WO2020241778A1 - 線維化を抑制する医薬組成物 - Google Patents

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WO2020241778A1
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gpr68
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inflammatory
fibrotic
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直哉 松永
茂弘 大戸
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition that suppresses fibrosis, specifically, a chronic kidney disease-induced myocarditis heart fibrosis-suppressing compound that targets GPR68 (OGR1), and a pharmaceutical composition containing the same.
  • a pharmaceutical composition that suppresses fibrosis, specifically, a chronic kidney disease-induced myocarditis heart fibrosis-suppressing compound that targets GPR68 (OGR1), and a pharmaceutical composition containing the same.
  • Chronic kidney disease refers to a condition in which kidney damage or a decrease in glomerular filtration rate continues for 3 months or longer, and includes chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis, etc. When it becomes severe, it leads to end-stage renal failure, and artificial dialysis treatment and kidney transplantation are required.
  • CKD chronic kidney disease
  • the number of CKD patients in Japan is estimated to be 13.3 million and the number of dialysis patients is estimated to be 320,000, and the number of patients is expected to increase in the future (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 3 This close relationship between the heart and kidney is called “cardiorenal connection”, and prevention of CVD in the treatment of CKD patients is regarded as one of the important matters leading to improvement of life prognosis.
  • RAA renin-angiotensin-aldosterone
  • ACEi Enzyme inhibitor
  • ARB Angiotensin II receptor blocker
  • the onset mechanism of chronic heart failure during CKD is thought to be that an increase in the pressure load on the ventricles caused by a decrease in renal function causes inflammation and fibrosis of the myocardium, impairing the diastolic function of the ventricles and leading to heart failure. So far, there are limited drugs and means that can treat inflammation and fibrosis in heart failure.
  • an anti-inflammatory composition containing Cephalotaxaceae, a plant belonging to the genus Cephalotaxaceae, as an active ingredient, and foods and drinks or pharmaceuticals containing the composition are disclosed (Patent Document 1).
  • cephalotaxus an alkaloid extracted from the skin, stems, leaves and seeds of Cephalotaxus fortunei, C. oliveri and C. harringtonia, and cephalotaxin.
  • a composition for treating or preventing angiogenic diseases, which comprises a cephalotaxin analog, is disclosed (Patent Documents 2, 3, and 4).
  • Patent Document 2 further lists as cephalotaxin analogs such as halintonin, isoharintonin, homoharintonin, and deoxyhalintonin, which are used for the treatment or prevention of angioplastic diseases.
  • cephalotaxin analogs such as halintonin, isoharintonin, homoharintonin, and deoxyhalintonin, which are used for the treatment or prevention of angioplastic diseases.
  • Homoharintonin has been disclosed to be used in the treatment of chronic myelogenous leukemia, related myeloproliferative disorders or Ph-positive acute lymphocytic leukemia (Non-Patent Document 5), and EMEA has released it as a therapeutic agent for chronic myelogenous leukemia. It is a pharmaceutical compound that has been designated as a fun drug.
  • an object of the present invention is to discover a new cardioprotective agent that suppresses inflammation and fibrosis of the heart during CKD.
  • GPR68 G protein-coupled receptor 68
  • GPR68 inhibitor antagonists have not yet been discovered and therefore have not been marketed as pharmaceuticals.
  • HTS High Throughput Screening
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition comprising at least one active ingredient selected from homoharintonin, halintonin, isoharintonin and deoxyhalintonin.
  • GPR68 G protein-coupled receptor 68
  • the pharmaceutical composition according to [1] or [2] for treating or preventing a fibrotic condition for treating or preventing a fibrotic condition.
  • [6] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [5], which is an intravenous injection or an oral preparation.
  • ⁇ Screening method> How to screen for substances that treat or prevent inflammatory and / or fibrotic conditions, including the following steps: (a) Step of adding a test substance to cells expressing GPR68, (b) Step of measuring GPR68-related signal of the cell, (c) The test substance treats or treats an inflammatory and / or fibrotic condition when the measurement is reduced compared to measuring the GPR68-related signal in the absence of the test substance. The process of determining that it is a substance to prevent. [11] Cells expressing GPR68 are isolated cells exhibiting an inflammatory and / or fibrotic state that are highly expressing GPR68 and are characterized by being CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c +. A method according to [10].
  • a method of detecting an inflammatory and / or fibrotic condition in a subject and / or determining the severity of the inflammatory and / or fibrotic condition in a subject (a10) A step of measuring the amount of cells (test biomarker amount) in the blood of a subject characterized by high expression of GPR68, CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c +. (b10) Compare the amount of test biomarker with the amount of cells in healthy subjects characterized by high expression of GPR68, CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c + (control biomarker amount).
  • Steps, and (c10) Detect an inflammatory and / or fibrotic state of a subject when the amount of test biomarker is greater than the amount of control biomarker, and / or inflammatory and / or in the subject.
  • CD11b + an early diagnostic biomarker for diseases in inflammatory and / or fibrotic conditions, such as heart, kidney and / or pulmonary fibrosis, preferably chronic kidney disease (CKD), with high expression of GPR68.
  • F4 / 80+ and Ly6c + a biomarker that is a cell.
  • the present invention relates to an extract that suppresses the function of GPR68 and a new use of homoharintonin contained therein.
  • Homoharintonin is already marketed overseas under the drug name omacetaxine mepesccinato as a leukemia treatment drug.
  • the concentration of homoharintonin, which has an anti-inflammatory and fibrosis-suppressing effect, found by the present invention is a low cytotoxic concentration, which is much lower than the dose used as a therapeutic agent for leukemia.
  • the present invention can provide a drug that is extremely excellent in terms of safety.
  • FIG. 1 shows the effect of GPR68 on NFAT expression in vivo and in vitro.
  • FIG. 1A Photographs of NFAT electrophoresis after injection of control (control) siRNA or GPR68 siRNA into 5 / 6Nx mice of sham surgery and CKD model mice, and a graph showing protein levels of NFAT after such treatment. Is. The data in the graph was normalized
  • FIG. 1C Graph showing luciferase activity in control :: Luc NIH3T3 cells or NFAT :: Luc NIH3T3 cells after transfection with GPR68 expression vector.
  • FIG. 2 shows the construction of an experimental system for evaluating NFAT transcriptional activity.
  • FIG. 3 shows the results of primary and secondary screening of medicinal plant extract libraries.
  • FIG. 3A FIG. 3A is a graph in which the relative luciferase activity 24 hours after treatment with 10 ⁇ g / mL of each extract of 8008 species was converted into a binary logarithm. The data normalized the values in the DMSO-exposed group by the values in the DMSO-exposed group as controls in the extract-exposed group. That is, the DMSO exposure group is 1. The value is shown as the average value of 3 experiments.
  • FIG. 3B is a graph showing the viable cell activity (relative ATP activity) in HEK293 cells 24 hours after treatment with 10 ⁇ g / mL of each of the 71 selected extracts.
  • FIG. 4 shows the results of counterscreening of the selected natural plant extracts.
  • FIG. 5 shows the in vitro effect of selected extract # 2 on endogenous gene expression.
  • FIG. 5B Electrophoretic photograph showing nuclear protein expression of NFAT in MDA-MB-231 cells 24 hours after exposure to extract # 2 (0.1 and 5 ⁇ g / ml), and intranuclear NFAT in the cells. It is a graph which shows the protein level.
  • FIG. 6B shows the effect of Extract # 2 on fibrosis in 5 / 6Nx mice. The fluorescence micrograph on the left panel shows the area of fibrosis (the Masson trichome stained area of tissue fibrosis is surrounded by a black line).
  • FIG. 6C shows the results of measuring the expression of nuclear NFAT and IL-6 mRNA in the mouse heart in sham surgery and 5 / 6Nx wild-type and extract # 2 treated 5 / 6Nx wild-type using Western blotting and real-time PCR. It is a graph.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of homoharintonin on NFAT :: Luc activity and cell viability in vitro.
  • FIG. 8A shows that in 5 / 6Nx mice, GPR68-expressing cells are macrophages differentiated from monocytes migrating from other than the heart. That is, it is the result of flow cytometry analysis showing that GPR68 cells expressed in the heart of 5/6 Nx mice are neutrophils and monocytes.
  • FIG. 8A-1 Dot plot in which the expression levels of CD11b and Ly-6C were further measured (right) for GPR68-positive cells (left) of the heart of sham.
  • FIG. 8A-2 A histogram showing the distinction between Ly6C high (top) and Ly6C low (bottom) by measuring the Ly-6C expression level in GPR68-positive cells of the heart of sham.
  • FIG. 8A-3 5 / 6Nx mouse heart GPR68-positive cells (left) were further measured for CD11b and Ly-6C expression levels (right).
  • FIG. 8A-4 A histogram showing the distinction between Ly6C high (top) and Ly6C low (bottom) by measuring the Ly-6C expression level in GPR68-positive cells of the heart of 5 / 6Nx mice. The numerical value indicates the ratio of the number of cells in the gray part (high GPR68 expression) when the cell population is 100.
  • FIG. 8B shows that GPR68 is increased at the genetic level in cells with high expression of CD11b and F4 / 80 and Ly6c in 5 / 6Nx mice.
  • FIG. 8B-1 Dot plot showing the results of further analysis of CD11b-positive cells in the heart of sham using Ly6C and F4 / 80-positive as indicators.
  • FIG. 8B-2 Dot plot showing the results of analysis of CD11b-positive cells in the heart of 5 / 6Nx mice, using Ly6C and F4 / 80-positive as indicators.
  • FIG. 8B-3 Graph showing that GPR68 mRNA expression level is increased in cells with high expression of F4 / 80 and Ly6c.
  • FIG. 8C shows that the expression level of GPR68 protein is increased in cells with high expression of CD11b and Ly6c in 5 / 6Nx mice.
  • FIG. 8C-1 Dot plot showing the results of analysis of CD11b and Ly6C positive cells in the blood at 4 and 8 weeks collected from sham and 5 / 6Nx mice.
  • FIG. 8C-2 Histogram and graph showing the results of analysis using an antibody against GPR68.
  • FIG. 9A shows that the increased GPR68-expressing cells in the blood of 5 / 6Nx mice are of spleen origin.
  • FIG. 9A-1 Dot plot showing CD11b and Ly6C expression levels in spleen, blood and bone marrow of sham and 5 / 6Nx mice.
  • FIG. 9A-2 Histogram comparing GPR68 expression levels of CD11b and Ly6c expressing cells between sham and 5 / 6Nx mice.
  • 9A-3 It is a graph which shows the result of quantifying the histogram of FIG. 9A-2.
  • FIG. 9B shows that the increased GPR68-expressing cells in the blood of 5 / 6Nx mice are of spleen origin.
  • FIG. 9B Graph showing the amount of GPR68 mRNA in cells with high expression of Ly6C and CD11b in spleen, blood and bone marrow of sham and 5 / 6Nx mice.
  • the present invention in one embodiment, is for treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition containing at least one such as homoharintonin, which is selected from among homoharintonin, harintonin, isoharintonin and deoxyharintonin.
  • a pharmaceutical composition containing at least one of a pharmaceutical composition, specifically, homoharintonin and the like as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be the pharmaceutical composition of the present invention, preferably in which the tissue is the heart, kidney or lung.
  • HHT homoharringtonine
  • omacetaxine mepesuccinate International Nonproprietary Name, omacetaxine mepesuccinate, Pubchem CID; 285033
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • It is a designated pharmaceutical compound. In November 2006, it was approved by the FDA as a CML treatment drug, and at the same time, it was designated as a fast track for CML treatment.
  • Omacetaxine mepesquinate is synthesized from cephalotaxine, an extract from the leaves of the plant Cephalotaxus species.
  • Harintonin (Harringtonine, Harringtonin, Pubchem CID; 276389) is formula (II): (II) It is a compound having a molecular weight of 531.602 g / mol indicated by.
  • Isoharintonin (PubChem CID: 73492) is expressed in Equation III: (III) It is a compound having a molecular weight of 531.602 g / mol indicated by.
  • Deoxyhalintonin (PubChem CID: 285342), Equation IV: (IV) It is a compound having a molecular weight of 515.603 g / mol indicated by.
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • inflammatory and / or fibrotic as pharmaceutical uses based on the activity of suppressing fibrosis.
  • active and pharmaceutical uses are the discovery of new uses for the active ingredient at least one selected from homoharintonin and the like, such as homoharintonin, halintonin, isoharintonin and deoxyharintonin.
  • GPR68 is a G protein-coupled receptor 68, which has been known as a Ca2 + signaling activating receptor (Ca2 + signaling activating receptor) that promotes the influx of Ca into cells (Wei WC, Huang WC, Lin YP, Becker EBE, Ansorge O, Flockerzi V, Conti D, Cenacchi G, Glitsch MD.Functional expression of calcium-permeable canonical transient receptor potent 4-containing channels.promotes migration 595 (16): 5525-5544.).
  • Ca2 + signaling activating receptor Ca2 + signaling activating receptor
  • NFAT Transcription factor
  • NFAT means activated T cell nuclear factor, which is produced by calcineurin, a Ca2 + -dependent protein kinase that controls the adaptive immune response, and translocates into the nucleus after dephosphorylation for gene transcription. It is one of the mediators (Kraner SD, Norris CM.Astrocyte Activation and the Calcineurin / NFAT Pathway in Cerebrovascular Disease. Front Aging Neurosci. 2018 Sep 21; 10: 287.).
  • GPR68 As for the relationship between “GPR68” and “NFAT”, it is known that activation of GPR68 increases the nuclear expression level of NFAT protein, and accompanying transcriptional activation of inflammation-related genes such as IL6 and TNF- ⁇ . (Rao A, Luo C, Hogan PG. Transcription factors of the NFAT family: regulation and function. Annu Rev Immunol. 1997; 15: 707-47.).
  • NFAT is known to control the transcription of IL-6 (Allen DL1, Uyenishi JJ, Cleary AS, Mehan RS, Lindsay SF, Reed JM. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.
  • Fibrosis is tissue rigidity accompanied by excessive deposition of fibrous proteins such as collagen, which is originally unnecessary, and infiltration and proliferation of fibroblasts as a result of inflammation and the like occurring in the tissue.
  • the "inflammatory and / or fibrotic state” means a state of inflammation and / or fibrosis accompanied by such fibrous protein deposition and tissue rigidity.
  • the fibrotic state progresses quietly in organs of various diseases, and if fibrosis continues, it destroys the structure of tissues, causing pulmonary fibrosis, liver fibrosis, fibrosis of kidney tissue, fibrosis of the heart, etc.
  • Fibrosis causes chronic inflammation due to chronic extrinsic / intrinsic stress stimulation, tissue remodeling occurs, and organ damage is accompanied by the onset and progression of organ fibrosis.
  • the fibrotic state includes a tissue fibrotic disease, specifically, fibrosis of visceral tissues such as lung, bladder, kidney, heart, and liver, and more specifically, administration of bleomycin. Pulmonary fibrosis caused by side effects and pulmonary fibrosis that occurs during or after interstitial pneumonia; bladder fibrosis and bladder neck sclerosis that occur during interstitial cystitis; renal fibrosis caused by genetic abnormalities, etc.
  • renal sclerosis endocardial fibrosis caused by remodeling after myocardial infarction
  • liver fibrosis caused by damage to hepatic cells, non-alcoholic steatosis (NASH), and associated hypertonic hypertension And liver cirrhosis
  • keroids caused by excessive tissue repair, sclerosing peritonitis, prostatic hypertrophy, sclerosis, uterine smooth myoma, retroperitoneal fibrosis, myeloid fibrosis and the like can be exemplified.
  • treatment means (1) delaying or preventing the onset of a disease or condition; (2) slowing or stopping the progression, exacerbation, or exacerbation of symptoms of the disease or condition; (3) disease or condition. It results in amelioration of the symptoms of; or (4) means a method or process aimed at curing a disease or condition. Treatment may be given as a prophylactic measure before the onset of the disease or condition, or treatment may be given after the onset of the disease.
  • prevention means preventing the development of an inflammatory and / or fibrotic state.
  • the pharmaceutical composition usually means a drug for treating, treating or preventing a disease or pathological condition, or for testing / diagnosis.
  • the "function inhibitory action of GPR68” means that it acts on GPR68-expressing cells mobilized and induced in the heart during CKD, inhibits the production of inflammatory cytokines and collagen, and directly or indirectly. As a result, it means the action of treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition.
  • the present invention provides, in one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention containing "a dose of active ingredient that does not exhibit cytotoxic activity, such as homoharintonin".
  • a dose of active ingredient that does not exhibit cytotoxic activity such as homoharintonin
  • the compositions containing homoharintonin of the present invention are administered in an effective amount, i.e., an amount sufficient to meet the intended purpose, but the exact amount of homoharintonin administered is treated between subjects. It will vary depending on the subject's age, gender, weight and overall health, desired biological or medical response, and the like.
  • homoharintonin is used as a therapeutic agent for chronic myelogenous leukemia (CML), and an effective amount expected to have cytotoxic activity against cancer cells is used.
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • the pharmaceutical composition of the present invention it is not necessary to use an amount of the active ingredient such as homoharintonin that exhibits its cytotoxic activity, and even a lower dose is inflammatory and / or the object of the present invention. It can act to treat or prevent fibrotic conditions.
  • Patent Document 5 which discloses the use of homoharintonin for the treatment of chronic myelogenous leukemia, related myeloproliferative disorders or Ph-positive acute lymphocytic leukemia, contains 0.25 to 5 mg of homoharintonin.
  • / m 2 dose preferably at a dose of 2.5 mg / m 2, preferably from 2 to 14 days per 28 day cycle, subcutaneous and / or intravenous and / or oral administration, has been described as. That is, when the body surface area and 1.6 m 2, of 0.25 ⁇ 5mg / m 2 dose means the dose of 0.4 ⁇ 8.0 mg.
  • the dosage of the drug marketed under the trade name Synribo is 3.5 mg / ml by subcutaneous injection.
  • the dose that does not show cytotoxic activity in the active ingredient such as homoharintonin in the present invention is roughly calculated.
