H), 4.27 (dd, J = 9.2, 2.1 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 11.6, 2.1 Hz, 1H), 3.77 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.74 (ddd, J = 9.8, 5.5, 2.1 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 11.6, 5.5 Hz, 1H), 3.50 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 9.8, 9.2 Hz, 1H), 2.73 (dt, J = 13.7, 7.3 Hz, 1H), 2.69 (dt, J = 13.7, 7.3 Hz, 1H), 1.92 (tt, J = 7.3, 6.4 Hz, 2H).
＜化合物４６の製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　アルゴン雰囲気下、化合物３４（１０．０ｍｇ，１０．６μｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０６μｌ）にヨウ素（４．０ｍｇ，１５．９μｍｏｌ）を加えた。１０分攪拌した後、反応溶液をクロロホルムで希釈し、１Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液を入れて反応を停止した。混合溶液をクロロホルムで抽出し、クロロホルム層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）とシリカゲルクロマトグラフィー（フッ化カリウム含む、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）で精製し、化合物４４（７．８ｍｇ，９４％）を無色油状物質として得た。
（化合物４４）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.24 (m, 6H), 7.21-7.16 (m, 3H), 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.43 (brd, J = 1.5 Hz, 1H), 5.54 (brs, 1H), 4.74 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 10.3, 1H), 4.37 (dd, J = 10.3, 1.5 Hz, 1H), 3.93 (m,  1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.72 (dt, J = 10.3, 6.3, 1H), 3.69 (dd, J = 10.3, 3.9 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 10.3, 1.5 Hz, 1H), 3.55 (dt, J = 10.3, 6.3 Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 9.8, 9.3 Hz, 1H), 2.72 (dt, J = 14.2, 7.3 Hz, 1H), 2.67 (dt, J = 14.2, 7.3 Hz, 1H), 1.94 (tt, J = 7.3, 6.3 Hz, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　化合物４４（６．４ｍｇ，８．２０μｍｏｌ）をジクロロメタン／リン酸緩衝液（ｐＨ７）（２４５μｌ，１０／１）混合液に溶解させた。氷冷下、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（５．６ｍｇ，２４．６μｍｏｌ）を加えた。室温まで昇温し、３時間半攪拌した後２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（２．８ｍｇ，１２．３μｍｏｌ）を再度加え、さらに１時間半攪拌した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝５０／１）で粗精製し、粗生成物を得た。
　得た粗生成物のピリジン溶液（１４１μｌ）に無水酢酸（９４μｌ）を加え、室温で１２時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。酢酸エチルで抽出した後、酢酸エチル層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７／１）と高速液体クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製し、化合物４５（５．１ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を無色油状物質として得た。
（化合物４５）
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.29 (dd, J = 7.6, 7.3 Hz, 2H),7.23-7.17 (m, 3H), 6.35 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.81 (dd, J = 9.8, 2.1 Hz, 1H), 5.57 (s, 1H), 4.96 (dd, J = 10.1. 9.8 Hz, 1H),4.29 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1H), 4.16 (ddd, J = 10.1, 4.6, 2.4 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 12.2, 2.4 Hz, 1H), 3.74 (dt, J = 10.1, 6.1 Hz, 1H), 3.58 (dt, J = 10.1, 6.1 Hz, 1H), 2.75 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.72 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.98 (tt, J = 7.6, 6.1, 2H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　化合物４５（４．２ｍｇ，７．６９μｍｏｌ）のメタノール溶液（６６μｌ）に、ナトリウムメトキシド（５Ｍメタノール溶液，２．５μｌ）を加えた。室温で１時間攪拌後、溶媒を減圧留去して得た残渣をＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）（溶離液：水／メタノール＝１／２）で精製し、化合物４６（２．２ｍｇ，６８％）を白色非結晶状固体として得た。
（化合物４６）
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.26 (dd, J = 7.6, 7.0, 2H), 7.21 (brd, J = 7.6, 2H), 7.15 (tt, J = 7.0, 1.5 Hz, 1H), 6.45 (brd, J = 2.1 Hz, 1H), 5.51 (s, 1H), 4.28 (dd, J = 9.2, 2.1 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 11.6, 2.1 Hz, 1H), 3.78 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.76 (ddd, J = 9.8, 5.2, 2.1 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 11.6, 5.2 Hz, 1H), 3.51 (dt, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 9.8, 9.2 Hz, 1H), 2.74 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 2.70 (dt, J = 13.7, 7.6 Hz, 1H), 1.93 (tt, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H).