  • the molecular weight of homoharintonin is 545.629 g / mol.
  • the concentration in the blood reaches 0.0691 ⁇ M (see Example 6) of the GPR68 50% function inhibition concentration (IC50).
  • the amount will be 2.891 ⁇ g / kg. Therefore, if the preferred effective dose is determined between 0.0691 of IC50 and 0.312 ⁇ M maximum dose, the dose will be 2.891 to 13.051 ⁇ g / kg, that is, 0.173 mg to 0.783 mg in terms of body weight of 60 kg, assuming direct exposure.
  • the dose of the active ingredient such as homoharintonin of the present invention can be set to 0.01 to 10.00 mg, preferably 0.01 to 7.00 mg, more preferably 0.01 to 5.00 mg, still more preferably 0.05 to 2.00 mg. mg.
  • the body surface area is about 1.7 m 2 , and thus the daily dose is preferably less than about 1.5 mg.
  • it can be set to 0.01 to 1.50 mg, preferably 0.01 to 1.40 mg, more preferably 0.01 to 1.30 mg, and even more preferably 0.01 to 1.00 mg.
  • the pharmaceutical composition containing homoharintonin or the like of the present invention as an active ingredient can exert its effect by oral administration (drinking water administration experiment of Example 5).
  • This is an embodiment of the present invention, which is possible because it can be used at a low dose that does not show cytotoxic activity, as compared with the special table 2005-508896 that uses homoharintonin for the treatment of chronic myelogenous leukemia and the like.
  • fibrosis was significantly suppressed in mice at oral doses of 5 and 10 mg / kg / day.
  • the dose of oral administration is 0.173 mg to 0.783 mg in terms of body weight of 60 kg.
  • the target of the active ingredient in the present invention is monocyte macrophages, and the tissue is blood or spleen.
  • the present invention provides, in one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention, which is an intravenous injection or an oral preparation.
  • the invention is in one embodiment a pharmaceutical composition in which the active ingredient is exposed to the spleen, preferably by a catheter, or by a monocyte macrophage target liposome preparation.
  • a pharmaceutical composition in which the active ingredient is exposed to blood or spleen is in one embodiment a pharmaceutical composition in which the active ingredient is exposed to blood or spleen.
  • the "catheter” is a thin tube used for endovascular treatment, which is a variety of procedures such as vasodilation that expands blood vessels that have become impaired due to arteriosclerosis and embolization that stops blood flow in the event of bleeding.
  • Endovascular treatment in cancer treatment includes intraarterial infusion therapy in which a drug such as an anticancer drug is injected from a blood vessel that feeds "cancer” and embolization that blocks the blood vessel.
  • a catheter that exposes the spleen is inserted into the splenic artery.
  • the monocyte macrophage-targeted liposome preparation means a preparation in which an active drug is encapsulated in extremely fine fat-like particles and is oriented toward monocyte macrophages. Liposomal preparations can reach the target monocyte macrophages with more drugs, have few side effects, and are expected to have good effects.
  • ligands for various surface marker molecules expressed on monocyte macrophages or antibodies targeting them are used.
  • CpG ODN which is a ligand for TLR-9 expressed in monocyte macrophages
  • haptoglobin which is a ligand for CD11c and CD11b
  • lipopolysaccharide which is a ligand for CD14
  • E-secretin which is a ligand for CD15
  • Antibodies targeting TLR-9, CD11c, CD11b, CD14 or CD15 are also modified into liposomes.
  • the inflammatory and / or fibrotic state is preferably a pharmaceutical composition not derived from angiogenesis of inflamed tissue.
  • GPR68 which the present invention focuses on, is an inflammation-related receptor that is involved in the mechanism of cardiac inflammation and fibrosis during CKD and promotes the production of inflammatory cytokines and collagen, and is not related to angiogenesis.
  • the "pharmaceutical composition” includes an effective amount of homoharintonin and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the term "effective amount” is a compound that is sufficient to meet its intended purpose, eg, a desired biological or pharmacological response in a cell, tissue, system, or subject, as described above. Or it means any amount of composition.
  • an object is to slow down, alleviate or stop the progression, exacerbation or exacerbation of an inflammatory and / or fibrotic condition, to result in amelioration of disease symptoms, and / or. It means treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier or excipient” refers to a carrier medium that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient and is not excessively toxic to the host at the concentration at which it is administered. ..
  • the term includes solvents, dispersion media, coating agents, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, and adsorption retarders. The use of such media and drugs for pharmaceutically active substances is well known in the art.
  • the present invention administers the homoharintonin-containing pharmaceutical composition of the present invention (also referred to as a homoharintonin-containing composition in the present specification) alone.
  • the homoharintonin-containing compositions of the invention are administered in combination with at least one additional therapeutic agent.
  • the homoharintonin-containing composition of the present invention can be administered before, simultaneously with, and / or after the therapeutic drug is administered.
  • Therapeutic agents that can be administered in combination with the homoharintonin-containing compositions of the invention are, for example, anti-inflammatory drugs, which include steroidal anti-inflammatory drugs, non-steroidal anti-inflammatory drugs, such as COX2 inhibitors, specifically.
  • the homoharintonins of the invention are optionally formulated with one or more suitable pharmaceutically acceptable carriers or excipients and by any suitable route to the subject in need of it at the desired dosage.
  • Various delivery systems are known and can be used to administer the homoharintonin of the invention, including, for example, tablets, capsules, injections, encapsulants in liposomes, powders, microcapsules and the like. ..
  • Methods of administration include transdermal, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intralesional, intravenous, subcutaneous, intranasal, lung, epidural, intraocular and oral routes. Administration can be systemic or topical.
  • the administration of the homoharintonin-containing composition of the present invention can be such that the delivered amount is effective for the intended purpose.
  • the route of administration, formulation, and dosage determine the desired therapeutic effect, the severity of the inflammatory and / or fibrotic condition being treated (if already present), the patient's age, gender, weight, and overall. It may depend on health status as well as the potency of the homoharintonin-containing composition used, bioavailability and in vivo half-life, use of combination therapy (or unused) and other clinical factors. These factors can be easily determined by the attending physician during the course of treatment.
  • the treatment of the present invention can consist of a single dose or multiple doses.
  • administration of the homoharintonin of the present invention, or a composition thereof is constant or regular over a specific period of time, and at specific intervals, for example, once every few hours, once a day, once a week, once a month. (Example, time release form).
  • delivery can be continuous delivery over a period of time, such as intravenous delivery, or oral administration.
  • the present invention in another aspect, is a method for treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition, wherein at least one active ingredient selected from homoharintonin, halintonin, isoharintonin and deoxyharintonin.
  • at least one active ingredient selected from homoharintonin, halintonin, isoharintonin and deoxyharintonin.
  • it is a method for treating or preventing the administration of an active amount of the active ingredient.
  • the present invention in another aspect, is a pharmaceutical composition comprising at least one active ingredient selected from homoharintonin, halintonin, isoharintonin and deoxyharintonin for treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition.
  • the present invention comprises at least one active ingredient selected from homoharintonin, harintonin, isoharintonin and deoxyharintonin for producing a medicament for treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition.
  • the invention provides a method of screening for a substance for preventing and / or treating an inflammatory and / or fibrotic condition.
  • the present invention comprises the following steps to screen for substances that treat or prevent inflammatory and / or fibrotic conditions: (a) Step of adding the test substance to cells expressing GPR68, (b) Step of measuring GPR68-related signal of the cell, (c) The test substance treats or treats an inflammatory and / or fibrotic condition when the measurement is reduced compared to measuring the GPR68-related signal in the absence of the test substance.
  • a process of determining that the substance is a preventive substance.
  • the "cells expressing GPR68” in the present invention are not particularly limited as long as they are cells expressing GPR68, and the reducing action of the signal in the test substance can be detected using the "GPR68-related signal” as an index. It may be any cell obtained from a living body.
  • Cells expressing GPR68 include cultured cell lines expressing GPR68 and cell lines subjected to genetic manipulation. Specific examples include macrophages, T cells, osteoblasts, brain cells such as nerve cells and astroglia cells, and MDA-MB-231 cells which are human mammary adenocarcinoma-derived cells.
  • the "cells expressing GPR68" are isolated cells exhibiting an inflammatory and / or fibrotic state that are highly expressing GPR68 and are CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c +. It is a cell characterized by.
  • CD11b is a marker for neutrophils and monocytes
  • F4 / 80 is a mature macrophage
  • Ly6c is a marker for M1 type macrophages (inflammatory cells infiltrating from outside the tissue) differentiated from monocytes.
  • one embodiment of the present invention is an isolated cell that is highly expressing GPR68 and is characterized by being CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c +, preferably GPR68.
  • An isolated cell that exhibits a highly expressed inflammatory and / or fibrotic condition or that results in a highly expressed GPR68 inflammatory and / or fibrotic condition, CD11b +, F4 /. Provides cells characterized by being 80+ and Ly6c +.
  • the present invention provides the cells of the present invention, which are specifically monocyte macrophage cells, and more specifically, the cells of the present invention, which are isolated monocyte macrophage cells derived from the spleen.
  • the "cells that are highly expressed in GPR68 and are characterized by being CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c +" described herein are substantially the same species. Refers to a cell population, preferably at least about 80%, more preferably at least about 100% of the cells in the population are of the same cell type. Preferred include eukaryotic-derived cultured cell lines and primary cultured cells, including mammals, such as human spleen-derived monocyte macrophage cells. "Highly expressing GPR68” means a cell in which GPR68-expressing cells normally express GPR68 relatively highly in a pathological condition.
  • CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c + means cells with relatively high expression of CD11b, Ly6c, F4 / 80.
  • the cell of the present invention is preferably a monocyte macrophage cell, more preferably an isolated monocyte macrophage cell derived from the spleen.
  • a typical method for preparing cells is, for example, first, cells derived from a tissue such as the heart or peripheral blood are dispersed into single cells, and cells expressing GPR68 are separated from the cells. Cells expressing GPR68 are screened using anti-GPR68 antibody. Then, cells having CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c + are isolated by flow cytometry or the like. The isolation is performed by using various antibodies.
  • isolated means a material that is substantially or essentially free of the components used to produce that material. The terms “isolated” and “pure” are used interchangeably.
  • the isolated cells of the invention preferably have a purity level expressed as a range.
  • the lower limit of the purity level is about 60%, about 70% or about 80%
  • the upper limit of the purity level is about 70%, about 80%, about 90% or more than about 90%.
  • the cells described herein are cells that are affected by exacerbation of inflammation as an extension of GPR68 function, followed by fibrosis, an inflammatory and / or fibrotic state. .. Such cells are thought to cause a fibrotic state of the heart, kidneys or lungs. He found that such cells were of spleen origin. Furthermore, we have found that 5 / 6Nx mice with spleen removed do not cause heart damage.
  • GPR68-related signal in the present invention refers to Ca influx into cells caused by activation of GPR68, NFAT gene expression level and transcriptional activity, NFAT protein expression level and nuclear translocation, and IL-6 gene expression level. And transcriptional activity, but is not limited to these.
  • candidate compound in the present invention refers to any natural or non-natural molecule, such as a biological polymer such as a nucleic acid, polypeptide or protein, an organic or inorganic molecule, or an organism to test for activity of interest. It means an extract prepared from a scientific material such as a cell or tissue of a bacterium, fungus, plant or animal (including especially mammals and humans). Not limited, but refers to natural and non-natural compound libraries, medicinal plant extracts, peptides, antibodies, nucleic acid libraries, etc. owned by universities, companies, etc.
  • the cells used in the screening method of the present invention can be prepared by a technique well known in the art, for example, cells can be obtained by collecting blood from a patient or a healthy person or by biopsy.
  • the cells used in the present invention can be cultured according to standard cell culture techniques. For example, cells are grown in a suitable container in an incubator containing a humidified 95% air-5% CO2 atmosphere in a sterile environment at 37 ° C. The container may contain agitated or standing medium. Various cell cultures may be used, including media containing unclear biofluids (eg fetal bovine serum) and fully established media, such as 293 SFM serum-free medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). ) including. Cell culture techniques are well known in the art and established protocols are available for culturing various cell types (eg, RI Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", See 2nd Edition, 1987, Alan R. Liss, Inc.).
  • media containing unclear biofluids eg fetal bovine serum
  • 293 SFM serum-free medium Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).
  • Cell culture techniques are well known in the art and established protocols are available for
  • the screening method of the present invention is performed using cells contained in multiple wells of a multi-well assay plate.
  • assay plates include, for example, Strategene Corp. (La Jolla, CA) and Corning Inc. (Acton, MA) commercial products, including, for example, 48-well, 96-well, 384-well, and 1536-well plates. ..
  • a candidate compound exerts a function of treating or preventing an inflammatory and / or fibrotic condition can be easily determined by those skilled in the art.
  • a GPCR ligand-binding assay system Fluorescent G protein-coupled receptors (GPCRs)
  • GPCRs fluorescent G protein-coupled receptors
  • Volume 8 No. 4 fluorescently labeled ligand for GPCR assay. It is possible to evaluate whether the candidate compound has the inhibitory / inhibitory function.
  • the screening method described in this specification can be a kit.
  • the biological cells disclosed herein can be packaged in various containers such as vials, tubes, microtiter well plates, bottles, and other reagents can be included in separate containers for kitting.
  • Another aspect of the invention is a method of detecting an inflammatory and / or fibrotic condition in a subject and / or determining the severity of the inflammatory and / or fibrotic condition in a subject.
  • Steps, and (c10) Detect an inflammatory and / or fibrotic state of a subject when the amount of test biomarker is greater than the amount of control biomarker, and / or inflammatory and / or in the subject.
  • a method for determining that a fibrotic condition becomes severe is provided.
  • the present invention in yet another aspect, is highly expressing GPR68, which can detect and / or determine the severity of inflammatory and / or fibrotic conditions, CD11b +, F4 /.
  • GPR68 which can detect and / or determine the severity of inflammatory and / or fibrotic conditions, CD11b +, F4 /.
  • biomarkers that are cells characterized by being 80+ and Ly6c +.
  • the present invention highly expresses GPR68 as a bimarker capable of detecting inflammatory and / or fibrotic conditions and / or determining severity, CD11b +, F4 / 80+ and Provided is the use of cells characterized by being Ly6c +.
  • GPR68 is a surface marker molecule for monocyte macrophages and that its increased chemotaxis promotes fibrosis, which is an inflammatory and / or fibrotic condition, especially fibrosis. It was found to be related to the disease.
  • a biomarker, and GPR68 if the severity of a subject can be determined in advance, it becomes possible to predict in advance a patient in which fibrosis becomes severe, which is beneficial for prevention of fibrosis. is there. From this finding, the biomarkers of the present invention can be early diagnostic biomarkers for cardiac, renal and / or pulmonary fibrosis, and thus early diagnostic biomarkers for chronic kidney disease (CKD).
  • CKD chronic kidney disease
  • the present invention is a method for early detection of fibrosis of the heart, kidney and / or lung, and chronic kidney disease (CKD), in which blood is collected from a subject and the cells of the present invention in the collected blood are used.
  • CKD chronic kidney disease
  • Provided is a method for determining that there is a suspicion of cardiac, renal and / or pulmonary fibrosis, or chronic kidney disease (CKD) when it is detected and compared with the cell volume of a healthy person and an increase of a certain amount is observed.
  • the cell of the present invention is an isolated cell that highly expresses GPR68 and is characterized by being CD11b +, F4 / 80+ and Ly6c +, preferably having a high GPR68.
  • the amount of GPR68 of monocyte macrophages can be measured by an immunological method if there is an antibody against GPR68. For example, it can be measured by an ELISA method well known to those skilled in the art.
  • the protein expression level can be measured by flow cytometry using an antibody against GPR68.
  • the detection of mRNA for GPR68 can be measured by real-time PCR.
  • Reference example 1 Preparation of Chronic Kidney Disease (CKD) Model Mouse
  • CKD Chronic Kidney Disease
  • CKD model mice were prepared by 5/6 nephrectomy (5/6 Nephrectomy; 5 / 6Nx). Two-thirds of the left kidney of anesthetized 7-week-old male ICR mice was removed, and one week later, the right kidney was completely removed.
  • the control group was a sham operation (Sham) group in which the kidney was confirmed and the wound was sutured without being exposed by the same operation. 5 / 6Nx mice and Sham mice were bred for 8 weeks after the operation under the above conditions and used in each experiment.
  • Example 1 Effect of GPR68 on NFAT Signal
  • HTS high-throughput screening
  • Example 1-1 In vivo test 5 / 6Nx mice were administered control (control) siRNA or siRNA against GPR68 (GPR68 siRNA), and expression of NFATc1 protein and IL-6 mRNA, one of the subtypes of NFAT, in both. The amounts were compared. Control siRNA and GPR68 siRNA were designed using BLOCK-iT TM RNAi Designer (http://rnadesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/).
  • Control siRNA Sense GAGAUUCUGUUAGUGCAAAGCACUU (SEQ ID NO: 1)
  • Antisense AAGUGCUUUGCACUAACAGAAUCUC (SEQ ID NO: 2)
  • GPR68 siRNA Sense GCAUCCUCCUCUAUGAGAACAUUUA (SEQ ID NO: 3)
  • Antisense UAAAUGUUCUCAUAGAGGAGGAUGC (SEQ ID NO: 4).
  • Quantitative real-time PCR reactions were analyzed by calibration curve using THUNDERBIRD TM SYBR qPCR Mix (Toyobo) and 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • the internal standard used was ⁇ -actin and 18S.
  • Table 1 shows the primer sequences used for the measurement of each target gene.
  • Protein quantification was performed by Western blotting. Specifically, LysoPure TM Nuclear and Cytoplasmic Extractor kit (Wako) was used to extract nuclear and cytoplasmic proteins from the heart of model mice. After extraction, the protein concentration was measured by a bicinchoninic acid (BCA) protein quantification assay and adjusted to a final concentration of 1-2 mg / mL.
  • BCA bicinchoninic acid
  • Each prepared sample is separated by SDS-polyacrylamide gel, transferred to PVDF membrane, and then anti-GPR68 antibody, anti-NFATc1 antibody, anti-TBP antibody (ab518141; Abcam, Cambridge, MA), anti-ACTIN antibody (sc-1616; It was reacted with Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), and then the complex of the target protein and the primary antibody was detected with a peroxidase-labeled secondary antibody.
  • Chemi-Lumi One Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan
  • ImmunoStar LD (Wako) were used to detect the band, and the images were taken with LAS-3000 (Fuji Film, Tokyo, Japan).
  • mice prepared in Reference Example 1 control siRNA or siRNA against GPR68 (GPR68 siRNA) was injected once a week at a dose of 40 ⁇ g 4 weeks after 5 / 6Nx surgery and administered at 4-week intervals. Continued to do. As a result, a significant increase in nuclear NFAT expression was observed in control siRNA-administered 5 / 6Nx mice compared with Sham mice, and this increase was not observed in GPR68 siRNA-administered 5 / 6Nx mice (Fig. 1A). ).
  • transcriptional activity by NFAT increases with the activation of GPR68 during CKD, and when the activation of GPR68 is suppressed, the transcriptional activity by NFAT is also suppressed, that is, the activation of GPR68. And transcriptional activation by the transcription factor NFAT are shown to correlate in vivo.
  • IL-6 interleukin 6
  • IL-6 a type of cytokine known to be transcriptionally activated by the transcription factor NFAT
  • IL-6 interleukin 6
  • Fig. 1B The IL-6 mRNA expression level in the 5 / 6Nx mouse heart, which was increased as compared with the sham mouse, was decreased in the 5 / 6Nx mouse administered with GPR68siRNA (Fig. 1B). From the above results, it was shown that GPR68siRNA administration reduced the expression level of nuclear NFAT protein in 5 / 6Nx mice, and accordingly, the expression level of IL-6 mRNA transcriptionally activated by NFAT also decreased.
  • IL-6 mRNA transcriptionally activated by NFAT also decreased.
  • Example 1-2 The expression level of the protein in the in vitro test cultured cells was carried out according to the description of Example 1-1.
  • NFAT is known to translocate into the nucleus upon activation of GPR68 and increase the expression of various inflammation-related genes via the NFAT response sequence (Rao A, et al. Annu Rev Immunol. 1997; 15: 707-47.). Therefore, a luciferase reporter plasmid containing the NFAT response sequence in the promoter was prepared, and the effect of GPR68 expression on the transcriptional activity of NFAT was investigated using this plasmid.
  • NFAT luciferase reporter plasmid
  • Luciferase Reporter Assay According to the recommended protocol with Lipofectamine-LTX Reagent (Invitrogen), 5% Fetal Bovine Serum (FBS; Moregate Biotech, Bulimba, Australia) and 0.5% 10,000 units / mL Penicillin G, 10,000 ⁇ g / mL Streptomycin Sulfate ( Mouse embryonic fibroblast-derived cells cultured in Dalveco-modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma aldrich, St. Louis, MO) containing Invitrogen, Grandisland, NY) under 37 ° C., 5% CO2 / 95% atmospheric conditions.
  • DMEM Dalveco-modified Eagle's Medium
  • a NIH3T3 cell (distributed from the Medical Cell Resources Center of the Institute of Aging Medicine, Tohoku University) was co-transfected with an intact vector (pcDNA3.1) or GPR68 expression vector and NFAT :: Luc vector.
  • phRL-TK vectors (Promega, Wisconsin, MN) were co-transfected to correct transfection efficiency. Twenty-four hours after transfection, cells were harvested using a Passive lysis buffer (Promega) and then the luciferase activity from each vector was measured using a luminometer according to the Dual-Luciferase reporter assay system (Promega) protocol.
  • Example 2 Preparation of NFAT :: Luc Stable Expression Strain From the results of Example 1, it was clarified that the function of GPR68 can be evaluated by NFAT-mediated luciferase activity. Therefore, in order to search for a novel compound that suppresses the function of GPR68 by HTS, a stable expression strain of NFAT :: Luc was prepared. First, in order to increase the selectivity of GPR68 during screening, cells with high GPR68 expression level were searched.
  • NFAT Luc stable expression cell line
  • NIH3T3 cells RIKEN
  • RAW264.7 cells ATCC
  • HEK293 cells HEK293 cells
  • the plasmid NFAT :: Luc in which the NFAT binding sequence is cloned into pGL4.18 [luc2P / Neo], is used in 5% fetal bovine serum (FBS; Moregate Biotech, Bulimba, Australia) and 0.5% 10,000 units / mL penicillin G. , 10,000 ⁇ g / mL Streptomycin Sulfate (Invitrogen, Grandisland, NY) in Dalveco Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma aldrich, St. Louis, MO) at 37 ° C., 5% CO2 / 95% atmospheric conditions , NIH3T3 cells, RAW264.7 cells, HEK293 cells or MDA-MB-231 cells.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM Dalveco Modified Eagle's Medium
  • MDA-MB-231 cells which are human breast cancer-derived cells, than in NIH3T3 cells, RAW264.7 cells, and HEK293 cells (Fig. 2A).
  • MDA-MB-231 cells were selected as candidate cells for the stable expression cell line of NFAT :: Luc, and NFAT :: Luc was introduced into MDA-MB-231 cells by the electroporation method and selected by G418 for 2 weeks. .. Five cell populations were obtained as the collected cells, and the culture was continued as A-E for each, and the luciferase activity was measured.
  • the cell line of D is named "MDA-MB-231 NFAT :: Luc cell”.
  • HTS experimental system using 384-well plate When performing large-scale compound screening in the search for hit compounds in drug discovery research , construct an experimental system that is simple, low-cost, highly reproducible, and has excellent high-throughput performance. Is essential.
  • the present inventors have succeeded in constructing an HTS experimental system based on the bioluminescence method satisfying this condition. Therefore, in the present invention as well, a screening experimental system based on the bioluminescence method was constructed.
  • MDA-MB-231 NFAT :: Luc cells were added to the 384-well plate at a ratio of 3000, 5000 cells / well.
  • the luciferase activity was measured after 48 hours.
  • the coefficient of variation (CV value), signal ratio (S / B ratio), and accuracy (Z'-factor) were calculated from the measured values.
  • a transcriptional repressor, actinomycin D (ActD) was used as a positive control. ActD 10 ⁇ M was exposed 24 hours after cell seeding, and luciferase activity was measured 24 hours later.
  • the S / B ratio was 2 or more, which was a sufficient value, but the CV value and Z'-factor did not meet the target values (Fig. 2C).
  • Example 3 Primary and secondary screening for medicinal plant extract libraries Exposure of extract solution and evaluation of luciferase activity in primary screening
  • a medicinal plant extract library (8008 types) owned by the National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition ) was subjected to primary screening.
  • the outline of the screening is as follows. A certain number of cells are seeded on a plate, cultured, and the plant extract is exposed and cultured therein. Reagents are added, and after constant treatment, luciferase activity is measured.
  • the NFAT :: Luc MDA-MB-231 cells prepared in Example 2 were seeded on a 384-well LIA white plate (Cat No.781080, Greiner) at 5000 cells / well.
  • a microplate dispenser Multidrop combi (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, MA) was used for cell seeding.
  • 40 ⁇ L of DMSO was dispensed into a 40 mg / mL (10 ⁇ L / well) extract stock solution solution dissolved in DMSO to prepare an 8 mg / mL extract stock solution plate.
  • DMEM Phenol Red Free, FBS (-), DMSO 1.28%) was dispensed into a new plate using MULTIDROP COMBI.
  • Biomek NXP there, 1 ⁇ L of 8 mg / mL extract was dispensed to prepare a plate for exposure (100 ⁇ g / mL). Biomek NXP was used for extract exposure, and the extract solution was added to the cell plate at 5 ⁇ L / well (final volume 50 ⁇ L, final extract concentration 10 ⁇ g / mL, final DMSO concentration 0.25%), and after 24 hours, the luciferase activity was increased. Measurements were made.
  • the ONE-Glo TM Luciferase Assay System (Promega) was used to evaluate the luciferase activity, and the ONE-Glo TM Luciferase Assay System reagent was added at 10 ⁇ L / well and then incubated at 37 ° C. for 10 minutes for measurement.
  • An EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, MA) was used to measure luciferase activity.
  • 71 kinds of extracts that reduce the luciferase activity to 1/2 or less as compared with the control group (DMSO exposed group) were identified (Fig. 3A). ).
  • HEK293 cells and MDA-MB-231 cells were evaluated using the intracellular ATP abundance as an index (FIGS. 3B and 3C).
  • MDA-MB-231 cells and HEK293 cells were seeded on a 96-well black plate (Cat No. 655086, Greiner), and after cell adhesion, 0.5 ⁇ L (final concentration) of 8 mg / mL extract / DMSO solution was applied. It was added at 10 ⁇ g / mL, DMSO 0.25%), and ATP activity was measured and performed 24 hours later.
  • the Cell Titer-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay Promega was used, and the chemiluminescence intensity was measured with the EnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer).
  • the EnSpire Multimode plate Reader Perkin Elmer
  • 6 types of extracts that did not significantly affect the viable cell activity of HEK293 cells were identified, and 5 types of extracts that had little effect on the viability of MDA-MB-231 cells, # 1, # 2, # 3, # 4 and # 6 were selected as candidate extracts.
  • Example 4 Screening by selectivity for GPR68 Preparation of GPR68 knockdown cells
  • MDA-MB-231 cells in which GPR68 was knocked down were generated using microRNAs (miRNAs) targeting GPR68 (Fig. 4A).
  • miRNAs were designed using BLOCK-iT TM RNAi Designer (http://rnadesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/) to knock down GPR68 in MDA-MB-231 cells.
  • Control miRNA (sense: GAGAUUCUGUUAGUGCAAAGCACUU (SEQ ID NO: 1); Antisense: AAGUGCUUUGCACUAACAGAAUCUC (SEQ ID NO: 2)) or GPR68 miRNA (sense: GCAUCCUCCUCUAUGAGAACAUUUA (SEQ ID NO: 3); Antisense: UAAAUGUUCUCAUAG MDA-MB-231 cells were transfected with (Invitrogen), exposed to the antibiotic Blasticidin S Sulfate (Wako) at a concentration of 10 ⁇ g / ml 24 hours later, and the gene was introduced by repeated medium exchange. A selection of the cells was performed.
  • GPR68 knockdown MDA-MB-231 cells (GPR68 KD MDA-MB-231 cells) were subjected to five candidate extracts # 1, # 2, and # 3 selected in Example 3. , # 4 and # 6 were exposed, and the effect of NFAT :: Luc on luciferase activity was investigated.
  • MDA-MB-231 cells were seeded in a 24-well plate at 1.0 x 105 cells / well / 500 ⁇ L, and the next day, the extract / DMSO solution was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL (DMSO 0.25%). , 24 hours later, the luciferase activity was measured.
  • Extract # 2 is a leaf of Cephalotaxus harringtonia (Knight ex Forbes) K.Koch var. Nana (Nakai) Rehder, Japanese family name: Cephalotaxaceae , Genus name: Cephalotaxus).
  • IC50 was calculated.
  • extract # 2 which was shown to act specifically on GPR68, the effects of the inflammatory cytokine IL-6 mRNA and NFAT on the nuclear protein expression level, whose expression level is increased by the activation of GPR68, were evaluated.
  • the MDA-MB-231 cell line was seeded on a 24-well plate and 24 hours later, extract # 2 was exposed at concentrations of 0.1, 1 and 5 ⁇ g / ml.
  • IL-6 mRNA expression level and NFAT nuclear protein expression level were measured in samples in which cells were collected 24 hours after exposure (FIGS. 5B and 5C). As a result, a decrease in IL-6 mRNA and NFAT nuclear protein expression levels was observed depending on the extract # 2 exposure concentration as compared with the DMSO-exposed group.
  • Example 5 Evaluation of efficacy of extract # 2 ( Cephalotaxus horizon ) for CKD model mice It was examined whether the extract # 2 identified in Example 4 inhibits the function of GPR68 even in vivo and exhibits anti-inflammatory and anti-fibrotic effects.
  • CKD model mouse a 5 / 6Nx nephrectomized mouse, which is a model mouse for progressive renal failure, was used.
  • Extract # 2 or DMSO was administered by drinking water (5, 10 mg / kg / day) from 2 to 6 weeks after the operation, and various organs were sampled after the administration was completed (8 weeks after the operation).
  • the degree of fibrosis of the mouse heart was histopathologically analyzed by Masson's trichrome (MT staining).
  • the sampled mouse heart was fixed overnight with 4% paraformaldehyde fixative (4% paraformaldehyde, 137 mmol / L NaCl, 8.1 mmol / L Na2HPO4, 2.68 mmol / L KCl, 1.47 mmol / L KH2PO4) and then placed in paraffin. It was embedded and MT-stained.
  • the imaging was performed using a fluorescence microscope (KEYENCE BZ-9000) at a magnification of 200 times, and a computer-assisted image analyzer (Keyence, Osaka, Japan) was used to quantify the fibrotic region stained with Masson trichome.
  • NFAT and IL-6 mRNA in the nucleus of mouse heart was measured by Western blotting and real-time PCR. Nuclear proteins and RNA were extracted from the sampled mouse heart and then measured using Western blotting and real-time PCR. As a result, increased expression of nuclear NFAT and IL-6 mRNA was observed in the heart of 5/6 Nx mice, but these increases were significantly suppressed by administration of extract # 2 (Fig. 6C).
  • Example 6 Specific extract # 2 of the main component homoharintonin from extract # 2 is a leaf of Cephalotaxus harringtonia (Knight ex Forbes) K.Koch var. Nana (Nakai) Rehder, Japanese family name: Cephalotaxus, genus name: Cephalotaxus ) Is an extract extracted from. It has been clarified that the components of extract # 2 are cephalotaxine as the main component and halintonin, deoxyhalintonin, isoharintonin and homoharintonin as subcomponents (Perard-Viret J1, Quteishat L2, Alsalim R2, Royer J1, Dumas F2., Chem Biol. 2017; 78: 205-352.
  • Homoharintonin (GPR68 50% function inhibition concentration) IC50 calculation Homoharintonin exposure and measurement of NFAT :: Luc activity Homoharintonin was exposed to NFAT :: Luc MDA-MB-231 cells and evaluated whether NFAT activity was suppressed.
  • the NFAT :: Luc MDA-MB-231 cells prepared in Example 2 were seeded on a 384-well white plate (Cat No.781080, Greiner) at 5000 cells / well, and 24 hours later, homoharintonin (0.0012, 0.0012, 0.0024, 0.0048, 0.009, 0.019, 0.039, 0.078, 0.165, 0.312 ⁇ M) and DMSO 0.25% were added, and luciferase activity was measured 24 hours later.
  • homoharintonin 0.0012, 0.0012, 0.0024, 0.0048, 0.009, 0.019, 0.039, 0.078, 0.165, 0.312 ⁇ M
  • DMSO 0.25% DMSO 0.25%
  • the ONE-Glo TM Luciferase Assay System (Promega) was used to evaluate the luciferase activity, and the ONE-Glo TM Luciferase Assay System reagent was added at 10 ⁇ L / well and then incubated at 37 ° C. for 10 minutes for measurement.
  • An EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, MA) was used to measure luciferase activity.
  • MDA-MB-231 cells were exposed to homoharintonin, and the effect of homoharintonin on cell survival was examined. Specifically, MDA-MB-231 cells were seeded at 5000 cells / well on a 384-well white plate (Cat No.781080, Greiner), and 24 hours later, homoharintonin (0.0012, 0.0024, 0.0048, 0.009, 0.019, 0.039, It was added at 0.078, 0.165, 0.312 ⁇ M) and DMSO 0.25%, and ATP activity was measured 24 hours later.
  • the Cell Titer-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay Promega was used for the ATP assay, and the chemiluminescence intensity was measured with the EnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer).
  • Example 7 Identification of GPR68 Highly Expressing Cells Chronic kidney disease (CKD) model mice, 5 / 6Nx mice and Sham mice prepared according to the description in Reference Example 1 were used.
  • CKD Chronic kidney disease
  • the heart was isolated from Sham and 5 / 6Nx mice 8 weeks after surgery, the tissue was cut with scissors with collagenase ( ⁇ 125 units / mg dry wt), allowed to stand at 37 ° C for 10 minutes, and then with scissors. After cutting, the tissue cutting solution was filtered through a 0.45 ⁇ m nylon mesh and dispersed in single cells.
  • the dispersed cells were reacted with a primary GPR68 antibody (Novus, NBP1-02402), stained with a secondary FITC-labeled antibody (Abcam, Goat Anti-Rabbit IgG H & L (FITC) (ab6717)), and then cell sorter (BD). , FACSAria TM III).
  • Various cells include neutrophil and monocyte markers: CD11b (BioLegend, model number: 101208), monocyte-differentiated M1 type macrophage markers (inflammatory cells infiltrating from outside tissues): Ly6c (BioLegend, model number: 101208). : 128016), mature macrophage marker: F4 / 80 (BioLegend, model number: 123108) was used as an index to analyze the cell distribution and recover the cells.
  • the dot plots were shown in the histograms of FIGS. 8A-2 and A-4. Dot plots and histograms show sham on the left and 5 / 6Nx mice on the right. Histograms of healthy sham (Fig. 8A-2) show both Ly6C high (M1 type macrophage marker: inflammatory cells infiltrating from outside the tissue) and Ly6C low (M2 type macrophage marker: inflammatory cells endogenous to the heart). It shows that the expression of GPR68 is observed to some extent. On the other hand, in the histogram of 5 / 6Nx mice (Fig.
  • GPR68-positive cells exist in both sham and 5 / 6Nx mice, but GPR68-positive cells in 5 / 6Nx mice infiltrate from outside the tissues with neutrophil and monocyte markers CD11b and M1 type macrophage markers.