［実施例１２］
＜阻害活性評価＞
　酵母由来α－グルコシダーゼを用いて、被検化合物のα－グルコシダーゼ阻害活性を以下のようにして評価した。被検化合物としては、上記実施例７で製造した本発明の化合物３７、４０、４３、４６を用いた。
　９６ウェルプレートを用いて実施した。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８（２４μｌ）、α－グルコシダーゼ（Ｙｅａｓｔ由来４６５１２００３、オリエント工業、０．２Ｕ／ｍｌ緩衝溶液，２５μｌ）、１０ｍＭ被検化合物（１μｌ）の混合溶液に、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ナカライテスク、１１９００－１２、２０μＭ水溶液，５０μｌ）を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。反応溶液の蛍光（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定し、４分時点での蛍光値によってグルコシダーゼ阻害活性を評価した。（参考文献 Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.）
　結果を図４に示す。上記条件に被検化合物１μｌの代わりにＤＭＳＯを１μｌ加えたコントロールとしてα－グルコシダーゼの残存活性を棒グラフで表している。阻害率はコントロールを１としたとき、化合物を加えた時の活性とコントロールの割合を１から引いて算出した。
　ハロゲンをエキソメチレン基の末端に有する化合物はいずれもマルトース構造を有する本発明の化合物１２よりも高い阻害活性を示した。図４では、化合物の終濃度１００μＭでの本発明の化合物の活性を示す。Ｆ原子やＩ原子をもつ化合物３７、４６は、この濃度での阻害活性は数％にとどまった。一方、Ｂｒ原子をもつ化合物４３は５０％程度、Ｃｌ原子をもつ化合物４０は、本実施例で用いた酵母由来α－グルコシダーゼ活性をほぼ完全に阻害した。
［実施例１３］
＜阻害活性評価（濃度依存性）＞
　酵母由来α－グルコシダーゼを用いて、被検化合物のα－グルコシダーゼ阻害活性を以下のようにして評価した。被検化合物としては、上記実施例７で製造した本発明の化合物４３を用いた。
　９６ウェルプレートを用いて実施した。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８（２４μｌ）、α－グルコシダーゼ（Ｙｅａｓｔ由来４６５１２００３、オリエント工業、０．２Ｕ／ｍｌ緩衝溶液，２５μｌ）、ＸｍＭ被検化合物４３（Ｘ＝１～１９ｍＭ，１μｌ）の混合溶液に、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ナカライテスク、１１９００－１２、２０μＭ水溶液，５０μｌ）を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。反応溶液の蛍光（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定し、４分時点での蛍光値によってグルコシダーゼ阻害活性を評価した。（参考文献 Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.）
　結果を図５に示す。上記条件に被検化合物１μｌの代わりにＤＭＳＯを１μｌ加えたコントロールとしてα－グルコシダーゼの残存活性を棒グラフで表している。阻害率はコントロールを１としたとき、化合物を加えた時の活性とコントロールの割合を１から引いて算出した。
　Ｂｒ原子をもつ化合物４３は、本実施例で用いた酵母由来α－グルコシダーゼ活性を濃度依存的に阻害した。
［実施例１４］
＜阻害活性評価（濃度依存性）＞
　酵母由来α－グルコシダーゼを用いて、被検化合物のα－グルコシダーゼ阻害活性を以下のようにして評価した。被検化合物としては、上記実施例７で製造した本発明の化合物４０を用いた。
　９６ウェルプレートを用いて実施した。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８（２４μｌ）、α－グルコシダーゼ（Ｙｅａｓｔ由来４６５１２００３、オリエント工業、０．２Ｕ／ｍｌ緩衝溶液，２５μｌ）、ＸｍＭ被検化合物４０（Ｘ＝０．４～３ｍＭ，１μｌ）の混合溶液に、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－グルコピラノシド（ナカライテスク、１１９００－１２、２０μＭ水溶液，５０μｌ）を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。反応溶液の蛍光（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定し、４分時点での蛍光値によってグルコシダーゼ阻害活性を評価した。（参考文献 Bennet, A. J. J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 10625.）