  • Ly6c was highly expressed (Ly6C high). From this result, it was suggested that the GPR68 cells expressed in the heart at 5 / 6Nx are macrophages differentiated from monocytes migrating from other than the heart (Fig. 8A).
  • FIGS. 8B-1 and B-2 are the results of further analysis of cells expressing CD11b using the expression of the M1 type macrophage marker marker Ly6C and the mature macrophage marker F4 / 80 as indicators.
  • Cells were sorted by a cell sorting device (BD FACSAria TM III) using CD11b and F4 / 80 as indicators and Ly6C high expression (Ly6C high) or low expression (Ly6C low) as an index. After RNA was extracted from these cells, the GPR68 mRNA expression level was measured by real-time PCR.
  • GPR68 mRNA expression level was increased in cells with high expression of CD11b and F4 / 80 and Ly6c in 5 / 6Nx mice, demonstrating that GPR68 is increased at the gene level (Fig. 8B-). 3).
  • the GPR68-expressing cells in the heart at the time of CKD are not the M2 type macrophage markers that indicate Ly6Clow originally present in the heart, but the mature M1 type derived from monocytes that have migrated from outside the heart during the inflammation of the heart. It was revealed that it is a macrophage marker (cells with high expression of CD11b, Ly6c, F4 / 80).
  • the GPR68 protein expression level in cells with high expression of neutrophil and monocyte markers CD11b and Ly6c over the course of 5/6 nephrectomy (5 / 6Nx) was measured using GPR68 antibody.
  • GPR68 It was revealed that the protein expression level increased remarkably at the 8th week as compared with the 4th week after the operation.
  • the dot plot in FIG. 8C-1 shows the results of analysis of CD11b and Ly6C positive cells in the blood at Weeks 4 and 8 taken from sham and 5 / 6Nx mice. CD11b and Ly6C positive cells were found in the blood of sham and 5 / 6Nx mice at 4 and 8 weeks. Furthermore, as a result of analysis using an antibody that detects GPR68 (Fig.
  • monocyte macrophage cells infiltrated from the spleen outside the heart which show high GPR68 expression in the heart during chronic renal failure, are prominent from 8 weeks after surgery (chronic renal failure stage). It became clear that it would increase.

Abstract

慢性腎臓病に起因する心臓、腎臓または肺の炎症および/または線維症性状態を処置または予防する物質を提供する。　ホモハリントニン等を有効成分として含有する、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防するための医薬組成物に関する。

Description

線維化を抑制する医薬組成物
　本発明は線維化を抑制する医薬組成物、詳細にはGPR68 (OGR1) を標的とする慢性腎臓病誘発性の心筋炎心線維化抑制化合物およびそれを含有する医薬組成物に関する。
　慢性腎臓病 (CKD) は、腎臓の障害または糸球体濾過量の低下が3ヶ月以上続く病態を指し、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症などが含まれる。重篤化すると末期腎不全に至り、人工透析治療や腎臓移植が必要となる。現在、我が国におけるCKD患者数は1330万人、透析患者数は32万人と推計され、今後も患者数の増加が予想されている (非特許文献１)。CKDによる腎機能の低下は様々な合併症を引き起こし、中でも慢性心不全をはじめとする心血管疾患 (CVD) の発症リスクは非常に高く、CVDはCKD患者の死因の上位を占めている (非特許文献２)。また、心機能の低下は腎機能の低下を引き起こし、CVDとCKDは相互のリスク因子として影響を及ぼし合うことも報告されている (非特許文献３)。この心臓と腎臓の密接な関係は”心腎連関”と呼ばれ、CKD患者の治療におけるCVDの予防は、生命予後の改善につながる重要な事項の1つとして重要視されている。この”心腎連関”を担う経路として、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン (RAA) 系が一般的に知られており、CKD患者の治療にはこの系を標的とした、アンジオテンシン変換酵素阻害剤 (Angiotensin Converting Enzyme inhibitor; ACEi) や、アンジオテンシンII受容体阻害薬 (Angiotensin II Receptor Blocker; ARB) などのRAA系阻害薬が積極的に用いられている (非特許文献４)。しかし、これらのRAA系阻害薬による心血管疾患の予後改善効果は実証に至っておらず (非特許文献５、６、７)、CKDを合併する心不全の治療戦略は未だ確立されていないのが現状である。
　CKD時の慢性心不全の発症機構は、腎機能の低下により生じる心室の圧負荷の増大が心筋の炎症と線維化を引き起こし、心室の拡張機能が障害され心不全に至ると考えられている。これまでのところ、心不全における炎症と線維化を処置できる医薬、手段は限られている。
　多様な疾患を処置するため、古くから薬用植物または薬用植物由来エキスが種々利用されている。例えば、イヌガヤ科イヌガヤ属の植物であるチョウセンマキを有効成分として含有する抗炎症組成物、その組成物を含有する飲食品または医薬品が開示されている (特許文献１)。また、セファロタキサス・フォーチュネイ (Cephalotaxus fortunei)、C.オリべリ (C. oliveri) およびC.ハリントニア (C. harringtonia) などの皮、茎、葉および種から抽出されるアルカロイドであるセファロタキシンおよびセファロタキシン類似体を含む、血管形成疾患を治療または予防する組成物が開示されている (特許文献２、３、４)。特許文献２にはさらに、セファロタキシン類似体として、ハリントニン、イソハリントニン、ホモハリントニン、デオキシハリントニンなどが列挙されており、それらは血管形成疾患の治療または予防に使用される。ホモハリントニンは、慢性骨髄性白血病、関連の骨髄増殖性疾患またはＰｈ陽性急性リンパ性白血病の治療方法に使用されることが開示され (非特許文献５)、慢性骨髄性白血病の治療薬としてEMEAからオーファンドラッグの指定を受けた医薬品化合物である。
特開2009-173618号公報 特表2010-523723号公報 特表2005-537282号公報 特表2008-529667号公報 特表2005-508896号公報
日本腎臓学会編, エビデンスに基づくCKD診療ガイドライン2018, 東京医学社 わが国の慢性透析療法の現況. 日本透析医学会雑誌 45: 1-47, 2016 Liu M1, Li XC, Lu L, Cao Y, Sun RR, Chen S, Zhang PY. Cardiovascular disease and its relationship with chronic kidney disease. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014 Oct; 18(19):2918-26 日本腎臓学会誌, 2013 Anavekar NS et al., Relation between renal dysfunction and cardiovascular outcomes after myocardial infarction. N Engl J Med 351: 1285-1295, 2004 2004 Cleland JG et al., The perindopril in elderly people with chronic heart failure (PEP-CHF) study. Eur Heart J 27: 2338-2345, 2006 Massie BM et al., Irbesartan in patients with heart failure and preserved ejection fraction. N Engl J Med 359: 2456-2467, 2008
　上記の通り、CKDは合併症として慢性心不全をはじめとするCVDが高頻度で認められ、CVDはCKD患者の死因の上位を占める。しかし、既存の治療法では効果が不十分であり、心不全の予後改善効果が得られないことから、新たな治療法の開発が望まれている。この状況に鑑み、本発明は、CKD時の心臓の炎症および線維化を抑制する新たな心保護薬の発見を目的とする。
　本発明者らは、マウスを用いた基礎実験において、CKD時の心臓の炎症および線維化進展機構に炎症関連受容体であるGタンパク質共役受容体68 (GPR68) が関与することを見出している。CKDモデルマウスを用いた検討から、GPR68はCKD時に心臓に動員される細胞で発現が誘導され、炎症性サイトカインやコラーゲンなどの産生を促進し、また、GPR68ノックダウンにより心室における炎症の軽減および心筋線維化領域の減少が認められ、CKD時の心臓の炎症と線維化にGPR68が促進的に関与することを見出した。以上の結果より、GPR68の機能抑制によって、CKD時の心臓の炎症および線維化を抑制することが出来ると考えられた。しかし、未だGPR68の抑制物質アンタゴニストは発見されておらず、それ故に医薬品として上市もされていない。
　現在多くの製薬企業において、数万～数百万の化合物ライブラリーから目的の薬効を示す化合物を探索する手法 (High Throughput Screening :HTS) を用いた創薬研究では、使用される化学合成化合物ライブラリーにおける化学構造骨格のバリエーションに限界があることが指摘されている [Q et al., 2002; Li JW et al., 2009]。そこで、本発明では、CKD時の心臓の炎症・線維化を抑制する新たな治療薬を開発することを目的として、多様な構造を有する生理活性物質が含まれると期待される薬用植物エキスライブラリーを対象に、CKD時の心臓の炎症および線維化を抑制する新たな心保護薬の開発を目指し、GPR68の機能を抑制する化合物を探索・同定した。その結果、本発明者らは、GPR68の高精度かつ迅速に評価できる測定法を確立したうえで、薬用植物エキスライブラリーからGPR68の機能を抑制するエキスを同定し、次いでGPR68機能抑制を主として担う成分がそれに含まれるホモハリントニン等であることを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は、以下の態様を含む。
＜医薬組成物＞
［１］
　ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンの中から選ばれる少なくとも１つの有効成分を含有する、炎症性および／または線維症性状態を治療または予防するための医薬組成物。
［２］
　有効成分がGタンパク質共役受容体68 (GPR68) の機能阻害作用を有する、［１］記載の医薬組成物。
［３］
　線維症性状態を処置または予防するための、［１］または［２］記載の医薬組成物。
［４］
　心臓、腎臓または肺の線維症性状態を処置または予防するための、［３］記載の医薬組成物。
［５］
　細胞障害活性を示さない用量の有効成分を含有する、［１］から［４］のいずれか記載の医薬組成物。
［６］
　静脈注射剤または経口剤である、［１］から［５］のいずれか記載の医薬組成物。
［７］
　有効成分が脾臓に暴露される、［１］から［６］のいずれか記載の医薬組成物。
［８］
　有効成分が、カテーテルまたは単球マクロファージ標的リポソーム製剤により脾臓に暴露される、［７］記載の医薬組成物。
［９］
　炎症性および／または線維症性状態が、炎症組織の血管新生に由来しない、［１］から［８］のいずれか記載の医薬組成物。
＜スクリーニング方法＞
［１０］
　以下の工程を含む、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する物質をスクリーニングする方法：
 (ａ) GPR68を発現する細胞に被験物質を添加する工程、
 (ｂ) 前記細胞のGPR68関連シグナルを測定する工程、
 (ｃ) 前記測定値が、前記被験物質の非存在下で前記GPR68関連シグナルを測定した場合と比較し低下していた場合に、前記被験物質が炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する物質であると判断する工程。
［１１］
　GPR68を発現する細胞が、GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態を示す単離された細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞である、［１０］記載の方法。
＜バイオマーカー等＞
［１２］
　被験者において炎症性および／または線維症性状態を検出、および／または被験者における炎症性および／または線維症性状態の重篤度を判定する方法であって、
 (a10) 被検者の血中における、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の量 (被検バイオマーカー量) を測定する工程、
 (b10) 被検バイオマーカー量と、健常者における、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の量 (対照バイオマーカー量) とを比較する工程、および
 (c10) 被検バイオマーカー量が対照バイオマーカー量よりも多い場合に、被検者の、炎症性および／または線維症性状態を検出する、および／または被験者において炎症性および／または線維症性状態が重篤化すると判定する方法。
［１３］
　炎症性および／または線維症性状態を検出することができる、および／または被験者における炎症性および／または線維症性状態の重篤度を判定できる、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞であるバイオマーカー。
［１４］
　炎症性および／または線維症性状態における疾患、例えば心臓、腎臓および／または肺の線維症、好ましくは慢性腎臓病 (CKD) の早期診断バイオマーカーであって、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞であるバイオマーカー。
　本発明は、GPR68の機能を抑制するエキスおよびそれに含まれるホモハリントニンの新たな用途に関する。ホモハリントニンは、すでに海外では医薬品名オマセタキシンメペスクシナートで白血病治療薬として市販されている。本発明により見出された炎症および線維化抑制作用を示すホモハリントニンの濃度は細胞障害性が低い濃度であり、これは白血病治療薬として用いられる用量に比較して遥かに低い量である。本発明は、安全性の面において非常に優れた医薬品を提供し得る。
図１は、インビボおよびインビトロにおけるNFAT発現に対するGPR68の影響を示す図である。図１Ａ：sham手術およびCKDモデルマウスの5/6Nxマウスにコントロール (対照) siRNAまたはGPR68 siRNAを注射した際のNFATの電気泳動の写真、およびそのように処理した際のNFATのタンパク質レベルを示すグラフである。グラフのデータはTBP (tata結合タンパク質) の発現レベルによって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す (n=4)。sham手術群の値を1.0に設定している。** 2つの群間でP<0.01の有意差 (P<0.001; Tukey-Kramerの事後検定によるANOVA)。図１Ｂ：sham手術および5/6Nxマウスにコントロール (対照) またはGPR68 siRNAを注射した際の心臓のインターロイキン６ (IL-6) のmRNAレベルを示すグラフである。データは18sリボソームmRNAの発現レベルによって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す (n=4)。sham手術群の値を1.0に設定している。** 2つの群間でP<0.01の有意差 (P<0.001; Tukey-Kramerの事後検定によるANOVA)。図１Ｃ：GPR68発現ベクターでトランスフェクションした後のコントロール::Luc NIH3T3細胞またはNFAT::Luc NIH3T3細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。pcDNA3.1 (GPR68 0ng)の相対ルシフェラーゼ活性の値を1.0に設定している。** pcDNA3.1とのP<0.01の有意差 (F2,6 = 52.6361、P<0.001; Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。
図２は、NFAT転写活性を評価するための実験系の構築を示す。図２Ａ：NIH3T3およびMDA-MB-231ならびにRAW264.7およびHEK293細胞におけるGPR68のタンパク質発現を示す電気泳動の写真、およびそれら細胞におけるGPR68のタンパク質レベルを示すグラフである。グラフのデータは、βアクチンの発現レベルによって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。NIH3T3細胞中のGPR68のタンパク質レベルの値を1.0に設定している。図２Ｂ：MDA-MB-231細胞におけるNFAT::Lucベクターのトランスフェクションの2週間後の相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。カラムＡのルシフェラーゼ活性の値を1.0に設定している。図２Ｃ：アクチノマイシンD (ActD) による処理の24時間後の384ウエルプレート上でのNFAT::Luc MDA-MB-231およびそのZ因子の相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。DMSOの最終濃度は0.25％に調整した。値は平均値±標準偏差を示す(n=８０)。
図３は、薬用植物エキスライブラリーを対象とした一次および二次スクリーニングの結果を示す。図３Ａ：８００８種の各エキス10μg/mLで処理してから24時間後の相対ルシフェラーゼ活性を二値対数に変換したグラフである。データは、DMSO暴露群の値を、エキス暴露群の対照群としてDMSO暴露群の値によって正規化した。すなわち、DMSO暴露群を１としている。値は3回の実験の平均値として示す。図３Ｂ：選別された７１種の各エキス10μg/mLで処理して24時間後のHEK293細胞における生細胞活性 (相対ATP活性) を示すグラフである。データはDMSO対照群の値によって正規化した。値は3回の実験の平均値として示す。図３Ｃ：選別された６種の各エキス10μg/mLで処理して24時間後のMDA-MB-231細胞における生細胞活性 (相対ATP活性) を示すグラフである。データはDMSO対照群の値によって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。DMSO処置群の値は1.0に設定している。DMSO処置群と比較して*P<0.05 (F2,6=52.6361, P=0.014; Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。
図４は、選別された天然植物エキスのカウンタースクリーニングの結果を示す。図４Ａ：野生型 (コントロール) およびGPR68 ノックダウン (KD) MDA-MB-231細胞におけるGPR68のタンパク質発現を示す電気泳動の写真、およびその細胞におけるGPR68のタンパク質レベルを示すグラフである。グラフのデータは、βアクチンの発現レベルによって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。野生型細胞の値を1.0に設定している。** 2つの群間でP<0.01有意差 (t4 = 6.348、P = 0.003; 対応のないt検定)。図４Ｂ：野生型 (コントロール) およびGPR68 KD MDA-MB-231細胞における選別された５種の候補エキス (各10μg/ ml) の曝露24時間後の相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。DMSO処置群の値を1.0に設定している。** 2つの群間でP<0.01有意差 (＃2についてt4 = 12.573、P <0.001; ＃3についてt4 = 17.867、P <0.001; 対応のないt検定)。
図５は、内在性遺伝子発現に対する、選択したエキス#2のインビトロ効果を示す。図５Ａ：エキス#2の曝露24時間後のNFAT::Luc MDA-MB-231細胞およびコントロール::Luc MDA-MB-231細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフであり、これによりNFAT転写活性のIC50を算出した。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。DMSO処置群の値を1.0に設定している。図５Ｂ：エキス#2 (0.1、１および5μg/ ml) の曝露２４時間後のMDA-MB-231細胞中のNFATの核内タンパク質発現を示す電気泳動の写真、およびその細胞におけるNFATの核内タンパク質レベルを示すグラフである。グラフのデータは、TBP (tata結合タンパク質) の発現レベルによって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。DMSO処置群の値1.0に設定している。対照 (DMSO) 群と比較して**P<0.01 (F3,8=74.477, P<0.001；Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。図５Ｃ：エキス#2の暴露48時間後のMDA-MB-231細胞中のIL-6のmRNAレベルを示すグラフである。データは18Sの発現レベルによって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す(n=3)。DMSO処置群の値1.0に設定している。対照 (DMSO) 群と比較して**P<0.01 (F3,8=9.2678, P=0.009；Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。
図６Ａは、5/6Nx腎臓摘出マウスにおける血清尿素窒素に対するエキス#2の影響を示すグラフである。手術後４週間、5/6Nxマウスをエキス#2で処置した。値は平均値±標準偏差を示す (n=8-14)。対照 (DMSO) 群と比較して**P<0.01 (Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。 図６Ｂは、5/6Nxマウスにおける線維化に対するエキス#2の影響を示す。左パネルの蛍光顕微鏡写真は、線維化の領域を示す (組織線維化のマッソントリコーム染色部は黒線で囲っている)。右パネルは、sham手術および5/6Nx野生型およびエキス#2処置5/6Nx野生型からの組織におけるマッソントリコーム染色の、2回目の手術から8週間後の光学顕微鏡による定量的分析を示すグラフである。値は平均値±標準偏差を示す (n=4)。対照 (DMSO) 群と比較して**P<0.01 (Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。
図６Ｃは、sham手術および5/6Nx野生型およびエキス#2処置5/6Nx野生型におけるマウス心臓の核内NFATおよびIL-6mRNAの発現をウエスタンブロッティング法およびリアルタイムPCR法を用い測定した結果を示すグラフである。 図６Ｄは、5/6Nxマウスの体重に対するエキス#2の影響を示すグラフである。手術後４週間、5/6Nxマウスをエキス#2で処置した。値は平均値±標準偏差を示す (n=8-14)。対照 (DMSO) 群と比較して**P<0.01 (Tukey-Kramer’s Post-hoc検定によるANOVA)。
図７は、インビトロでのNFAT::Luc活性および細胞生存率に対するホモハリントニンの効果を示すグラフである。図７Ａ：ホモハリントニン曝露の24時間後のNFAT::Luc MDA-MB-231細胞におけるNFAT転写活性のIC50を示すグラフである。値は平均値±標準偏差を示す (n=3)。DMSO処置群の値を1.01に設定している。参考までに、セファロタキシン暴露のデータを示す。ホモハリントニン暴露と異なり、セファロタキシン暴露では、NFAT::Luc活性阻害効果を示していない。図７Ｂ：ホモハリントニン処理の24時間後のMDA-MB-231細胞の相対ATP活性を示すグラフである (0.0012、0.0024、0.0048、0.009、0.019、0.039、0.078、0.165、0.312μMの各濃度のハリントニンを細胞に暴露)。データはDMSO対照群の値によって正規化した。値は平均値±標準偏差を示す (n=3)。参考までに、セファロタキシン暴露のデータも示す。セファロタキシンおよびホモハリントニンともに細胞生存率に対する影響は低い。
図８Ａは、5/6NxマウスにおいてGPR68高発現細胞が心臓以外から遊走された単球から分化したマクロファージであることを示す。すなわち、5/6Nxマウスの心臓に発現するGPR68細胞は好中球や単球であることを示すフローサイトメトリー解析の結果である。図８Ａ－１：shamの心臓のGPR68陽性細胞 (左) に対してさらにCD11bおよびLy-6C発現量を測定 (右) したドットプロットである。図８Ａ－２：shamの心臓のGPR68陽性細胞においてLy-6C発現量を測定してLy6C high (上) およびLy6C low (下) の別を表したヒストグラムである。数値は、細胞集団を100とした時のグレーの部分に入る (GPR68発現が高い) 細胞の数の割合を示す。図８Ａ－３：5/6Nxマウスの心臓のGPR68陽性細胞 (左) に対してさらにCD11bおよびLy-6C発現量を測定 (右) したドットプロットである。図８Ａ－４：5/6Nxマウスの心臓のGPR68陽性細胞においてLy-6C発現量を測定してLy6C high (上) およびLy6C low (下) の別を表したヒストグラムである。数値は、細胞集団を100とした時のグレーの部分に入る (GPR68発現が高い) 細胞の数の割合を示す。
図８Ｂは、5/6NxマウスにおいてCD11bならびにF4/80およびLy6cの発現が高い細胞ではGPR68が遺伝子レベルで増加していることを示す。図８Ｂ－１：shamの心臓のCD11b陽性細胞を、さらにLy6CおよびF4/80陽性を指標に解析した結果を示すドットプロットである。図８Ｂ－２：5/6Nxマウスの心臓のCD11b陽性細胞を、さらにLy6CおよびF4/80陽性を指標に解析した結果を示すドットプロットである。図８Ｂ－３：F4/80およびLy6cの発現が高い細胞において、GPR68mRNA発現量が増加していることを示すグラフである。
図８Ｃは、5/6NxマウスにおいてCD11bおよびLy6cの発現が高い細胞ではGPR68タンパク質の発現量が増加していることを示す。図８Ｃ－１：shamおよび5/6Nxマウスから採取した4週目、8週目の血液中の、CD11bおよびLy6Cの陽性細胞を解析した結果を示すドットプロットである。図８Ｃ－２：GPR68に対する抗体を用いて解析した結果を示すヒストグラムおよびグラフである。
図９Ａは、5/6Nxマウスの血液中で増加するGPR68発現細胞が脾臓由来であることを示す。図９Ａ－１：shamおよび5/6Nxマウスの脾臓、血液、骨髄中の、CD11bおよびLy6C発現量を示すドットプロットである。図９Ａ－２：CD11bおよびLy6c発現細胞のGPR68発現量をshamおよび5/6Nxマウスで比較したヒストグラムである。図９Ａ－３：図９Ａ－２のヒストグラムを定量した結果を示すグラフである。 図９Ｂは、5/6Nxマウスの血液中で増加するGPR68発現細胞が脾臓由来であることを示す。図９Ｂ：shamおよび5/6Nxマウスの脾臓、血液、骨髄中のLy6CおよびCD11bの発現が高い細胞におけるGPR68 mRNA量を示すグラフである。
＜医薬組成物＞
　本発明は、ひとつの態様として、ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンの中から選ばれる、ホモハリントニン等の少なくとも１つを含有する、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防するための医薬組成物、具体的にはホモハリントニン等の少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、組織保護のため、好ましくは組織が心臓、腎臓または肺である本発明の医薬組成物とすることもできる。以下、具体的に説明する。
　本発明の有効成分であるホモハリントニン (homoharringtonine、略称: HHT) は、式I: 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　　　　　　　（Ｉ）
で示される分子量545.629 g/molの化合物である。ホモハリントニンは、オマセタキシンメペスクシナート (国際一般名、omacetaxine mepesuccinate、Pubchem CID; 285033) であり、これは、2005年10月、慢性骨髄性白血病 (CML) の治療薬としてEMEAからオーファンドラッグの指定を受けた医薬品化合物である。2006年11月、FDAからもCML治療薬として承認を取得し、同時にCML治療のためのファストトラック指定を受け、以来、欧米においてCML治療に広く適応されている。オマセタキシンメペスクシナートは、植物Cephalotaxus種の葉からのエキスであるセファロタキシンから合成される。参考文献：Lou YJ, Qian WB, Jin J: Homoharringtonine induces apoptosis and growth arrest in human myeloma cells. Leuk Lymphoma. 2007 Jul;48(7):1400-6. [PubMed:17613769]、およびJie H, Donghua H, Xingkui X, Liang G, Wenjun W, Xiaoyan H, Zhen C: Homoharringtonine-induced apoptosis of MDS cell line MUTZ-1 cells is mediated by the endoplasmic reticulum stress pathway. Leuk Lymphoma. 2007 May;48(5):964-77. [PubMed:17487741]。これら文献は、引用により本明細書に包含される。
　ハリントニンは (Harringtonine、Harringtonin、 Pubchem CID; 276389) は、式 (II) : 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　　　　　（ＩＩ）
で示される分子量531.602 g/molの化合物である。
　イソハリントニン (PubChem CID: 73492) は、式III: 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　　　　　（ＩＩＩ）
で示される分子量531.602 g/molの化合物である。デオキシハリントニンは (PubChem CID: 285342)、式IV: 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　　　　　（ＩＶ）
で示される分子量515.603 g/molの化合物である。
　上記の通り、ホモハリントニンの医薬用途としては慢性骨髄性白血病 (CML) の治療薬が開示されているのみであり、線維化を抑制する活性に基づく、医薬用途としての炎症性および／または線維症性状態を処置または予防については記載も示唆もない。これらの活性および医薬用途は、ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンなど、ホモハリントニン等の中から選ばれる少なくとも１つを有効成分について新規用途の発見である。
　ホモハリントニン等の有効成分の新規用途の発見に至る経緯は次の通りである。
　はじめに、GPR68の活性化により核内移行量が増加するNFATに着目し、NFATの転写活性によりGPR68の機能を簡便に評価できるルシフェラーゼ安定発現細胞を作製した。その細胞について薬用植物エキスライブラリー8008種を対象にハイスループットスクリーニングを行った結果、NFATの転写活性を抑制する71エキスを同定した。さらにその中から、細胞生存率に及ぼす影響およびGPR68に対する特異性について検討し、GPR68の機能を特異的に阻害するエキス#2 (ハイイヌガヤ) を同定した。そこでCKDモデルマウスを対象にエキス#2における心臓の炎症および線維化に及ぼす影響を検討した結果、DMSO投与群と比較し、エキス#2投与群で心臓の線維化が抑制された。また、エキス#2に含有している、市販されている医薬品の有効成分ホモハリントニンに着目し、NFAT転写活性を抑制するか否かを検討した。その結果、ホモハリントニンの暴露によりNFATの活性が抑制され、その一方で、細胞障害への影響は低いことが明らかになった。これにより、同定したエキス#2およびその成分のひとつであるホモハリントニンは、CKD時の心炎症・線維化を抑制する新たな治療薬開発のシーズとなり得ることが示唆された。詳細は、以下の参考例および実施例に記載する。
　本明細書において、「GPR68」はGタンパク質共役受容体68であり、これまで細胞内へのCa流入を促進させるCa2+シグナリング活性化受容体 (Ca2+ signaling activating receptor) として知られている (Wei WC, Huang WC, Lin YP, Becker EBE, Ansorge O, Flockerzi V, Conti D, Cenacchi G, Glitsch MD.Functional expression of calcium-permeable canonical transient receptor potential 4-containing channels promotes migration of medulloblastoma cells. J Physiol. 2017 Aug 15; 595(16):5525-5544.)。転写因子「NFAT」は活性化T細胞核因子を意味し、適応免疫応答の司令塔であるCa2+依存性タンパク質リン酸化酵素であるカルシニューリンによって生成される、脱リン酸化後に核内に移行して遺伝子転写を媒介する物質の一つである (Kraner SD, Norris CM.Astrocyte Activation and the Calcineurin/NFAT Pathway in Cerebrovascular Disease. Front Aging Neurosci. 2018 Sep 21;10:287.)。
　「GPR68」と「NFAT」の関連として、GPR68の活性化によりNFATタンパク質の核内発現量が増加し、それに伴って炎症関連遺伝子、例えばIL6、TNF-αの転写活性化が認められることが知られている (Rao A, Luo C, Hogan PG. Transcription factors of the NFAT family: regulation and function. Annu Rev Immunol. 1997;15:707-47.)。また、「NFAT」は、IL-6を転写制御することが知られている (Allen DL1, Uyenishi JJ, Cleary AS, Mehan RS, Lindsay SF, Reed JM. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2010 Jan;298(1):R198-210；Nilsson LM1, Sun ZW, Nilsson J, Nordstroem I, Chen YW, Molkentin JD, Wide-Swensson D, Hellstrand P, Lydrup ML, Gomez MF. Novel blocker of NFAT activation inhibits IL-6 production in human myometrial arteries and reduces vascular smooth muscle cell proliferation. Am J Physiol Cell Physiol. 2007 Mar; 292(3): C1167-78. Epub 2006 Nov 1.)。
　生体を構成する組織は、疾患に伴い、しばしば線維化という現象を引き起こす。線維化とは、組織で起こった炎症等の結果、本来不必要な過度のコラーゲン等の線維性タンパク質の沈着や、線維芽細胞の浸潤増殖を伴う組織の硬直化である。
　本発明において、「炎症性および／または線維症性状態」とは、このような線維性タンパク質の沈着や組織の硬直化を伴った炎症および／または線維化の状態を意味する。線維症性状態は色々な疾患の臓器で静かに進行し、線維化が続くと組織の構造を破壊し、肺線維症、肝線維症、腎臓組織の線維化、心臓の線維化などを引き起こし、臓器の機能低下を招く。線維化は慢性的な外因性・内因性ストレス刺激により慢性炎症が生じ、組織のリモデリングが起こり、臓器の線維化の発症・進展を伴って臓器障害に至る。本発明において、線維症性状態とは、組織線維化疾患を含み、具体的には肺、膀胱、腎臓、心臓、肝臓等の内臓組織の線維症が挙げられ、さらに具体的にはブレオマイシン投与の副作用で生じる肺の線維症や、間質性肺炎の際またはその後に生じる肺線維症；間質性膀胱炎の際に生じる膀胱の線維症や膀胱頚部硬化症；遺伝子異常等によって生じる腎線維症、および腎不全 (腎硬化症) ；心筋梗塞後のリモデリングによって生じる心内膜線維症；肝細胞の損傷によって生じる肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎 (NASH)、それに伴う門脈圧亢進症及び肝硬変；過剰な組織修復によって生じるケロイド、その他、硬化性腹膜炎、前立腺肥大症、強皮症、子宮平滑筋腫、後腹膜線維症、及び骨髄線維症等を例示することができる。
　本発明において、「処置」とは (１) 疾患または状態の発症を遅延または予防する； (２) 疾患または状態の症状の進行、増悪、または悪化を減速または停止させる； (３) 疾患または状態の症状の寛解をもたらす；あるいは (４) 疾患または状態を治癒させることを目的とする方法またはプロセスを意味する。処置は、予防的措置として疾患または状態の発症前に施してもよいし、あるいはまた、処置は、疾患の開始後に施してもよい。
　本発明において、「予防」とは、炎症性および／または線維症性状態の発症を予防することを意味する。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患または病態の処理、処置もしくは予防、または検査・診断のための薬剤を意味する。
　本発明において、「GPR68の機能阻害作用」とは、CKD時に心臓に動員・誘導されるGPR68発現細胞に働き、炎症性サイトカインやコラーゲンなどの産生を阻害し、直接的または間接的を問わず、結果として炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する作用を意味する。
　本発明は一つの実施態様において、「細胞障害活性を示さない用量の有効成分、例えばホモハリントニン」を含有する本発明の医薬組成物を提供する。一般に、本発明のホモハリントニンを含有する組成物は、有効量、即ち、意図する目的を満たすに十分な量で投与されるが、投与されるホモハリントニンの正確な量は、被験者間で、処置される被験者の年齢、性別、体重および全体的な健康状態、所望の生物学的または医学的応答などに応じて変動する。ホモハリントニンは上記の通り、慢性骨髄性白血病 (CML) の治療薬として使用され、がん細胞に対する細胞障害活性が期待される有効量が用いられている。他方、本発明の医薬組成物では、ホモハリントニン等の有効成分はその細胞障害活性を示す量を使用する必要は無く、それよりも低い用量であっても本発明が目的とする炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する作用を奏することができる。
　慢性骨髄性白血病、関連の骨髄増殖性疾患またはＰｈ陽性急性リンパ性白血病の治療にホモハリントニンを使用することを開示している特表2005-508896 (特許文献５) には、ホモハリントニンを、0.25～5mg／m２の用量で、好ましくは2.5 mg／m２の用量で、好ましくは２８日サイクル当たり2～14日間、皮下および／または静脈内および／または経口投与する、と記載されている。すなわち、体表面積を1.6m２とすると、0.25～5mg／m２の用量は、0.4～8.0 mgの投与量を意味する。なお、商品名Synriboとして市販されている医薬の用法用量は、皮下注射にて3.5 mg／mlである。
　これらを踏まえ、本発明におけるホモハリントニン等の有効成分における細胞障害活性を示さない用量を概算計算する。ホモハリントニンの分子量は545.629 g／molであり、例えばヒト体重60 kg、血液量4.6 Lとすると、血液中の濃度がGPR68 50％機能阻害濃度 (IC50) の0.0691μM (実施例６参照) に達する投与量は2.891μg／kgとなる。よって、IC50の0.0691から最大用量0.312μMの間を好ましい有効用量と決めると、投与量は直接暴露を前提とすると、2.891～13.051μg／kg、すなわち体重60 kg換算で0.173 mg～0.783 mgとなる。ただし、これは、一例としての具体的な用量である。本発明の一態様においては、本発明のホモハリントニン等の有効成分の投与量は、0.01～10.00 mgに設定でき、好ましくは0.01～7.00 mg、より好ましくは 0.01～5.00 mg、さらに好ましくは0.05～2.00 mgである。本発明の別の一態様においては、例えば、身長170cm、体重60kgのとき、約1.7 m2の体表面積となり、よって、1日の投与量は、約1.5 mgよりも低い用量が好ましい。具体的には、0.01～1.50 mgに設定でき、好ましくは0.01～1.40 mg、より好ましくは 0.01～1.30 mg、さらに好ましくは0.01～1.00 mgである。