　結果を図６に示す。上記条件に被検化合物１μｌの代わりにＤＭＳＯを１μｌ加えたコントロールとしてα－グルコシダーゼの残存活性を棒グラフで表している。阻害率はコントロールを１としたとき、化合物を加えた時の活性とコントロールの割合を１から引いて算出した。
　Ｃｌ原子をもつ化合物４０は、本実施例で用いた酵母由来α－グルコシダーゼ活性を濃度依存的に阻害し、そのＩＣ５０値は１０μＭ程度であった。
　したがって、エキソメチレン基末端に適切なハロゲン原子を導入することで、本発明の化合物群の酵素阻害活性を飛躍的に向上させることが可能である。
　本発明の化合物は、酵素阻害剤及び／又はＡＢＰとして用いることができることから、産業上有用である。

 

Claims (14)

  1. 　下記式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［Ｒ１は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＹ１Ｙ２ＯＨ（Ｙ１及びＹ２は、それぞれ水素原子又は検出可能な標識を表す）を表し、Ａ１は、糖又はアグリコンを表し、Ｘは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基又はハロゲン原子を表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物又はその塩。
  2. 　式（１）のＯＨ基の修飾が、エーテル化、カルボン酸エステル化、硫酸化、硫酸エステル化、リン酸化、又はリン酸エステル化であることを特徴とする請求項１記載の化合物又はその塩。
  3. 　式（１）のＡ１で表されるアグリコンが、脂質又はヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の化合物又はその塩。
  4. 　式（１）のＹ１及びＹ２で表される検出可能な標識が、アルキニル基を含む標識、ビオチンを含む標識、蛍光標識、化学発光標識、又は放射性同位体標識であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の化合物又はその塩。
  5. 　請求項１～４のいずれか記載の化合物又はその塩を含み、糖加水分解酵素又は糖転移酵素の作用を阻害することを特徴とする酵素阻害剤。
  6. 　下記式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される基質化合物に作用する糖加水分解酵素又は糖転移酵素の作用を阻害することを特徴とする請求項５記載の酵素阻害剤。
  7. 　下記式（１－１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で示される化合物又はその塩を含み、α－グリコシダーゼの作用を阻害することを特徴とする請求項５又は６記載の酵素阻害剤。
  8. 　下記式（１－２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で示される化合物又はその塩を含み、β－グリコシダーゼの作用を阻害することを特徴とする請求項５又は６記載の酵素阻害剤。
  9. 　請求項１～４のいずれか記載の化合物又はその塩を含むことを特徴とするＡＢＰ（アクティビティベースドプローブ）。
  10. 　下記式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される基質化合物に作用する酵素を検知することを特徴とする請求項９記載のＡＢＰ。
  11. 　請求項９又は１０記載のＡＢＰを用いて、基質化合物に作用する酵素を検知することを特徴とする酵素の検知方法。
  12. 　基質化合物が、下記式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物であることを特徴とする請求項１１記載の酵素の検知方法。
  13. 　請求項９又は１０記載のＡＢＰを用いて、酵素が作用する基質化合物を検知することを特徴とする基質化合物の検知方法。
  14. 　基質化合物が、下記式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［Ｒ２は、－ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＯＨを表し、Ａ２は、糖又はアグリコンを表し、ＯＨ基は修飾されていてもよい。］で示される化合物であることを特徴とする請求項１３記載の基質化合物の検知方法。

     
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