　本発明のホモハリントニン等を有効成分とする医薬組成物は、経口投与によってその効果を発揮できることが見出されている (実施例５の飲水投与実験)。これは、慢性骨髄性白血病等の治療にホモハリントニンを使用する特表2005-508896と対比し、細胞障害活性を示さない低用量で使用できることから、可能となった利用態様であり、本発明の特徴である。具体的には、実施例５では、マウスにおいて5および10 mg/kg/dayの経口投与量で有意に線維化が抑制された。本発明は別の態様において、経口投与の投与量として、体重60 kg換算で0.173 mg～0.783 mg である。
　本発明者らは、鋭意研究を行い、CKD時にGPR68の発現が増加している単球マクロファージが脾臓由来であり、それが血液中に遊離し、心臓、腎臓および／または肺に至り、炎症性および／または線維症性等をもたらすことを見出した (実施例７)。従って、本発明における有効成分の標的は、単球マクロファージであり、組織としては、血液または脾臓である。標的細胞が単球マクロファージであることに基づき、本発明はひとつの態様として、静脈注射剤または経口剤である本発明の医薬組成物を提供する。また、標的組織が血液または脾臓であることに基づき、本発明はひとつの態様として、有効成分が脾臓に暴露される医薬組成物、好ましくはカテーテルを用いて、または単球マクロファージ標的リポソーム製剤により、有効成分が血液中または脾臓に暴露される医薬組成物を提供する。
　ここに、「カテーテル」とは、動脈硬化で流れが悪くなった血管を広げる血管拡張術や、出血などの際に血流を止める塞栓術など様々な手技である血管内治療に用いられる細い管である。がん治療における血管内治療には「がん」に栄養を送る血管から抗癌剤などの薬を注入する動注療法や、その血管を遮断する塞栓術がある。脾臓に暴露させるカテーテルは脾動脈に挿入する。
　単球マクロファージ標的リポソーム製剤とは、極めて微小な脂肪様粒子の中に活性型の薬物が封入されている製剤であって、単球マクロファージに指向するものを意味する。リポソーム製剤は、標的である単球マクロファージにより多くの薬物を到達させることが可能であり、副作用が少なく、効果が良好であると期待される。単球マクロファージに指向させるには、単球マクロファージに発現する各種表面マーカー分子に対するリガンドまたはそれらを標的とする抗体を利用する。リガンドとしては例えば、単球マクロファージに発現するTLR-9のリガンドであるCpG ODN、CD11cおよびCD11bのリガンドであるハプトグロビン、CD14のリガンドであるリポポリサッカライド、CD15のリガンドであるE-セクレチンなどをリポソームに修飾する。またTLR-9、CD11c、CD11b、CD14またはCD15を標的とする抗体をリポソームに修飾する。
　本発明において、炎症性および／または線維症性状態は、炎症組織の血管新生に由来しない医薬組成物が好ましい。本発明が着目するGPR68は、CKD時の心臓の炎症および線維化進展機構に関与し、炎症性サイトカインやコラーゲンなどの産生を促進する炎症関連受容体であり、血管新生は関連しない。
　本発明において、「医薬組成物」とは、有効量のホモハリントニン、および少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む。本明細書で使用する「有効量」なる用語は、上記の通り、その意図する目的、例えば、細胞、組織、系、または被験者における所望の生物学的または薬理応答を満たすために十分である化合物または組成物の任意の量を意味する。例えば、本発明の特定の実施態様において、目的は、炎症性および／または線維症性状態の進行、増悪または悪化を減速、軽減または停止させること、疾患の症状の寛解をもたらすこと、および／または炎症性および／または線維症性状態を処置または予防することを意味する。
　「薬学的に許容され得る担体または賦形剤」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、それが投与される濃度で宿主に対して過度の毒性がない担体媒質を指す。この用語は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸着遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒質および薬物の使用は、当技術分野において周知である。
　本発明は特定の態様において、本発明のホモハリントニンを含有する医薬組成物 (本明細書において、ホモハリントニン含有組成物とも称する) は単独で投与する。他の態様では、本発明のホモハリントニン含有組成物は、少なくとも１つの追加の治療用薬物と組み合わせて投与される。本発明のホモハリントニン含有組成物は、治療用薬物の投与前、治療用薬物と同時に、および／または治療用薬物の投与後に投与できる。本発明のホモハリントニン含有組成物との組み合わせで投与され得る治療用薬物は例えば、抗炎症薬であり、それにはステロイド系抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症薬、例えばCOX2阻害薬、具体的にはセレコシシブ、IL-6抗体、具体的にはトシリズマブ、ＴＮＦ抗体、具体的にはインフリキシマブ、およびその任意の組み合わせを挙げられる。
　本発明のホモハリントニンは、場合により１つまたはそれ以上の適切な薬学的に許容され得る担体または賦形剤と製剤化され、所望の投与量でそれを必要とする被験者に任意の適した経路により投与することができる。種々の送達システムが公知であり、本発明のホモハリントニンを投与するために使用することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、注射剤、リポソーム中のカプセル化剤、粉末剤、マイクロカプセル剤などを含む。投与の方法には経皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病巣内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺、硬膜外、眼内および経口経路を含む。投与は全身的または局所的であり得る。
　本発明のホモハリントニン含有組成物の投与は、送達される量が意図される目的のために効果的であるような投与量であり得る。投与経路、製剤化、および投与量は、所望の治療効果、治療される炎症性および／または線維症性状態の重症度 (既に存在する場合)、患者の年齢、性別、体重、および全体的な健康状態ならびに使用されるホモハリントニン含有組成物の効力、バイオアベイラビリティおよびインビボでの半減期、併用治療の使用 (または未使用) および他の臨床因子に依存し得る。これらの因子は、治療の経過において主治医により容易に決定可能である。
　本発明の処置は、単回用量または複数回用量からなり得る。このように、本発明のホモハリントニン、またはその組成物の投与は、特定の期間にわたり一定、または定期的、および特定の間隔、例えば数時間１回、１日１回、週１回、月１回 (例、時間放出形態) であり得る。あるいは、送達は、一定期間にわたる持続的送達、例えば静脈内送達、または経口投与があり得る。
　本発明は別の態様として、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防するための方法であって、ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンの中から選ばれる少なくとも１つの有効成分を、そのような処置または予防を必要としている患者に投与することを含む方法に関する。好ましくは、有効成分の有効量を投与する処置または予防するための方法である。
　さらに、本発明は別の態様として、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防するための、ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンの中から選ばれる少なくとも１つの有効成分を含む医薬組成物に関する。
　本発明はさらなる別の態様として、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する医薬を製造するための、ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンの中から選ばれる少なくとも１つの有効成分の使用に関する。
＜スクリーニング方法＞
　本発明は別の態様として、炎症性および／または線維症性状態を予防および／または処置するための物質をスクリーニングする方法を提供する。
　具体的には、本発明は、以下の工程を含む、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する物質をスクリーニングする方法：
 (a) GPR68を発現する細胞に被験物質を添加する工程、
 (b) 前記細胞のGPR68関連シグナルを測定する工程、
 (c) 前記測定値が、前記被験物質の非存在下で前記GPR68関連シグナルを測定した場合と比較し低下していた場合に、前記被験物質が炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する物質であると判断する工程、を提供する。以下、具体的に説明する。
　本発明における「GPR68を発現する細胞」とは、GPR68を発現する細胞ならば、特に限定されず、「GPR68関連シグナル」を指標として、被験物質における該シグナルの低下作用を検出することができる、生体から取得されるいかなる細胞でもよい。「GPR68を発現する細胞」には、GPR68を発現する培養細胞株や遺伝子操作を加えた細胞株が含まれる。具体的には、マクロファージ、T細胞、骨芽細胞、脳細胞、例えば神経細胞、アストログリア細胞など、ならびにヒト乳腺癌由来細胞であるMDA-MB-231細胞などが挙げられる。さらに好ましくは、「GPR68を発現する細胞」は、GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態を示す単離された細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞である。
　ここに、CD11bはそれぞれ、好中球および単球、F4/80は成熟マクロファージ、そしてLy6cは単球から分化したM1型マクロファージマーカー (組織外から浸潤してくる炎症性細胞) のマーカーである。これらのマーカーは、各種の細胞について細胞分布の解析や細胞の回収をセルソーターで解析する際に利用されている。それぞれの「＋」とは、これらのマーカーがある細胞において一定レベルで発現していることを意味し、一般には陽性と称される。
　上記に関連し、本発明はひとつの態様として、GPR68を高発現している、単離された細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞、好ましくはGPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態を示す、またはGPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態をもたらす、単離された細胞であって、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞を提供する。本発明は、具体的には単球マクロファージ細胞である本発明の細胞、さらに具体的には脾臓由来の単離された単球マクロファージ細胞である本発明の細胞を提供する。本明細書に記載している「GPR68を高発現している、単離された細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞」とは、実質的に同種の細胞集団を指し、好ましくは集団における細胞の少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約100％が同じ細胞型である。好ましくは、ヒト脾臓由来の単球マクロファージ細胞など、哺乳類動物を含む真核生物由来の培養細胞株および初代培養細胞が挙げられる。「GPR68を高発現している」とは、通常時にGPR68を発現する細胞が病態時においてGPR68を比較的高度に発現する状態になった細胞を意味する。「CD11b+、F4/80+かつLy6c+である」とは、CD11ｂ、Ly6c、F4/80の発現が比較的高い細胞を意味する。CKD時にGPR68の発現が増加している単球マクロファージが脾臓由来であり、それが血液中に遊離し、心臓、腎臓および／または肺に至り、炎症性および／または線維症性等をもたらすという本発明者らの知見から、「GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態を示す細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞」は、「GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態をもたらす細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞」を包含する。
　本発明の細胞は、好ましくは単球マクロファージ細胞であり、より好ましくは、脾臓由来の単離された単球マクロファージ細胞である。細胞を調製する典型的な手法は、例えば、まず、心臓等の組織由来の細胞、または末梢血から細胞をシングル細胞に分散させ、その中からGPR68を発現している細胞を分取する。GPR68を発現している細胞は、抗GPR68抗体を用いて選別する。次いで、フローサイトメトリー等により、CD11b+、F4/80+かつLy6c+である細胞を単離する。その単離は、各種抗体を用いることで行う。「単離された」なる用語は、その材料を生産するのに使用される成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を意味する。「単離された」および「純粋な」という用語は互換的に使用される。標準的には、本発明の単離された細胞は、好ましくは一つの範囲として表現される純度レベルを有する。本発明において、純度レベルの下限は約60％、約70％または約80％であり、純度レベルの上限は約70％、約80％、約90％または約90％超である。なお、本明細書に記載している細胞は、GPR68の機能の延長として炎症の増悪、その後の線維化である、炎症性および／または線維症性状態になるという影響を受けている細胞である。このような細胞が心臓、腎臓または肺の線維症性状態を引き起こしていると考えられる。そして、そのような細胞は脾臓由来であることを発見した。さらに、脾臓を摘出した5/6Nxマウスでは、心臓に障害が生じないことを見出している。このことは、腎不全時に脾臓を摘出することで、心機能の増悪が抑制され得ることを想起させる。また、脾臓からの単球マクロファージの放出を抑制する化合物は、腎不全時の心機能低下を抑制することができると考えられる。
　本発明における「GPR68関連シグナル」とは、GPR68の活性化により起こる細胞内へのCa流入、NFAT遺伝子の発現量や転写活性、NFATタンパク質の発現量や核内移行、IL-6遺伝子の発現量や転写活性を含むが、これらに限定されない。
　本発明における「候補化合物」なる用語は、任意の天然または非天然の分子、例えば核酸、ポリペプチドまたはタンパク質などの生物学的高分子、有機または無機分子、あるいは目的の活性についてテストするために生物学的材料、例えば細菌、真菌、植物または動物 (特に哺乳動物、ヒトを含む) の細胞または組織などから調製される抽出物などを意味する。限定はされないが、大学、企業等が有する天然、非天然化合物ライブラリー、薬用植物抽出液、ペプチド、抗体、核酸ライブラリーなどを指す。
　本発明のスクリーニング方法に使用される細胞は、上記の通り、当技術分野において周知の技術により調製、例えば細胞を患者または健常者からの採血によりまたは生検により得ることができる。
　本発明において使用される細胞は、標準的な細胞培養技術に従って培養できる。例えば、細胞を、適した容器中で、加湿95％空気－5％CO2雰囲気を含むインキュベータに入れて37℃の無菌環境において増殖させる。容器は撹拌または静置培地を含み得る。種々の細胞培養液を使用してもよく、不明確の生体液 (例えばウシ胎児血清など) を含む培地ならびに完全に確定されている培地、例えば293 SFM無血清培地 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) を含む。細胞培養技術は、当技術分野において周知であり、確立されたプロトコールを多様な細胞タイプの培養のために利用可能である (例えば、R.I. Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 2nd Edition, 1987, Alan R. Liss, Inc.を参照のこと)。
　特定の態様では、本発明のスクリーニング方法は、マルチウエルアッセイプレートの複数のウエルに含まれる細胞を使用して実施する。そのようなアッセイプレートは、例えば、Strategene Corp. (La Jolla, CA) およびCorning Inc. (Acton, MA) の市販品があり、例えば、48ウエル、96ウエル、384ウエル、および1536ウエルプレートを含む。
　候補化合物が炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する機能を発揮するか否かは当業者であれば、容易に決定することができる。具体的には、GPR68の発現を抑制・阻害する機能を、例えば、GPCRリガンド－バインディングアッセイシステム (Fluorescent G protein-coupled receptors (GPCRs) | Volume 8 No. 4) を用い、GPCRアッセイ用蛍光標識リガンドによって、候補化合物が当該抑制・阻害機能を有するかを評価することができる。
　本明細書に記載するスクリーニング方法は、キットにすることができる。例えば、本明細書で開示する生物学的細胞を、バイアル、チューブ、マイクロタイターウエルプレート、ボトルなどの種々の容器にパッケージングし、他の試薬を別の容器に含め、キットすることができる。ここには、ポジティブコントロール試料または化合物、ネガティブコントロール試料または化合物や、緩衝液、細胞培養液、特異的検出プローブなどを含め、それを総じてキットとすることができる。
＜バイオマーカー等＞
　本発明は別の態様として、被験者において炎症性および／または線維症性状態の検出、および／または被験者における炎症性および／または線維症性状態の重篤度を判定する方法であって、
 (a10) 被検者の血中における、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の量 (被検バイオマーカー量) を測定する工程、
 (b10) 被検バイオマーカー量と、健常者における、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の量 (対照バイオマーカー量) とを比較する工程、および
 (c10) 被検バイオマーカー量が対照バイオマーカー量よりも多い場合に、被検者の、炎症性および／または線維症性状態を検出する、および／または被験者において炎症性および／または線維症性状態が重篤化すると判定する方法、を提供する。
　これに関連し、本発明はさらに別の態様として、炎症性および／または線維症性状態の検出および／または重篤度を判定することができる、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞であるバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、炎症性および／または線維症性状態を検出する、および／または重篤度を判定することができるバイマーカーとしてのGPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の使用を提供する。
　本発明者らは、GPR68が単球マクロファージの表面マーカー分子であり、その走化性亢進に伴って線維化が促進することを初めて見出し、それ炎症性および／または線維症性状態、特に線維化疾患に関連していることを見出した。本発明の方法、バイオマーカーおよびGPR68の使用により、事前に、被験者の重症度が判定できれば、線維化疾患が重篤化する患者を予め予測することが可能となり、線維化疾患の予防にとって有益である。この知見から、本発明のバイオマーカーは、心臓、腎臓および／または肺の線維症の早期診断バイオマーカーに、ひいては慢性腎臓病 (CKD) の早期診断バイオマーカーになり得る。また、本発明は、心臓、腎臓および／または肺の線維症、ならびに慢性腎臓病 (CKD) の早期検出方法であって、被験者から血液を採取し、採取した血液中の、本発明の細胞を検出し、健常人の細胞量と比較し、一定量の増加が認められる場合、心臓、腎臓および／または肺の線維症、または慢性腎臓病 (CKD) の疑いがあると判定する方法を提供する。ここに、本発明の細胞とは、GPR68を高発現している、単離された細胞であって、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞、好ましくは、GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態を示す、または、GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態をもたらす、単離された細胞であって、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞である。
　単球マクロファージのGPR68量は、GPR68に対する抗体があれば、免疫学的手法により測定することができる。例えば、当業者に周知のELISA法によって測定することができる。また、タンパク質発現量は、GPR68に対する抗体を用い、フローサイトメトリーにより測定できる。GPR68に対するmRNAの検出を、リアルタイムPCRにより測定できる。
　以下、本発明を参考例および実施例により、詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでなく、単なる例示であることに留意すべきである。
参考例１
慢性腎臓病 (CKD) モデルマウスの作製
　九動株式会社 (佐賀, 日本) から購入した5週齢雄性ICRマウスを2週間飼育し、7週齢時にCKDモデルマウス作製を行った。マウスは自由摂食摂水、明暗周期 (明期7:00-19:00)、恒温 (温度24±1℃) 条件下で飼育した。すべての動物実験は九州大学大学院薬学研究院等における動物実験委員会による承認を受けた後、その指針に従って行った。
　CKDモデルマウスは5/6腎臓摘出 (5/6 Nephrectomy; 5/6Nx) により作製した。麻酔処置した7週齢雄性ICRマウスの左腎2/3を摘出し、その１週間後に右腎の全摘出を行った。同様の操作で、腎臓を確認し露出させずに傷口を縫合した偽手術 (Sham operation; Sham) 群を対照群とした。5/6NxマウスおよびShamマウスは上記の条件で術後8週間飼育し、各実験に用いた。
実施例１
NFATシグナルに及ぼすGPR68の影響
　GPR68機能抑制化合物のハイスループットスクリーニング (HTS) を行うには、GPR68の機能を簡便かつ安定的に評価できる実験系を構築することが求められる。Rao A, et al. Annu Rev Immunol. 1997;15:707-47.には、GPR68 (Gタンパク質共役受容体68、Ca2+ シグナリング活性化受容体) の活性化により転写因子である活性化T細胞核因子Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) タンパク質の核内発現量が増加し、それに伴って炎症関連遺伝子の転写活性化が認められることが記載されている。そこで、CKD時のGPR68活性化に伴うNFATタンパク質による転写活性化を応用し、HTS系に応用できるか否か検討した。
実施例１－１：インビボ試験
　5/6Nxマウスを対象にコントロール (対照) siRNAまたはGPR68に対するsiRNA (GPR68 siRNA)を投与し、両者におけるNFATのサブタイプの一つNFATc1タンパク質およびIL-6 mRNAの発現量を比較した。コントロールsiRNAおよびGPR68 siRNAは、BLOCK-iTTM RNAi Designer (http://rnadesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/) を用いてsiRNAを設計した。それぞれの配列は次の通りである：
コントロールsiRNA
センス:GAGAUUCUGUUAGUGCAAAGCACUU (配列番号１) 
アンチセンス:AAGUGCUUUGCACUAACAGAAUCUC (配列番号２)、
GPR68 siRNA
センス:GCAUCCUCCUCUAUGAGAACAUUUA (配列番号３) 
アンチセンス:UAAAUGUUCUCAUAGAGGAGGAUGC (配列番号４)。
　投与スケジュールは、週1回40μgの用量で5/6Nx手術の4週間後に注射し、4週間続けた。RNAの定量は定量的リアルタイムRT-PCR法により行った。具体的には、モデルマウスより心臓を摘出した後に総RNAを抽出した。RNA抽出にはRNAiso (Takara Bio Co., Ltd., Shiga, Japan) を用い、総RNAからcDNAへの逆転写はReverTra Ace qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japan) を用いて行った。定量的リアルタイムPCR反応はTHUNDERBIRDTM SYBR qPCR Mix (Toyobo) および7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用い、検量線法により解析した。内部標準はβ-アクチンおよび18Sを用いた。各標的遺伝子の測定に用いたプライマー配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　タンパク質の定量は、ウエスタンブロット法により行った。具体的には、モデルマウス心臓からの核および細胞質タンパク抽出は、LysoPureTM Nuclear and Cytoplasmic Extractor kit (Wako) を用いた。抽出後、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質定量アッセイによってタンパク濃度を測定し、終濃度が1-2 mg/mLになるよう調整した。調整した各サンプルはSDS-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、PVDF膜に転写後、抗GPR68抗体、抗NFATc1抗体、抗TBP抗体 (ab518141; Abcam, Cambridge, MA)、抗ACTIN抗体 (sc-1616; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) と反応させ、その後ペルオキシダーゼ標識された二次抗体にて、目的タンパク質と一次抗体との複合体の検出を行った。バンドの検出にはChemi-Lumi One (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan) およびImmunoStar LD (Wako) を使用し、LAS-3000 (Fuji Film, Tokyo, Japan) で撮影を行った。
結果
　参考例１にて作製した5/6Nxマウスを対象にコントロールsiRNAまたはGPR68に対するsiRNA (GPR68 siRNA)を、週1回40μgの用量で5/6Nx手術の4週間後に注射し、4週間隔週で投与し続けた。その結果、Shamマウスと比較し、コントロールsiRNA投与5/6Nxマウスにおいて核内NFAT発現量の有意な増加が認められ、また、この増加はGPR68siRNA投与5/6Nxマウスにおいては認められなかった(図１Ａ)。このことは、CKD時においてGPR68活性化に伴ってNFATによる転写活性も増大し、またGPR68活性化が抑制されると、同じくNFATによる転写活性も抑制されることを意味し、つまり、GPR68活性化と転写因子NFATによる転写活性化がインビボにおいて相関していることを示している。
　また、転写因子NFATにより転写活性化することが知られているサイトカインの一種インターロイキン６ (IL-6) (Allen DL1, et al. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2010 Jan; 298(1):R198-210.) のmRNA発現量を測定した結果、shamマウスと比較し増加した5/6Nxマウス心臓のIL-6 mRNA発現量は、GPR68siRNA投与5/6Nxマウスにおいて低下した (図１Ｂ)。以上の結果より、GPR68siRNA投与により、5/6Nxマウスの核内NFATタンパク質発現量が低下し、それに伴い、NFATにより転写活性化するIL-6 mRNA発現量もまた、低下することが示された。
実施例１－２：インビトロ試験
　培養細胞におけるタンパク質の発現量は、実施例１－１の記載に準じて行った。
　インビトロにおいてGPR68発現量の増加によりNFATによる転写活性の増加が認められるか否か検討した。NFATはGPR68が活性化することで核内に移行し、NFAT応答配列を介して様々な炎症関連遺伝子の発現を増加させることが知られている (Rao A, et al. Annu Rev Immunol. 1997;15:707-47.)。そこで、NFATの応答配列をプロモーターに含むルシフェラーゼレポータープラスミドを作製し、これを用いてNFATの転写活性に及ぼすGPR68の発現の影響について検討した。
ルシフェラーゼレポータープラスミド (NFAT::Luc) の作製
　NFAT結合配列の塩基配列情報 (Fernando Macian, Cristina Lopez-Rodriguez & Anjana Rao Partners in transcription: NFAT and AP-1 Oncogene ,volume 20, pages 2476-2489 (30 April 200)) をもとに、制限酵素認識部位 (Nhe l、Hind lll) をリンカーに含む一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。95℃・5分、20℃・20分でアニーリングし、二本鎖DNAとした。アニーリング産物をEZ-10 Spin カラムプラスミド DNA Minipreps キット (Bio Basic, Toronto, Ontario, Canada) を用いて濃縮精製後、そのアニーリング産物とpGL 4.18 [luc2P /Neo] ベクター (Promega, Madison, WI) を制限酵素Nhe I、Hind IIIを用いて処理した。これらを精製後、TaKaRa DNA Ligation kit LONG (TaKaRa Bio, Otsu, Japan) を用いて連結を行い、Competent high E.coli (JM109) (TOYOBO, Osaka, Japan) へ形質転換した。作製したルシフェラーゼベクターは「NFAT::Luc」と表記する。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　リポフェクタミン-LTX 試薬 (Invitrogen)を用いた推奨プロトコールに従い、5% ウシ胎児血清 (FBS; Moregate Biotech, Bulimba, Australia)および0.5% 10,000units/mLペニシリンG、10,000μg/mLストレプトマイシン硫酸塩(Invitrogen, Grandisland, NY) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; Sigma aldrich, St. Louis, MO) にて37℃、5% CO2 / 95%大気条件下で培養したマウス仔胎繊維芽細胞由来細胞であるNIH3T3細胞 (東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより分与) に、インタクトベクター (pcDNA3.1) またはGPR68発現ベクターおよびNFAT::Lucベクターを共トランスフェクトした。またトランスフェクション効率を補正するため、phRL-TK ベクター (Promega, Wisconsin, MN) を共トランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、Passive lysis buffer (Promega) を用いて細胞を採取したのち、Dual-Luciferase reporter assay system (Promega) のプロトコールに従って、ルミノメーターを用いて各ベクター由来のルシフェラーゼ活性を測定した。
結果
　GPR68発現ベクタートランスフェクト細胞は、インタクトベクタートランスフェクト細胞と比較し、ルシフェラーゼ活性の有意な上昇が認められ、この活性上昇はGPR68発現ベクターのトランスフェクト量依存的であった (図１Ｃ)。以上の結果および実施例１－１の結果を総合し、CKD時におけるGPR68の機能は、NFATによる転写活性により評価できることが明らかになった。
実施例２
NFAT::Luc安定発現株の作製
　実施例１の結果から、GPR68の機能は、NFATを介したルシフェラーゼ活性により評価できることが明らかになった。そこで、GPR68の機能を抑制する新規化合物をHTSで探索するために、NFAT::Luc安定発現株の作製を行った。まず、スクリーニング時のGPR68の選択性を上げるため、GPR68発現量の高い細胞を探索した。
NFAT::Luc安定発現細胞株の作製
　ここでは、NIH3T3細胞 (理研)、マウスマクロファージ由来細胞であるRAW264.7細胞 (ATCC)、ヒト胎児腎細胞であるHEK293細胞 (理研)、およびヒト乳腺癌由来細胞であるMDA-MB-231細胞におけるGPR68発現量を調べた。
　推奨プロトコールに従って、リポフェクタミン-LTX 試薬 (Invitrogen)を用いたリポフェクション法により、トランスフェクションを行った。詳細には、NFAT結合配列をpGL4.18 [luc2P/Neo] にクローニングしたプラスミドNFAT::Lucを、5% ウシ胎児血清 (FBS; Moregate Biotech, Bulimba, Australia)および0.5% 10,000units/mLペニシリンG、10,000μg/mLストレプトマイシン硫酸塩 (Invitrogen, Grandisland, NY) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; Sigma aldrich, St. Louis, MO) にて37℃、5% CO2 / 95%大気条件下で培養し、NIH3T3細胞、RAW264.7細胞、HEK293細胞またはMDA-MB-231細胞に導入した。トランスフェクションから24時間培養後、細胞が接着していることを確認し、G418硫酸塩 (Wako, Osaka, Japan) を4000 μg/mL の濃度で曝露し、培地交換を繰り返して遺伝子が導入された細胞のセレクションを行った。
　その結果、GPR68タンパク質発現量は、NIH3T3細胞、RAW264.7細胞、HEK293細胞と比較し、ヒト乳腺癌由来細胞であるMDA-MB-231細胞において顕著に高いことが明らかとなった (図２Ａ)。そこで、NFAT::Luc安定発現細胞株の候補細胞としてMDA-MB-231細胞を選別し、MDA-MB-231細胞にNFAT::Lucをエレクトロポレーション法で導入し、G418により2週間セレクションした。回収した細胞として5つの細胞集団が得られ、それぞれA-Eとして培養を続け、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、他の細胞株と比較しDの細胞株において高いルシフェラーゼ活性が認められた (図２Ｂ)。そこで、Dの細胞株を以降の実験に使用した。Dの細胞株を「MDA-MB-231 NFAT::Luc細胞」と命名する。
384ウエルプレートを用いたHTS実験系の構築
　創薬研究のヒット化合物探索において大規模な化合物スクリーニングを行う際、簡便かつ低コストで、再現性が高く、ハイスループット性に優れた実験系を構築することが必須となる。本発明者らは、この条件を満たすバイオルミネッセンス法を基盤とするHTS実験系の構築に成功している。そこで本発明でもバイオルミネッセンス法を基盤としたスクリーニング実験系の構築を行った。
　はじめに、384ウエルプレートに播種する細胞数およびプレート内のウエル間のルシフェラーゼ活性の安定性を評価するため、MDA-MB-231 NFAT::Luc細胞を3000、5000細胞/ウエルの割合で384ウエルプレートに播種し、48時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。また、測定値より変動係数 (CV値)、シグナル比 (S/B比)、精度 (Z’-因子) をそれぞれ算出した。この検討の際、ポジティブコントロールとして転写抑制薬であるアクチノマイシンD (ActD) を用いた。細胞播種後24時間後にActD 10 μMを曝露し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、3000細胞/ウエルの濃度では、S/B比2以上となり十分な値を得たが、CV値およびZ’-factorは目標値を満たさなかった (図２Ｃ)。一方、5000細胞/ウエルの濃度では、S/B比2以上、CV値10%以下、Z’-因子 0.5以上となり、HTSの安定性を示す各評価値を満たしたため、5000細胞/ウエルの濃度がHTSに適応可能なスクリーニング系であることが確認された (図２Ｃ)。
HTSにおけるアッセイ系の評価
　本研究で用いたHTS実験系評価の指標である変動係数 (CV値)、シグナル比 (S/B比)、精度 (Z’-因子) は次の通りである。
i) 変動係数CV値 < 10%
　　CV(%) = 標準偏差(SD)/平均(Mean)
ii) シグナル比S/B比 >2
　　S/B = Mean 100% 活性/ Mean 0% 活性
iii) Z’-因子 > 0.5
　 Z’-因子 = 1 - (3×SD 100% 活性 + 3×SD0 % 活性)/(Mean 100% 活性 - Mean 0% 活性)
・100% 活性 = その実験系において最も高いと予測される値 (DMSO群)
・0% 活性 = その実験系において最も低いと予測される値 (アクチノマイシンD群)
実施例３
薬用植物エキスライブラリーを対象とした一次および二次スクリーニング
一次スクリーニングにおけるエキス溶液の曝露およびルシフェラーゼ活性の評価
　実際にGPR68の機能を抑制する化合物を探索・同定するにあたり、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所所有の薬用植物エキスライブラリー(8008種類) を対象に一次スクリーニングを行った。スクリーニングの概略は、次の通りである。細胞をプレートに一定数播種し、培養し、そこに植物抽出エキスを暴露し、培養する。試薬を添加し、一定処理後、ルシフェラーゼ活性を測定する。
　詳細には、実施例２にて作製したNFAT::Luc MDA-MB-231細胞を5000細胞/ウエルで384ウエルLIAホワイトプレート (Cat No.781080, Greiner) に播種した。細胞播種にはマイクロプレートディスペンサーMultidrop combi (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, MA) を使用した。スクリーニングにおけるエキス曝露のため、DMSOに溶解した40 mg/mL (10 μL/well) のエキス原液プレートにDMSOを40 μL分注し、8 mg/mLのエキス原液プレートを作製した。新しいプレートにMULTIDROP COMBIを使用してDMEM (Phenol Red Free, FBS(-), DMSO 1.28%) を79 μL分注した。そこにBiomek NXPを使用して8 mg/mLのエキスを1 μL分注し、曝露用のプレート (100 μg/mL) を作製した。エキス曝露にはBiomek NXPを使用し、エキス溶液を5 μL/well (最終容量50 μL、エキス終濃度 10 μg/mL、DMSO最終濃度 0.25%) で細胞プレートに添加し、24時間後にルシフェラーゼ活性の測定を行った。ルシフェラーゼ活性の評価にはONE-GloTM Luciferase Assay System (Promega) を用い、ONE-GloTM Luciferase Assay System 試薬を10 μL/wellで添加後、37℃で10分間インキュベートして測定を行った。また、ルシフェラーゼ活性の測定にはEnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, MA) を使用した。
　エキス添加から24時間後にNFAT::Luc由来のルシフェラーゼ活性を測定した結果、対照群 (DMSO曝露群) と比較してルシフェラーゼ活性を1/2以下に低下させるエキスが71種類同定された (図３Ａ)。
二次スクリーニングにおけるエキス溶液の曝露および生細胞活性の測定
　MDA-MB-231細胞およびHEK293細胞を5000 細胞/ウエルで384 ウエルホワイトプレート (Cat No.781080, Greiner) に播種し、24時間後、一次スクリーニングによって絞り込まれた8 mg/mLエキス/DMSO溶液を0.5 μL (終濃度10 μg/mL, DMSO 0.25%) で添加し、さらに24時間後にATP活性を測定した。ATP アッセイには、Cell Titer-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) を用い、EnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer) で化学発光強度の測定を行った。
　次に、HEK293細胞およびMDA-MB-231細胞の生存率に及ぼすヒットエキスの影響について細胞内ATP存在量を指標に評価した (図３Ｂ、図３Ｃ)。生細胞活性の測定は、MDA-MB-231細胞およびHEK293細胞を96 ウエルブラックプレート (Cat No.655086, Greiner) に播種し、細胞接着後8 mg/mLエキス/DMSO溶液を0.5 μL (終濃度10 μg/mL, DMSO 0.25%) で添加し、24時間後にATP活性を測定し、行った。ATPアッセイには、Cell Titer-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) を用い、EnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer) で化学発光強度の測定を行った。その結果、HEK293細胞の生細胞活性に顕著に影響を及ぼさないエキスが6種同定され、さらにこれらのうちMDA-MB-231細胞の生存率に対して影響の乏しい5種のエキス、#1、#2、#3、#4および#6を候補エキスとして選択した。
実施例４
GPR68に対する選択性によるスクリーニング
GPR68ノックダウン細胞の作製
　実施例３にて同定した5種のエキスのGPR68選択性を確認するため、各種エキスによる転写活性抑制効果に及ぼすGPR68ノックダウンの影響について検討した。
　はじめに、GPR68を標的とするマイクロRNA (miRNA) を用いてGPR68をノックダウンしたMDA-MB-231細胞を作製した (図４Ａ)。詳細には、MDA-MB-231細胞におけるGPR68のノックダウンを行うため、BLOCK-iTTM RNAi Designer (http://rnadesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/) を用いてmiRNAを設計した。コントロールmiRNA (センス: GAGAUUCUGUUAGUGCAAAGCACUU (配列番号１) ；アンチセンス: AAGUGCUUUGCACUAACAGAAUCUC (配列番号２) ) またはGPR68 miRNA (センス: GCAUCCUCCUCUAUGAGAACAUUUA (配列番号３) ；アンチセンス: UAAAUGUUCUCAUAGAGGAGGAUGC (配列番号４) ) をそれぞれリポフェクタミン 2000 試薬 (Invitrogen) を用いてMDA-MB-231細胞にトランスフェクトし、24時間後に抗生物質ブラストサイジンS硫酸塩 (Wako) を10 μg/mlの濃度で曝露し、培地交換を繰り返して遺伝子が導入された細胞のセレクションを行った。
インビトロ細胞に対するエキス曝露実験
　次に、GPR68ノックダウンMDA-MB-231細胞 (GPR68 KD MDA-MB-231細胞) に、実施例３にて選択した5種の候補エキス#1、#2、#3、#4および#6を曝露し、NFAT::Lucのルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を検討した。詳細には、MDA-MB-231細胞を24 ウエルプレートに1.0×105 細胞/ウエル/500μLで播種し、翌日、エキス/DMSO溶液を最終濃度10μg/mL (DMSO 0.25%) となるように添加し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
　その結果、エキス#2を曝露した細胞ではDMSOと比較してNFAT::Luc活性が低下し、この低下作用はGPR68ノックダウンで改善することが判明した (図４Ｂ)。以上の結果から、エキス#2は、GPR68に対して特異性が高く、NFAT::Luc活性を低下させることが示された。
エキス#2のGPR68 50%機能阻害濃度 (IC50) の算出
　エキス#2は、ハイイヌガヤの葉 (学名：Cephalotaxus harringtonia (Knight ex Forbes) K.Koch var. nana (Nakai) Rehder、和科名：イヌガヤ科、属名：Cephalotaxus) から抽出したエキスである。エキス#2の薬効をより詳細に解析するため、IC50の算出を行った。詳細には、MDA-MB-231 NFAT::Luc細胞を96 ウエルプレートに播種し、エキス#2を最終濃度0.390625、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mlとなるように9段階に分けて曝露した(図５Ａ)。エキス#2の曝露後24時間目にルシフェラーゼ活性を測定し、Curve fittingを行ってIC50を算出した。その結果、エキス#2のIC50は1.32 μg/mlと算出された。また、NFAT応答配列を含まないコントロール::Lucベクターを導入して作製したMDA-MB-231 コントロール::Luc細胞について同様の検討を行ったところ、IC50は12.45 μg/mlと算出された。これらの結果より、エキス#2は1.32 μg/ml程度でNFATシグナルを特異的に抑制することが示された。
　GPR68に特異的に作用することが示されたエキス#2について、GPR68の活性化により発現量が増加する炎症性サイトカインIL-6 mRNA量およびNFATの核内タンパク質発現量に及ぼす影響を評価した。MDA-MB-231細胞株を24 ウエルプレートに播種し24時間後に、エキス#2を0.1、１および5μg/ mlの各濃度で曝露した。曝露後24時間目に細胞を回収したサンプルを対象にIL-6 mRNA発現量およびNFATの核内タンパク質発現量を測定した(図５Ｂ、図５Ｃ)。その結果、DMSO曝露群と比較し、エキス#2曝露濃度依存的にIL-6 mRNAおよびNFAT核内タンパク質発現量の低下が認められた。
実施例５
CKDモデルマウスに対するエキス#2 (ハイイヌガヤ) の薬効評価
　実施例４にて同定したエキス#2がインビボにおいてもGPR68の機能を阻害し、抗炎症作用および抗線維化作用を示すか否か検討した。CKDモデルマウスには、進行性腎不全モデルマウスである5/6Nx腎臓摘出マウスを用いた。エキス#2またはDMSOを術後2週目から6週間飲水投与 (5, 10 mg/kg/day) し、投与終了後 (術後8週目) に各種臓器をサンプリングした。
　まず、CKDモデルマウスの腎障害程度を、尿素キットLタイプワコーUN3 (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) を使用し、添付のプロトコールに従って、血清中尿素窒素量 (Serum urea nitrogen; SUN) を測定し評価した。結果、shamマウスと比較し5/6 Nxマウスにおいて有意なSUNの上昇が認められ、またこの上昇はエキス#2投与により変化しなかった (図６Ａ)。以上の結果より、エキス#2は腎保護作用を有さないことが明らかとなった。
　次に、マウス心臓の線維化の程度をマッソントリコーム染色 (Masson's trichrome、MT染色) によって病理組織学的に解析した。サンプリングしたマウス心臓を4%パラホルムアルデヒド固定液 (4% パラホルムアルデヒド、137 mmol/L NaCl、8.1 mmol/L Na2HPO4、2.68 mmol/L KCl、1.47 mmol/L KH2PO4) で一晩固定した後、パラフィンにて包埋し、MT染色を行った。撮影は蛍光顕微鏡 (KEYENCE BZ-9000) を用いて倍率200倍で行い、マッソントリコームで染色される線維化領域の定量化にはComputer-assisted image analyzer (Keyence, Osaka, Japan) を用いた。
　結果、Shamマウスと比較して5/6Nxマウスにおいて有意な線維化領域の増加が認められたが、この線維化部位の増加はエキス#2投与群で有意に抑制された (図６Ｂ)。以上の結果から、エキス#2はインビボにおいてもCKD時における心臓のGPR68を介した腎線維化を抑制することが示された。
　また、マウス心臓の核内NFATおよびIL-6mRNAの発現をウエスタンブロッティング法およびリアルタイムPCR法を用い測定した。サンプリングしたマウス心臓から核内タンパク質およびRNAを抽出後にウエスタンブロッティング法およびリアルタイムPCR法を用い測定した。結果、5/6 Nxマウスの心臓で核内NFATおよびIL-6 mRNAの発現増加が認められたが、これらの増加はエキス#2の投与によって有意に抑制された (図６Ｃ)。
　また、5/6Nxマウスの体重に対するエキス#2の影響を確認した。結果、shmaと比較し、5/6Nxマウスで認められる体重減少が、エキス#2の投与により有意に抑制された (図６Ｄ)。これは、一般にヒトにおいて腎障害時の体重減少が予後不良の要因の一つとなるところ、エキス#2投与により、sham手術群と同じレベルまで体重が回復、すなわち体重減少が抑制されたことから、エキス#2投与はCKDリスクを軽減し、予後の改善効果、健康維持を期待できることを示している。
実施例６
エキス#2からの主成分ホモハリントニンの特定
　エキス#2は、ハイイヌガヤの葉 (学名：Cephalotaxus harringtonia (Knight ex Forbes) K.Koch var. nana (Nakai) Rehder、和科名：イヌガヤ科、属名：Cephalotaxus) から抽出したエキスである。エキス#2の成分として、セファロタキシンが主成分、副成分としてハリントニン、デオキシハリントニン、イソハリントニンおよびホモハリントニンが含まれることが明らかとされている (Perard-Viret J1, Quteishat L2, Alsalim R2, Royer J1, Dumas F2., Chem Biol. 2017; 78:205-352. doi: 10.1016/bs.alkal.2017.07.001. Epub 2017 Aug 16. ;Takano I1, Yasuda I, Nishijima M, Yanagi Y, Takeya K, Itokawa H., Phytochemistry. 1997 Feb;44(4):735-8.)。
　以下の実施例では、純品が市販されているセファロタキシンおよびホモハリントニンを用い、それらのNFATによる転写活性に及ぼす影響を検証した。
セファロタキシン (Cephalotaxine) ：分子量 315.369 g/mol PubChem CID: 65305、製造元：Toronto Research Chemicals、Can no：C261050：式V
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  　　　（Ｖ）
ホモハリントニン (Harringtonine) ：分子量545.629 g/mol PubChem CID: 285033、製造元：Cayman Chemical、Can no：14631：式I
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　　　　　　（Ｉ）
ホモハリントニンの (GPR6850%機能阻害濃度) IC50の算出
ホモハリントニン曝露およびNFAT::Luc活性の測定
　ホモハリントニンをNFAT::Luc MDA-MB-231細胞に暴露し、NFAT活性が抑制されるか否かを、評価した。詳細には、実施例２で作製したNFAT::Luc MDA-MB-231細胞を5000 細胞/ウエルで384 ウエルホワイトプレート (Cat No.781080, Greiner) に播種し、24時間後、ホモハリントニン (0.0012、0.0024、0.0048、0.009、0.019、0.039、0.078、0.165、0.312 μM) およびDMSO 0.25% を添加し、さらに24時間後にルシフェラーゼ活性の測定を行った。ルシフェラーゼ活性の評価にはONE-GloTM Luciferase Assay System (Promega) を用い、ONE-GloTM Luciferase Assay System 試薬を10 μL/wellで添加後、37℃で10分間インキュベートして測定を行った。また、ルシフェラーゼ活性の測定にはEnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, MA) を使用した。
　その結果、ホモハリントニンの暴露により、NFATの転写活性が抑制されることが明らかとなった (図７Ａ)。IC50を算出した結果、0.0691 μMであった。主成分であるセファロタキシン暴露 (0.12、0.24、0.48、0.9、1.9、3.9、7.8、16.5、31.2 μM) のデータでは、ホモハリントニン暴露と異なり、セファロタキシン暴露では、NFAT::Luc活性阻害効果を示していない。これにより、エキス#2がNFATによる転写活性に影響した本体が、セファロタキシンでなく、ホモハリントニンであることが立証された。
ホモハリントニン曝露および生細胞活性の測定
　次に、MDA-MB-231細胞を対象に、ホモハリントニンを暴露し、細胞生存数に及ぼすホモハリントニンの影響を検討した。詳細には、MDA-MB-231細胞を5000 細胞/ウエルで384 ウエルホワイトプレート (Cat No.781080, Greiner) に播種し、24時間後、ホモハリントニン (0.0012、0.0024、0.0048、0.009、0.019、0.039、0.078、0.165、0.312 μM) およびDMSO 0.25% で添加し、さらに24時間後にATP活性を測定した。ATP アッセイにはCell Titer-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) を用い、EnSpire Multimode plate Reader (Perkin Elmer) で化学発光強度の測定を行った。
　結果、80％以上の細胞が生存していた。このことから、ホモハリントニンの毒性は低いと考えられた (図７Ｂ)。参考までに、主成分セファロタキシン暴露のデータも示す。セファロタキシンおよびホモハリントニンはともに細胞生存率に対する影響が低い。
実施例７
GPR68高発現細胞の同定
　参考例１の記載に従って作製した慢性腎臓病 (CKD) モデルマウス、5/6NxマウスおよびShamマウスを使用した。
　まず初めにCKD時に心臓で発現増加するGPR68が、如何なる種の細胞由来であるか解析した。手術後8週目のShamおよび5/6Nxマウスから心臓を単離し、コラゲナーゼ(≧125 units/mg dry wt)で組織をはさみで裁断し、37℃で10分間静置し、その後、さらにはさみで裁断して、0.45μmのナイロンメッシュに組織裁断液を濾過し、シングル細胞へ分散した。分散した細胞に対し、１次GPR68抗体 (Novus社、 NBP1-02402) を反応させ、2次FITC標識抗体 (Abcam, Goat Anti-Rabbit IgG H&L (FITC) (ab6717)) で染色後にセルソーター (BD社、FACSAriaTM III) で解析した。各種細胞は、好中球および単球マーカー：CD11b (BioLegend社、型番：101208)、単球から分化したM1型マクロファージマーカー (組織外から浸潤してくる炎症性細胞) ：Ly6c (BioLegend社、型番：128016)、成熟マクロファージマーカー：F4/80 (BioLegend社、型番：123108) を指標に細胞分布を解析および細胞の回収を行った。
　まず初めに、フローサイトメトリーにより、shamおよび5/6Nxマウス心臓中のGPR68陽性細胞を検出し、その後、その集団が好中球および単球マーカーCD11bを発現しているか否かを調べた。図８Ａ－１およびＡ－３にドットプロットを示し、GPR68陽性細胞を□で囲んでいる (Ａ－１左、GPR68(+))。□内の細胞をさらに、CD11bおよびLy6Cの発現が高いか(Ly6C high)、または低いか(Ly6C low)を解析した。CD11bの発現が高い細胞の中から、Ly6C high (M1型マクロファージマーカー：組織外から浸潤してくる炎症性細胞) またはLy6C low (M2型マクロファージマーカー：心臓内在性の炎症性細胞) の集団を選別し、そのドットプロットを図８Ａ－２およびＡ－４のヒストグラムに表記した。ドットプロットおよびヒストグラムは、左がsham、右が5/6Nxマウスを示す。健常なsham (図８Ａ－２) のヒストグラムは、Ly6C high (M1型マクロファージマーカー：組織外から浸潤してくる炎症性細胞) およびLy6C low (M2型マクロファージマーカー：心臓内在性の炎症性細胞)ともにGPR68の発現が一定程度認められることを示している。これに対し、5/6Nxマウスのヒストグラム (図８Ａ－４) では、shamの細胞分布から、グレーの部分にずれてくる集団、すなわち5/6Nxマウスの細胞集団は、shamの細胞集団と比較してGPR68の発現量が高い細胞であり、その数も増加していることを示している。すなわち、5/6Nxマウス (図８Ａ－４) では、Ly6C high (M1型マクロファージマーカー：組織外から浸潤してくる炎症性細胞) およびLy6C low (M2型マクロファージマーカー：心臓内在性の炎症性細胞) でもGPR68陽性細胞がSham (図８Ａ－２) と比較して増加していたが、その増加量は、Ly6c highで高値を示した。以上より、GPR68陽性細胞は、shamおよび5/6Nxマウス共に存在するが、5/6NxマウスにおけるGPR68陽性細胞は、好中球や単球のマーカーCD11bおよびM1型マクロファージマーカー (組織外から浸潤してくる炎症性細胞を示す) Ly6cが高発現していた (Ly6C high)。この結果より、5/6Nx時に心臓に発現するGPR68細胞は、心臓以外から遊走された単球から分化したマクロファージであることが示唆された (図８Ａ)。
　さらに上記結果を検証するために、好中球および単球マーカーCD11bと成熟マクロファージマーカーF4/80で心臓から分散した細胞を染色し、解析した。図８Ｂ－１およびＢ－２のドットプロットはCD11bを発現する細胞をさらにM1型マクロファージマーカーマーカーLy6Cおよび成熟マクロファージマーカーF4/80の発現を指標に解析した結果である。CD11bおよびF4/80を発現し、かつLy6Cの発現が高い (Ly6C high) または、発現が低い (Ly6C low) を指標に細胞を、細胞ソーティング機器 (BD FACSAriaTM III) で分取した。これら細胞からRNAを抽出後にGPR68mRNA発現量をリアルタイムPCR法により測定した。
　その結果、5/6NxマウスのCD11bならびにF4/80およびLy6cの発現が高い細胞において、GPR68mRNA 発現量が増加していたことから、GPR68は遺伝子レベルで増加することが明らかになった (図８Ｂ－３)。この結果からも、CKD時の心臓におけるGPR68発現細胞は、心臓に元来存在するLy6C lowを示すM2型マクロファージマーカーでなく、心臓の炎症時に心臓外から遊走されてきた単球由来の成熟M1型マクロファージマーカー (CD11ｂ、Ly6c、F4/80の発現が高い細胞) であることが明らかになった。
　さらに、5/6腎臓摘出 (5/6Nx) 手術後経週的に好中球および単球マーカーCD11bおよびLy6cの発現が高い細胞におけるGPR68タンパク質発現量を、GPR68抗体を用いて測定した結果、GPR68タンパク質発現量は手術後４週目と比較し、８週目において顕著に増加することが明らかになった。
　図８Ｃ－１のドットプロットは、shamおよび5/6Nxマウスから採取した4週目、8週目の血液中の、CD11bおよびLy6Cの陽性細胞を解析した結果を示す。shamおよび5/6Nxマウスの4週目、8週目の血液中には、CD11bおよびLy6Cの陽性細胞が認められた。さらに、GPR68を検出する抗体を用いて解析した結果 (図８Ｃ－２：ヒストグラムおよび棒グラフ)、shamと比較し、5/6Nxマウスの血液中では、4週目からCD11bおよびLy6CおよびGPR68陽性細胞が増加し、８週目では顕著に増加していた (図８Ｃ－２：棒グラフ)。
　さらに、5/6NxマウスにおけるGPR68発現細胞が、どの臓器由来であるか、検証した。Shamおよび5/6Nxマウスの脾臓、血液、骨髄を採取し、Ly6CおよびCD11bの発現が高い細胞を解析した (図９Ａ－１：ドットプロット)。さらに、これらLy6CおよびCD11bの発現が高い細胞に発現するGPR68を抗体により検出し、解析した結果 (図９Ａ－２およびＡ－３：ヒストグラムと棒グラフ)、脾臓と血液中に、Ly6CおよびCD11bならびにGPR68の発現が高い細胞が認められた。つまり、Shamおよび5/6Nxマウスともに、CD11bおよびLy6cの発現が高い細胞が発現しているが (図９Ａ－１のドットプロット)、図９Ａ－２のヒストグラムであらわされるように、脾臓、血液中で、shamと比較し、5/6NxマウスにおいてGPR68タンパク質の発現量が高値を示した。また、骨髄では、その発現に差は認められなかった。さらに、shamおよび5/6Nxマウスから採取した脾臓、血液、骨髄由来の細胞におけるCD11bおよびLy6c発現量が高い細胞のGPR68発現量を測定した結果、GPR68の発現が高値を示す細胞が、5/6Nxマウスの脾臓、血液に多く認められた。また上記、脾臓、血液、骨髄中のLy6CおよびCD11bの陽性細胞から、RNAを抽出して、GPR68 mRNAをリアルタイムPCRにより測定した結果、脾臓、血液中のLy6CおよびCD11bの発現が高い細胞において、GPR68 mRNA量が増加した (図９Ｂ)。
　以上の結果より、慢性腎不全時の心臓には、GPR68の発現が高値を示す、心臓外である脾臓から浸潤した単球マクロファージ細胞が、手術後8週目 (慢性腎不全期) から顕著に増加することが明らかになった。

Claims (14)

  1. 　ホモハリントニン、ハリントニン、イソハリントニンおよびデオキシハリントニンの中から選ばれる少なくとも１つの有効成分を含有する、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防するための医薬組成物。
  2. 　有効成分がGタンパク質共役受容体68 (GPR68) の機能阻害作用を有する、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　線維症性状態を処置または予防するための、請求項１または２記載の医薬組成物。
  4. 　心臓、腎臓または肺の線維症性状態を処置または予防するための、請求項３記載の医薬組成物。
  5. 　細胞障害活性を示さない用量の有効成分を含有する、請求項１から４のいずれか記載の医薬組成物。
  6. 　静脈注射剤または経口剤である、請求項１から５のいずれか記載の医薬組成物。
  7. 　有効成分が脾臓に暴露される、請求項１から６のいずれか記載の医薬組成物。
  8. 　有効成分が、カテーテルまたは単球マクロファージ標的リポソーム製剤により脾臓に暴露される、請求項７記載の医薬組成物。
  9. 　炎症性および／または線維症性状態が、炎症組織の血管新生に由来しない、請求項１から８のいずれか記載の医薬組成物。
  10. 　以下の工程を含む、炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する物質をスクリーニングする方法：
     (a) GPR68を発現する細胞に被験物質を添加する工程、
     (b) 前記細胞のGPR68関連シグナルを測定する工程、
     (c) 前記測定値が、前記被験物質の非存在下で前記GPR68関連シグナルを測定した場合と比較し低下していた場合に、前記被験物質が炎症性および／または線維症性状態を処置または予防する物質であると判断する工程。
  11. 　GPR68を発現する細胞が、GPR68を高発現している炎症性および／または線維症性状態を示す単離された細胞であってCD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞である、請求項１０記載の方法。
  12. 　被験者において炎症性および／または線維症性状態を検出、および／または被験者における炎症性および／または線維症性状態の重篤度を判定する方法であって、
     (a10) 被検者の血中における、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の量 (被検バイオマーカー量) を測定する工程、
     (b10) 被検バイオマーカー量と、健常者における、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞の量 (対照バイオマーカー量) とを比較する工程、および
     (c10) 被検バイオマーカー量が対照バイオマーカー量よりも多い場合に、被検者の、炎症性および／または線維症性状態を検出する、および／または被験者において炎症性および／または線維症性状態が重篤化すると判定する方法。
  13. 　炎症性および／または線維症性状態を検出することができる、および／または被験者における炎症性および／または線維症性状態の重篤度を判定できる、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞であるバイオマーカー。
  14. 　炎症性および／または線維症性状態における疾患、例えば心臓、腎臓および／または肺の線維症、好ましくは慢性腎臓病 (CKD) の早期診断バイオマーカーであって、GPR68を高発現している、CD11b+、F4/80+かつLy6c+であることを特徴とする細胞であるバイオマーカー。
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